大鼠肝细胞的分离及BRL细胞培养上清对原代肝细胞增殖的影响

法是在PCR- TRAP基础上的半定量检测方法,灵敏 度较高, 可精确反映端粒酶活性。如果在 PCR - TRAP 基础上结合 ELISA的方法检测端粒酶活性, 端 粒酶活性仍可作为特异的肿瘤标记物, 为临床诊断 提供较为可靠的。 有研究明 hTR 表达与细胞癌变过程中端粒 酶的激活具有同步性[ 10] , 作者用原位杂交方法检测 46例贲门癌、癌旁及 30例正常黏膜组织 hTR 的表 达,取得了同 TRAP- ELISA 法较一致的结果, 即癌 组织、癌旁及正常黏膜组织中的 hTR表达存在显著 性差异( P < 0. 01) ,且阳性表达率同端粒酶活性之 间有较明显的平行关系, 表明端粒酶激活与肿瘤的 恶性表型有关。作者还发现用原位杂交方法检测端 粒酶活性有其明显优点, 即利用石蜡组织就可进行 端粒酶表达检测,可克服 PCR- TRAP法需要新鲜组 织、操作复杂等缺点, 且能通过图像分析测定 hTR 阳性表达细胞面积, 不仅能进行半定量检测, 而且还 能将 hTR的表达同具体的形态学很好地结合起来, 进行综合分析研究。因此通过检测 hTR的表达可 预测端粒酶活性,进行肿瘤的早期诊断,并可用于病 理学回顾性研究。 参考文献 1 Gasser SM. A sense of the end. Science, 2000, 288 ( 5 470) : 1 377 2 Mu J, Wei LX. Telomere and telomerase in oncology. Cell Res , 2002, 12( 1) : 1 3 Takakura M , Kyo S, Kanaya T, et al. Expression of human telomerase subunits and correlation with telomerase activity in cervical cancer. Cancer Res, 1998, 58( 7) : 1 558 4 Kim NW, Piatyszek MA , Prowse KR, et al. Specific associa- tion of human telomerase activity with immortal cell and cancer. Science, 1994, 266( 5 193) : 2 011 5 Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer , 1997, 33( 5) : 787 6 刘虹,张伟铭, 蔡春友, 等. 人非小细胞肺癌组织中端粒 酶活性的检测与研究. 中华病理学杂志, 2000, 29( 2) : 89 7 张登学, 张翠萍,顾华丽, 等. 食管癌端粒酶活性的研究. 中华消化杂志, 1999, 19( 5) : 298 8 AldousWK, Grabill NK. A fluorescent method for detection of telomerase activity Kiagn Mol Pathol, 1997, 6( 2) : 102 9 Takubo K, Nakamura K, Izumiyama N, et al. T elomerase ac- tivity in esophageal carcinoma. J Surg Oncol, 1997, 66( 2) : 88 10 范昕,张波, 应建明,等. 端粒酶基因在人肿瘤组织中的表 达 . 中华病理学杂志, 2000, 29( 1) : 16 ( 2004- 01- 27 收稿 责任编辑姜春霞) 大鼠肝细胞的分离及 BRL细胞培养上清对原代肝细胞增殖的 影响 张 娓1) v 张东铭2) 张苏河2) 张钦宪1) 1)郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室 郑州 450052 2)郑州大学第二附属医院内分泌科 郑州 450003 v女, 46岁 ,大专,实验师,研究方向: 组织动力学 关键词 大鼠;肝细胞; 上清液;增殖 中图分类号 R329. 3 摘要 目的:研究大鼠肝细胞分离的方法及正常大鼠肝细胞来源的 BRL细胞培养上清对原代大鼠肝细胞贴壁 和增殖的影响。方法: 采用体外胶原酶 2 步灌注法分离大鼠肝细胞,台盼兰染色法计算细胞数及细胞活率。以四 甲基偶氮唑蓝(MTT )法检测不同浓度的 BRL细胞培养上清及含体积分数 15%胎牛血清的普通培养液对肝细胞贴 壁和增殖的影响。结果:平均每只大鼠可获 2 @ 108 个肝细胞, 平均活力 94. 3%。用普通培养液培养肝细胞,肝细胞 贴壁率低; BRL细胞培养上清能明显促进肝细胞的贴壁和生长, 且有量效关系( P < 0. 05)。结论: 用本法分离的大 鼠肝细胞有较高的获取率和活力, BRL 细胞培养上清能促进正常大鼠肝细胞的贴壁及增殖。 #1022# 郑州大学学报(医学版) 2004 年 11 月 第 39卷 第 6 期 Isolation of rat hepatocytes and effect of BRL cell culture supernatant on rat hepatocytes proliferation ZHANG Wei 1) , ZHANG Dongming 2 ) , ZHANG Suhe 2 ) , ZHANG Qinxian 1 ) 1 ) Department of Histology and Embryology , Zhengzhou University , Zhengzhou 450052 2 ) Department of Endocrinology , the Second Aff iliated Hospital , Zhengzhou University , Zhengzhou 450014 Key words rat; hepatocyte; supernatant; proliferation Abstract Aim: To study a simplified method to isolation of rat hepatocytes and to observe the stimulation effect of super- natant from BRL cell culture on rat hepatocytes proliferation. Methods: Rat hepatocytes were isolated by a single two- step perfu- sion method. The yield and viability were assessed by trypan blue exclusion. [ 3- ( 4, 5- dimethylthiazol- 2- yl) 2, 5- diphenyl tetrazolium bromide] (MTT ) was used to detect the effect of different supernatant concentration from BRL cell culture on the prolif- eration of rat hepatocytes.Results: The average yield of hepatocytes was 2 @ 108 cells, with an average viability of 94. 3% . The supernatant from BRL cell culture had strong biological activity to stimulate the proliferation of rat hepatocytes. And there was a close relationship between the different supernatant concentration from BRL cell culture and proliferation effect. Conclusion: The Rat hepatocytes isolated by the method mentioned above could have high yield and viability. Stimulation effect of the supernatant from BRL cell culture on the proliferation of rat hepatocytes might be attributed to some unknown factor( s) in the supernatant. 肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝 研究的基础,但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大, 分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大,方法复杂, 成本较高。作者采用改良的体外胶原酶 2步灌流法 分离肝细胞,以正常大鼠肝细胞来源的 BRL 细胞系 培养上清培养原代大鼠肝细胞, 旨在探索较为经济 可行的肝细胞分离及肝细胞原代培养方法。 1 材料与方法 1. 1 材料 ¹ 实验动物: Wistar大鼠 10只, 购自郑 州大学实验动物中心, 1月龄,体重 170~ 230 g。 º 细胞系:大鼠肝细胞来源的 BRL 细胞系购自中科院 上海生化细胞所。» 主要试剂: Ô型胶原酶、台盼蓝 为Sigma 产品, RPMI1640 培养基为 Gibco产品, 胎牛 血清购自天津TBD 生物技术公司。¼主要仪器设 备: CO2 细胞培养箱为德国 HERAEUS公司产品, 医 用超净工作台为苏州净化设备厂产品, 倒置显微镜 为重庆光学仪器厂产品, 其他培养器皿均购自北京 中山生物技术公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 普通培养液的制备: 将含体积分数为 10% 胎牛血清的 RPMI1640培养液以孔径 0. 22 Lm 的无 菌微孔滤膜过滤, 4 e 储存备用。 1. 2. 2 BRL 上清液的制备: 以普通培养液培养 BRL 细胞株,待细胞长至培养瓶底的 80%时换液, 继续 培养 24 h,将培养瓶内的上清液吸出, 以孔径 0. 22 Lm的无菌微孔滤膜过滤, 除去细菌及 BRL 细胞, 4 e 储存备用。 1. 2. 3 混合培养液的制备:将制备好的 BRL 上清液 与普通培养液分别按体积比 1: 1、1: 2和 1: 4混合,并 分别记为混合培养液 a、b和 c, 4 e 储存备用。 1. 2. 4 大鼠肝细胞的分离: 按照 Seglen法[ 1]并略加 改进。Wistar大鼠于术前 24 h禁食水, 以 15 g/ L 的 戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉( 50 mg/ kg) , 尾静脉 注射肝素1 000U,仰卧位固定, 腹部备皮消毒, 在超 净台内打开腹腔, 游离门静脉,门静脉内插入软硅胶 管并固定。以 37 e 预热的灌流液快速灌流, 灌速 30~ 40 ml#min- 1, 同时剪断下腔静脉, 约 10 min后 可见肝脏变成灰白色。离断肝周血管韧带,仅保留 门静脉, 将肝脏移入无菌平皿中, 以 37 e 的0. 5 g/ L 的Ô型胶原酶 Hanks溶液灌注, 灌速 5 ml#min- 1,约 20min。可回收平皿内的胶原酶液, 循环灌注。撕 下肝包膜, 将肝细胞刷入预冷的 Hanks 液中, 200目 滤网过滤,制成粗制肝细胞悬液, 1 500 r/ min 离心 3 min,以预冷的 Hanks 液漂洗, 共 3次。以不同的混 合培养液或普通培养液重悬肝细胞, 台盼兰排斥法 检测肝细胞活力。以每孔 1 @ 104 个肝细胞的密度 接种入 24孔培养板, 于 37 e 、体积分数 5% CO2 培 养箱内培养。 1. 2. 5 MTT 法观察不同培养液对大鼠肝细胞贴壁 及增殖的影响:新分离的肝细胞按孵育培养液的不 同分为对照组(以普通培养液培养) , A0组(以 BRL #1023#Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences) Dec. 2004 Vol. 39 No . 6 上清液培养) , A组(以混合培养液 a 培养) , B组(以 混合培养液 b 培养) , C 组(以混合培养液 c 培养) , 于37 e 、体积分数5% CO2 培养箱内培养72 h后, 按 Mosmann [ 2]的方法分别测定各组在 570 nm 波长的吸 光度,各组均重复 8次。 1. 3 统计学处理 应用方差分析对各组的吸光度 值进行统计学分析, 检验水准取A= 0. 05。 2 结果 2. 1 大鼠肝细胞产率及活率 应用改良的 Seglen 2 步灌流法分离肝细胞, 平均每只大鼠可获得 2 @ 108 个肝细胞,平均活率为 94. 3%。 2. 2 原代培养的大鼠肝细胞形态 倒置显微镜下, 新分离的大鼠肝细胞折光性强, 有立体感。肝细胞 以BRL 上清或混合培养液重悬, 接种于培养液瓶 内, 36 h后首次观察可见肝细胞贴壁, 胞体变平、变 薄, 体积明显增大。倾去培养液, 换用普通培养液, 继续于37 e 、体积分数 5%CO2 培养箱内培养, 48 h 后见细胞开始增殖, 细胞间出现岛状连接,部分肝细 胞呈双核(图1A)。培养 6 d后见肝细胞长满培养瓶 底,细胞呈多边形,部分细胞呈双核(图 1B)。 图 1 大鼠肝细胞原代培养后形态 A: 正常大鼠肝细胞原代培养 48 h后形态( 10@ 20) ,肝细胞开 始增殖,细胞间出现拉网现象, 部分细胞呈双核; B:正常大鼠 肝细胞原代培养第 6 d形态( 10@ 20) , 肝细胞长满培养孔底 部,细胞呈多边形, 部分细胞呈双核 2. 3 不同培养液对大鼠肝细胞贴壁及增殖的影响 新分离的肝细胞以普通培养液接种, 于 36 h 后换 液,肝细胞贴壁率较低; 以 BRL 上清或混合培养液 接种肝细胞, 36 h 后换液, 肝细胞贴壁率明显提高。 BRL 上清液能促进肝细胞的增殖, 实验各组与对照 组比较,差异均有统计学意义( P< 0. 05) (表 1)。 表 1 各组培养液吸光度比较 组别 n 吸光度 对照组 8 0. 062? 0. 002 A 照 8 0. 827? 0. 025* A 组 8 0. 635? 0. 019* B组 8 0. 451? 0. 014* C组 8 0. 298? 0. 009* 与对照组比较, * P < 0. 05 3 讨论 作者采用 2步灌流法分离正常大鼠肝细胞, 并 略加改进,是目前较成熟的成年大鼠肝细胞分离方 法[ 1] ,节省胶原酶且肝细胞产量大,活率高。 目前, 分离后的大鼠肝细胞原代培养的方法尚 不成熟。肝细胞是上皮型细胞, 贴壁生长,但肝细胞 不易贴壁,文献报道多采用半乳糖、鼠尾胶原、多聚 赖氨酸等涂布于培养瓶底的方法使肝细胞贴 壁[ 3, 4]。肝细胞对生长环境的要求较高, 前人多在 培养液中加入体积分数为 15% ~ 20%的胎牛血清, 并加入地塞米松、胰岛素、表皮生长因子( EGF)、胰 高血糖素等成分[ 5, 6] ,方法复杂,代价相对较高; 本 研究以培养过 BRL 细胞的培养液培养大鼠肝细胞, 发现肝细胞的贴壁率明显高于用普通培养液培养的 大鼠肝细胞; 本研究还发现 BRL 细胞培养上清液不 但能促进正常大鼠肝细胞的贴壁, 还能促进肝细胞 的增殖,并且随着 BRL 上清液浓度的增加。国内外 尚未见报道。 BRL 细胞系为正常大鼠肝细胞来源的细胞系, 该细胞系能分泌增殖刺激因子( multiplication stimu- lat ing activity, MSA) [ 7]。MSA能促进多种类型的细胞 的生长[ 8] , 但价格昂贵, 本研究以培养过 BRL 细胞 的培养上清培养大鼠肝细胞, 效果良好, 提示 BRL 细胞培养上清液中含有促进正常大鼠肝细胞贴壁及 增殖的物质,但这是否是 MSA 作用的结果尚待进一 步的研究证实。此外, 原代细胞体外生长所需的环 境十分重要,细胞之间的相互作用十分复杂,细胞之 间通过分泌多种蛋白、因子相互作用,促进生长[ 8]。 BRL细胞培养上清液促进正常大鼠肝细胞的生长, 亦可能是该上清液中的多种蛋白、因子协同作用的 结果。 综上所述,胶原酶体外 2步灌流法是一种较为 有效的大鼠肝细胞分离方法。以 BRL 细胞培养上 清培养原代大鼠肝细胞,肝细胞贴壁及增殖良好,是 一种简便易行、代价低廉的原代大鼠肝细胞培养 方法。 #1024# 郑州大学学报(医学版) 2004 年 11 月 第 39卷 第 6 期 参考文献 1 Seglen PO. Preparation of rat liver cells. Ó . Enzymatic re- quirement for tissue dispersion. Exp Cell Res, 1973, 82 ( 2) : 391 2 Mosmann T . Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65( 1- 2) : 55 3 Yin C, Ying L , Zhang PC, et al. High density of immobilized galactose ligand enhances hepatocyte attachment and function. J BiomedMater Res, 2003, 67A( 4) : 1 093 4 Tao X, Shaolin L, Yaoting Y. Preparation and culture of hepa- tocyte on gelatin microcarriers. J Biomed Mater Res, 2003, 65A ( 2) : 306 5 Barbich M , Lorenti A, Sorroche P, et al. In vitro culture of rat hepatocytes without exogenous matrix . In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2000, 36( 7) : 405 6 姜金兰, 吕文富,胡春光. 大鼠肝细胞的分离及原代长期 培养.白求恩医科大学学报 , 2000, 26( 6) : 562 7 Dulak NC, Shing YW. Large scale purification and further char- acterization of a rat liver cell conditioned medium multiplication stimulating activity . J Cell Physiol, 1977, 90( 1) : 127 8 鄂征. 体外培养细胞生存所需基本物质. 见:鄂征主编. 组 织培养和分子细胞学技术. 北京:北京出版社, 1995. 29 ( 2004- 03- 17 收稿 责任编辑姜春霞) 家兔静脉移植桥血管内膜 c- myc蛋白的表达 单 岩1) v 蔡太生2) 张 谦3) 徐云兴1) 1)郑州大学护理学院临床医学教研室 郑州 450052 2)鹤壁职业技术学院临床医学系 鹤壁 458030 3)郑州大学第一附属医院 小儿外科 郑州 450052 v女, 34岁 ,硕士,主治医师,研究方向: 冠脉搭桥 关键词 c- myc; 自体静脉移植;再狭窄 中图分类号 R654. 2 摘要 目的:研究 c- myc 基因在冠脉旁路移植术静脉桥中的表达。方法: 25 只新西兰大耳白兔随机分为 5 组,每组 5 只。将颈外静脉间置于同侧颈总动脉,分别在术后 6 h, 2 d, 7 d, 14 d, 28 d 取静脉桥。应用免疫组化和形 态学方法观察不同时间 c- myc蛋白的表达,采用计算机图像分析法测量静脉桥内膜、中膜厚度及其比值。结果: 7 d 时静脉桥内膜和中膜厚度较 6 h 明显增厚, 差异有统计学意义( P< 0. 01)。14 d, 28 d 时静脉桥内膜和中膜厚度较 7 d 没有明显变化, 差异无统计学意义( P> 0. 05)。移植后 6 h 至 7 d, c- myc蛋白血管平滑肌细胞逐渐增多, 于 7 d 达高峰(P < 0. 01)。移植后 14 d, 28 d c- myc蛋白血管平滑肌细胞开始下降,与 7 d 相比差异有统计学意义( P< 0. 01)。结论: c- myc蛋白表达与内膜增殖有密切联系,可作为血管损伤后内膜增殖的早期监测指标。 Expression of c- myc protein in vascular smooth muscle cell of vein graft rabbits SHAN Yan 1 ) , CAI Taisheng 2) , ZHANG Qian 2 ) , XU Yunxing 3) 1 ) Department of Clinic Medicine, Nursing College, Zhengzhou University , Zhengzhou 450052 2 ) Depart- ment of Clinic Medicine, Hebi Vocation and Technology College, Hebi 458030 3 ) Department of Pediatric Surgery , the First Aff iliated Hospital , Zhengzhou University , Zhengzhou 450052 Key words c- myc; autogenous vein graft; restenosis Abstract Aim: To study the expression of c- myc oncogenes in vascular smooth muscle cell ( VSMC) in vein graft. Meth- ods: A total of 25 New Zealand rabbits were randomly divided into five groups with five rabbits in every group. External jugular vein was interposed between ipsilateral common carotid arteries. The vein grafts were harvested after 6 h, 2 days, 1 week, 2 weeks, #1025#Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences) Dec. 2004 Vol. 39 No . 6