蛋白质连接技术

蛋白质连接技术 主 编 洪孝庄 孙曼霁 编 著 者 洪孝庄 孙曼霁 龚雄麒 仲伯华 沈倍奋 陈泮藻 李春海 卢秀桂 何云汉 中 国 医 药 科 技 出 版 社． 前 言 随着生物医学研究的迅速发展，在其相应的研究领域中也出现许多新颖的应用技术，蛋白质连接技术即是其一。蛋白质连接技术的出现最早是在本世纪20年代，在化学免疫研究中，首次合成人工抗原时已开始使用。此后，在免疫学研究中，特别是在免疫标记技术中广为应用并迅速发展。从40、50年代的免疫荧光技术，60年代的放射免疫技术，到70年代的酶免疫技术，及在此前后出现的发光免疫技术、胶体金免疫技术和稀土元素免疫标记技术等都大大丰富和发展了蛋白质连接技术。更为突出的是在1975年单克隆抗体的研制成功，以及化学家们新合成的多种异型双功能交联剂的出现，更将蛋白质连接技术的应用推向新天地。近些年来，在国内外非常活跃的研究领域——导向药物、免疫毒素相载体释放药物的研究中，亦广泛采用此类蛋白质连接技术。如将某种药物(例如抗肿瘤药物)或毒素与载体分子(如单克隆抗体或受体)进行交联组成导向药物，人们誉之为“生物导弹”。应用这种技术，将抗肿瘤药物(如多诺霉素、丝裂霉素、氨甲蝶蛉等)或毒素(如白喉毒素、蓖麻毒素、红豆毒素等)作为弹头药物与肿瘤单克隆抗体作导向载体所制成的导向药物，对相应肿瘤细胞的杀伤力大大超过一般抗肿瘤药物。毒素大多都是蛋白质，所以，上述蛋白质连接技术则可选用于导向药物的制备。更为可喜的是，近些年来，在分子生物学研究中，特别是在核酸探针的研究与应用中，蛋白质连接技术也大显身手，有人称其为分子生物学的支撑技术。随着这一技术的应用及其在相关研究领域的不断开拓，蛋白质交联也不断改进和渐趋完善，使其在生物医学领域中得到广泛的应用和重视。 目前，蛋白质连接技术不仅广泛应用于人工抗原的合成，而且在小分子物质(如毒物、药物、激素等)和生物大分子的标记免疫分析(放射免疫分析RIA、酶免疫分析EIA、荧光免疫分析FIA、发光免疫分析CIA、时间分辨免疫分析TrFIA)、标记受体分析(放射受体分析RRA、酶受体分析ERA)及竞争蛋白结合分析等配体结合分析方法中，普遍用作标记配体的制备方法。此外，在基因探针标记、肿瘤标志和诊断研究中也广为采用。 蛋白质连接技术是一种具有理论研究和实际应用价值的新技术，近几年来快速发展和更趋成熟。但是，在实际应用中，它所涉及的问题较多，无论从理论上或在实践中都还存在一些需要进一步阐明和有待解决的问题。现在，涉及这一技术的国内外文献及著述不少见，也是大家非常数悉的。然而，至今未见到对此类技术较为全面系统的论述。 为满足有关科技研究工作的需要，我们几位作者，根据多年科研实践之所得，并参阅有关文献，从介绍化学反应的主要类型出发，以生物医学研究中的实际应用为目的编写本，愿为同行提供有用的研究工具。由于本书涉及较广，作者水平有限，经验不足，书中难免有谬误之处，敬请读者批评指正。 洪孝庄 军事医学科学院毒物药物研究所 1992年5月 第一章 蛋白质交联方法及其应用 仲伯华 龚雄麒 (军事医学科学院毒物药物研究所) 蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。 蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。 近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。 将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。这是现代药物研究领域一个崭新的分支。载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求pH敏感或特定酶敏感的偶联键。 导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。其载体主要有针对肿瘤细胞表面相关抗原的抗体及其片断，肿瘤细胞表面受体的模拟配基。这些载体与药物或毒素分子连接而成的偶合物，能够选择性地杀伤肿瘤细胞，被誉为“生物导弹”。为了最大限度地保持导向载体和药物弹头的生物活性，同时实现最大的药物载运量，人们不断创新交联剂，改进交联方法，发展了一批新的各具特性的异型双功能交联剂，提高了导向药物的有效性和实用性。 随着新的交联试剂和交联方法的出现，使得放射免疫、酶标免疫和导向药物的研究不断深入；而后者的发展又反过来促进蛋白交联技术趋于成熟。目前的交联方法可以将任一个半抗原或细胞毒分子以一定方式与载体交联，获得所需的偶合物。下面分别介绍蛋白质交联中常用的试剂、方法及其应用。 一、交联方法 一般说来，蛋白分子中可以用于交联的活性基团有游离氨基(如赖氨酸的c—氨基或末端氨基)、游离羧基(如天冬氨酸残基，谷氨酸残基及末端羧基)、苯基(苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)、酚基(酪氨酸)、巯基(半胱氨酸)、羟基(丝氨酸或苏氨酸)、咪唑基(组氨酸)、吲哚基(色氨酸)或胍基(精氨酸)等。 为了避免蛋白质变性及其生物活性的损失，药物或半抗原等与蛋白的交联应采用具有中等反应活性的试剂，在温和的条件(如接近中性的pH、室温、水溶液中)进行。 (一)重氮化法 含芳香胺的化合物，可以与亚硝酸反应形成重氮盐，然后直接连接于蛋白质分子中酪氨酸残基上酚羟基的邻位，即得以偶氮键相联的结合物。这种重氮盐也能与组氨酸残基上的咪唑环或色氨酸残基的吲哚环反应： 本方法副反应较多，故一般限于人工抗原的制备。 (二)戊二醛法 同型双功能交联剂戊二醛的两个醛基可以分别与两个相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏碱，将两分子以五碳链的桥连接起来。 戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一，可在4~40℃温度范围，pH6.0~8.0的缓冲水溶液中进行，但是缓冲组份中不得含有氨基化合物。以硼氢化钠或氰基硼氢化还原Schiff氏碱可以形成稳定的单键；根据对偶联键的不同要求，还原步骤也可省略。但是，本交联方法易形成相同蛋白间的连接；产物的均二性较差。因此，多用于酶标抗体的制备。 (三)过碘酸盐氧化法[1] 糖类或含糖基化合物分子中的邻二醇结构可被过碘酸钠氧化为醛基，然后与蛋白分子中的氨基形成Schiff氏碱： 与戊二醛的交联反应相似，过碘酸钠氧化法比较温和，可在常温和中性pH的条件下进行。这是一个两步反应，第一步生成醛基衍生物后，过量的过碘酸盐必须除去或消耗后，方可进行与蛋白交联的第二步反应。 (四)混合酸酐法 半抗原或药物及其衍生物分子中的羧基可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，生成活泼中间体混合酸酐，然后与蛋白载体上的伯氨基反应，形成酰胺交联键： 本反应过程简单，毋需制备和分离中间产物。 (五)碳二亚胺法 碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使羧基和氨基脱水形成酰胺键。在反应时，一种分子中的羧基先与碳二亚胺反应生成一个加成中间产物，再与另一分子上的氨基反应形成酰胺键，实现两者的交联： 除戊二醛外，碳二亚胺是常见的另一类交联剂，最早用于药物化学和有机化学领域；脂溶性的二环己基碳二亚胺至今仍被广泛用于多肽合成领域，但其反应必须在有机溶剂中进行，不适用于蛋白质交联。水溶性的1—乙基—3—(3—二甲基氨基丙基)—碳二亚胺(EDC)等的出现，使这一缩合反应成功地用于蛋白质交联中。本交联反应条件温和即使在冷却条件下，也能于中性pH中进行。但是，由于碳二亚胺的缩合反应没有选择性；易形成蛋白分子间的自身聚合，产生非均一性产物；先将含羧基的药物或半抗原分子与EDC反应，活化羧基后，再加入蛋白反应物，可以减少蛋白分子交联。 (六)活泼酯法[2] 含有羧基的半抗原或药物在二环己基碳二亚胺(DCC)的作用下，与N—羟基琥珀酰亚胺反应，生成活泼酯衍生物，后者与载体蛋白上的氨基反应，形成以酰胺键连接的偶合物： 本法是对碳二亚胺法的改进：由于避免了碳二亚胺对蛋白的直接作用，从而避免了蛋白分子间的交联。活泼酯法在导向药物的研究中得到广泛的应用。 (七)多元酸酐法[3] 半抗原或药物分子中的羟基或氨基与琥珀酸酐、顺—乌头酸酐等在无水吡啶催化下反应，形成单酯或单酰胺衍生物，引入游离羧基，然后以活泼酯法或碳二亚胺法与蛋白交联： 多元酸酐法可以十分方便地将小分子中的羟基或氨基转变为合游离羟基的衍生物，具有较广的应用范围。但是，与羟基形成的酯健在血浆中不稳定；而与氨基形成的酰胺键又往往不能充分降解；释放游离药物，影响导向药物的效价。有趣的是，药物通过顾—乌头酸与蛋白形成的偶合物，在中性pH介质(如血浆中)稳定，而在酸性pH介质中充分解离，释放活性药物。由此产生的溶酶体内降解性复合物，经细胞内化后，进入溶酶体内，在酸性条件下解离。 (八)二异氰酸酯法 二异氰酸酯类双功能试剂中的两个异氰酸基分别与两个不同分子上的氨基反应，介以不同碳链长度的桥将两者偶联： 这类试剂除了能与氨基反应形成取代脲外，(在pH＞7时为主要反应)，尚能与羟基反应形成氨基甲酸酯衍生物；水溶液中的副反应(如第二个异氰酸酯基水解产生的胺，能与另一异氰酸酯分子连接)，可能通过疏水作用导致蛋白的聚合。 (九)偶氮苯甲酸法 对氨基苯甲酸重氮化后，与带苯环的半抗原偶联引入羧基，再利用羧基的反应连接于蛋白上： (十)O—羧甲基羟胺法 半抗原上的酮基与O—羧甲基羟胺反应，制备羧甲基肟衍生物。引入的羧基再与载体蛋白的氨基反应，形成半抗原—蛋白偶合物： (十一)对-肼基苯甲酸法 带酮基的半抗原也可以与对—肼基苯甲酸反应，引入羧基，再按常法与载体蛋白交联； (十二)．叠氮化法[4] 羧酸甲酯衍生物经肼解、亚硝化，转变为叠氯化物，再与载体蛋白上的氨基反应： (十三)氯乙酸钠法 半抗原的羟基与氯乙酸钠反应，形成羧甲基醚衍生物，再通过羧基与蛋白交联： (十四)亚胺酸酯法 双功能试剂亚胺酸酯类如丙双亚胺酸二乙酯双盐酸盐可以与半抗原和载体蛋白的氨基交联，中间介以一个三碳桥： 亚氨酸酯类水溶性良好，反应条件温和，与氨基的反应选择性高，这类试剂的最大特点是，可与蛋白分子上的赖氨酸残基广泛反应，而不影响蛋白分子的净电荷改变。具有不同碳链长度的亚氨酸酯可将半抗原间以一定距离与蛋白连接。 (十五)卤代硝基苯法 双功能试剂二硝基二氟苯或二氟二硝基苯砜分子中的氟原于，由于邻近硝基的活化作用，易和半抗原或载体蛋白上的亲核基团如氨基、羟基、巯基等反应： (十六)Mannich反应法 酮、酚类半抗原，可以用Mannich反应引入羧基，然后与常法与蛋白交联； (十七)苯醌法 交联过程分两步进行，第—步反应完成后，分离除去过量试剂，再进行第二步反应。 (十八)E11man试剂法[5] E11man试剂即5．5’—二硫—2，2’—双硝基苯甲酸(DTNB)，该试剂可以与巯基作用，交联反应分两步进行： 本法用于游离巯基的保护和活化，以便与游离巯基的另一蛋白分子进行巯基交换反应。 (十九)马来酰亚胺基类活泼酯法 马来酰亚胺基结构中的双键比较活泼，可与游离巯基进行选择性加成反应。马来酰亚胺基取代羧酸衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂与含氨基的药物或蛋白反应，引入马来酰亚胺基，与另—含有游离巯基的分子通过巯基对双键的加成反应连接起来。 这是一组异型双功能交联剂，常用的有N—羟基琥珀酰亚胺基—间—(N—马来酰亚胺基)-苯甲酸酯（SMB），N—羟基琥珀酰亚胺—4—(N—马来酰亚胺基) -苯丁酸酯（SMPB）等。 (二十)SPDP试剂法[6] 异型双功能交联剂N-羟基琥珀亚胺基-3—(2-吡啶基二硫)—丙酸酯(SPDP)可以通过其分子中的活泼酯组份与氨基反应，也可以通过2—吡啶二硫基团与脂肪硫醇反应.SPDP能够于蛋白分子中引入巯基，然后利用巯基交换反应或巯基加成反应与另一分子交联： 这是目前较为常用的一种交联剂，交联反应条件温和，副反应较少，能够定量地于蛋白分子中引入保护的巯基，且能够方便地测定其含量。同类的交联剂尚有N—羟基琥珀酰亚胺—(4—a—甲基—a—(2—吡啶基—二硫代甲基)—苯甲酸酯(SMPT)[7]和N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2—毗啶二硫)—丁酸酯(SPDBt[8])。通过在二硫键的a—位引入位阻性基团如甲基，可以增加交联物中二硫键的稳定性。 (二十一)苯丁酸氮芥衍生物法[9] 苯丁酸氮芥的N—羟基琥珀酰亚胺基酯或混合酸酐衍生物分子中的活性羧基和氮芥基可以分别与两个蛋白分子中的氨基反应，将两者连接起来： 在中性及微碱性pH条件下,氮芥基倾向于与巯基反应，而在较高pH时倾向于与氨基反应。 (二十二)卤代乙酰衍生物法 卤代乙酸的活泼酯衍生物如N—羟基琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯分子中的活泼酯成分和α—位活泼卤素可以分别与蛋白分子中的巯基及氨基反应，实现两种分子的交联： 本交联反应迅速，具有较高选择性，形成的硫醚键在血浆中十分稳定。 (二十三)双马来酰亚胺试剂法[10] 这类试剂的代表为N,N’—邻苯基双马来酰亚胺，可以连接两个含巯基的分子。 这是一类比较温和的交联剂，具有较高的反应选择性，但是易形成同类分子的交联产物。 (二十四)三氯三嗪试剂法 三氯三嗪分子可以与含羟基的分子反应,剩余的第二个氧原子活性稍低，可为蛋白分子上的氨基取代，实现两分子的交联： 必须注意，第一个分子中不能含有氨基及巯基等亲核性较强的基团，否则，易形成自身聚合。 二、交联方法的选择及偶合物的设计 如上所述，蛋白质交联方法的类型繁多，虽然能够满足各方面的需要，但也增加了使用者选择的困难。评价某一交联方法时，应该考虑以下有关因素：①交联反应的效果，如交联产物组成的均一性;②交联反应的产率;③交联过程对生物活性的影响；④交联操作的简便性；⑤交联产物纯化的难易；⑥交联反应结果的可重复性；⑦偶合物的使用目的。理想的交联方法应该保证结合物得率较高，结合物的组成均一，结合比合适，最大限度地保持生物活性，操作方便，纯化容易；在同样条件下，重复性好。 然而，目前还没有一种交联方法能够同时满足上述要求。由此，必须根据结合物的使用目的，权衡不同方法的优缺点来选择合适的交联方法；最好同时使用几种交联方法进行比较，择其优者而用之。 在人工抗原的制备中，主要要求制备的人工抗原保持半抗原的结构特异性；所用交联方法不要明显改变半抗原结构，要保留抗原簇。必要时可在半抗原与载体之间引入一定碳链长度的桥结构，暴露抗原决定簇，以利于产生针对半抗原的抗体。 影响人工抗原的免疫效果的另一重要因素是每分子载体上结合的药物分子数。一般认为药物结合量越大越好，但最佳结合比也取决于半抗原的本质及载体的性质。由于抗体的特异性主要针对半抗原分子中远离偶联键的结构，因此，在设计人工抗原结合物时，应选择远离半抗原特征结构的基团进行交联。例如，与抗—睾酮—17—牛血清白蛋白相比，抗—睾酮—3—牛血清白蛋白能够更好地识别类似结构的甾体化合物。通过桥结构将载体蛋白连接于抗原分子中非生物特异性的位置如雌激素的C—6位，黄体酮的C—6或C—11位，制备的人工抗原结合物具有更好的特异性。由这些结合物产生的抗体能够识别半抗原的所有结构特征。 相应地，抗半抗原的抗体对结合部位或邻近结合部位的结构变化是不敏感的，如3-羧甲基吗啡—蛋白结合物诱生的抗体不能区分吗啡和可待因[11]。还原青蒿素—蛋白结合物所诱生的抗体可以用于测定青蒿素、蒿甲醚及青蒿酯[12]。而通过不同方法制备的安定的两种蛋白偶合物所产生的抗体，都能特异性地识别安定。这些性质给人工抗原的制备带来极为有利的条件，人们可以适当改变半抗原结合部位的结构或引入交联活性基团，使制备人工抗原的方法更加多样化。 对于酶标抗体的制备，最重要的是同时保持酶和抗体的生物学活性，制备化学组份均一的结合物。异型双功能交联试剂的应用，基本实现了交联反应的控制进行，减少或避免了自身聚合和交叉聚合，保证了交联产物的有效性。 对于载体药物，首先要求其能够在体内定量或定位地释放出具有生物活性的游离药物。为此，连接药物与载体的偶合键必须能够在一定条件下以一定速度解离，而且解离速度能够通过pH的改变或体内不同组织小环境的差异(如酶的种类或活性)得到调控,以达到定向给药的目的；在制备载体药物结合物时，对药物分子的结构不宜作永久性的改变，以免引起生物活性的改变；其次还要求每一载体能结合足够量的药物分子，以保证给药的效率。 在抗体导向药物的设计和制备中应该考虑以下几点：①细胞毒分子—抗体偶合物在到达作用部位以前保持稳定，在血浆中不被降解；②结合物的特异性能够反映载体的特异性，即具有原载体的专一性识别和结合作用；⑤结合物到达作用部位以后，能以某种方式进入细胞，发挥药理作用，即结合物本身具有细胞毒活性或结合物进入细胞后能够释放活性形式的药物。 因此，对细胞毒分子中药物活性所必需的部位不宜作不可逆化学修饰，而且偶联键要远离活性部位，以避免立体位阻对生物活性的影响。如甲氨蝶呤分子中的蝶呤部分对二氢叶酸还原酶有高度的亲和性，是抗代谢活性的必需结构，对其进行任何改变，均可导致药物活性的丧失；但是，远离蝶呤的谷氨酸残基，对酶抑制活性影响不大，可以用作交联基团。又如将细胞毒分子连接于抗体分子中远离抗原结合位点的Fc区，可以最大限度地保持抗体活性[13]。 利用血浆与溶酶体pH的差别，设计pH敏感的偶联键，制备药物载体偶合物，可以实现药物的控制释放[14,15]。如柔红霉素通过顺—乌头酸与蛋白形成的结合物，在生理pH时稳定；而进入细胞后，可以在溶酶体的酸性条件(pH4~5)下解离，释放柔红霉素原型药物分子，发挥细胞毒作用[14]。 不论使用哪种蛋白载体，其所能提供的交联基团是相似的。因此，交联方法的选择以及交联物的设计主要取决于半抗原或药物分子上的功能团结构，下面就根据这些功能团的分类，分别讨论不同交联方法的应用。 (—)羧基 药物或其衍生物分子上的羧基可以通过碳二亚胺法、混合酸酐法等与蛋白上的氨基形成酰胺键，其中碳二亚胺法在这类化合物的偶联反应中的应用最为广泛。血管紧张素和缓激肽、促胃液素、吗啡、前列腺素、托普霉素、1—B—E—阿糖呋喃胞嘧啶、强的松—21—琥珀酸半酯等均可在水溶性碳二亚胺EDC的作用下，与蛋白或多聚氨基酸等载体结合，制备人工抗原。许多含羧基的抗肿瘤药物如甲氨蝶呤[2]、苯丁酸氮芥、柔红霉素[3]的二元酸单酯衍生物、丝裂霉素C—戊二酸单酯[16]、新制癌菌素[17]和磷酸酯酶C等均可在EDC作用下与抗体偶联，制备抗体导向偶合物。 同时含有氨基和羧基的小分子，可以先将氨基保护后，再用羧基与载体交联，以避免自身缩合，交联反应完成后再脱保护，游离氨基。不溶于水的药物可先以二甲基甲酰胺溶解，然后再加于蛋白水溶液中，进行交联反应。 为了减少蛋白分子间的自身聚合，可以先将药物分子上的羧基转化为N—羟基琥珀酰亚胺的活泼酯，然后再与抗体交联。例如，将丝裂霉素C—戊二酸单酯转化为活泼酯后，再与抗体交联，可以提高蛋白回收率和产品的均一性，更好地保持抗体活性[18]。类似地，可以制备D，L—10，11—环氧麝子油酸及蜕皮激素的人工抗原结合物。 混合酸酐法也能用于形成酰胺键。通过混合酸酐法与蛋白载体交联的半抗原有考的松—21—琥珀酸半酯、尿核苷—5’—磷酸、睾酮—17—琥珀酸半酯、3—O—琥珀酰毛地黄毒甙配基、胆酸、甲状腺素及利血平等。 药物及半抗原的羧酸酯、活泼酯或酸酐衍生物可以与肼反应，转化为相对稳定的酰肼物。后者在水性介质中，很容易和蛋白分子上的醛基或酮基(由高碘酸钠氧化IgG分子上的糖残基产生)反应，形成腙结构的结合物。 此外，药物分子中的羧基还可以转变为酰基叠氮衍生物，然后再与蛋白分子上的氨基反应，形成以酰胺键连接的结合物，酰基叠氮衍生物可以由酰肼与冷的亚硝酸反应制备，也可以通过酰氯与叠氮钠反应产生。通过这种方法与蛋白交联的有阿斯匹林、去乙酰长春花碱、甲状腺素等。 (二)氨基 含氨基的半抗原及药物可以分为两类，即芳香胺类和脂肪胺类。这两类胺的交联方法有所不同，下面分别讨论。 许多芳香胺类的化合物可以在低温条件下与亚硝酸反应形成重氮盐，然后与载体蛋白分子上的酪氨酸或组氨酸残基反应，形成以偶氮键交联的结合物。芳香环上含硝基的化合物如氯霉素，可将硝基还原为氨基后，再制备重氮盐，与蛋白载体结合。但是，重氮盐交联法存在难以克服的副反应，可导致蛋白大量沉淀；而且，与重氮盐反应的酪氨酸和组氨酸残基多存在于IgG分子中抗原结合区及其附近，因此交联反应易导致抗体活性的损失。所以这一方法一船不用于抗体导向药物的制备中。 脂肪胺类化合物可以在水溶性碳二亚胺作用下，与载体蛋白上的羧基结合。用此方法连接的半抗原有缓激肽、血管紧张素、托普霉素、庆大霉素、阿霉素、5-羟色胺及精脒等。脂肪胺还可以与一硝基苯甲酰氯反应，形成对-硝基苯甲酰衍生物，再将硝基还原为氨基后，通过重氮化与载体蛋白结合，以此法交联的半抗原有烟草花叶病病毒蛋白及血管紧张素等。通过双功能交联剂苯甲基二异氰酸酯将胺类化合物与蛋白上的氨基连接，可以制备缓激肽的人工抗原结合物。药物分子上的胺基还可以通过戊二醛试剂与蛋白分子上的氨基结合，由此可以制备促肾上腺皮质激素、高血糖素及支甲肾上腺素等到的人工抗原结合物和阿霉素-抗菌素体导向偶合物[44]。 以上交联方法均是利用同型双功能交联剂连接两分子上的氨基。在交联过程中，不可避免地会形成部分相同分子间的聚合产物。为了达到控制交联的目的，可以利用多元酸酐法，于含氨基的半抗原分子上引入游离羧基,然后再以活泼酯法或碳二亚胺法与蛋白交联。如先将柔红霉素与琥珀酸酐或顺—乌头酸酐反应，再利用引进的羧基与抗体上的氨基反应，形成抗体导向偶合物[8]。也可以通过与SPDP反应，于半抗原分子上引入巯基，利用巯基反应与抗体交联。 (三)羟基 含有羟基的半抗原分子包括醇类、酚类、糖类及核苷酸类。在这类化合物的交联中，通常先要制备其衍生物，以引进能够与蛋白反应的功能团。例如，甾体化合物可以通过与琥珀酸酐反应，形成琥珀酸单酯衍生物，然后按羧基交联方法与蛋白偶联。按照类似方法可以制备环腺苷酸、雌酮、B—dl美沙醇、3—羟基氯硝安定、蜕皮甾酮、心得安、A9—四氢大麻酚及1—B—D—阿糖呋喃胞苷的蛋白结合物。也可以将醇羟基与光气反应，制备高度反应活性的氯甲酸酯，然后在碳酸氢盐存在下与蛋白分子上的氨基交联。 三氯三嗪或羧甲基取代的二氯三嗪试剂可以连接药物分子上的羟基与蛋白分子上的氨基，交联分两步进行，羟基化合物先与三嗪试剂反应，形成醚衍生物；剩余的取代氯反应活性较差，不能再羟基取代，但可与亲核性较强的蛋白氨基反应，由此形成通过三嗪核偶联的结合物。双功能交联剂卤代硝基苯也可以用于连接药物分子上的羟基和蛋白分子上的氨基。 酚类化合物可以通过与重氮化的-氨基苯甲酸反应，引入羧基，然后利用羧基反应与蛋白交联。这一类型的反应被成功地用于制备17，B—雌二醇及()7- 四氢大麻酚的人工抗 原结合物。 具有邻二醇结构的核苷或核苷酸类化合物，可用高碘酸盐氧化出醛基，后者可以与蛋白分子上的氨基反应形成Schiff氏碱，以硼氢化钠还原后即可得到稳定的以碳—氮单应过程中，毋需分离中向产物，本法成功地用于制备地高辛及G-毒毛旋花子甙的蛋白结合物。改进法被用于制备碱敏感性的核苷及核苷酸结合物。用高碘酸盐氧化法制备的抗体导向偶合物有柔红霉素—右旋糖苷—抗体结合物及柔红霉素—抗体 偶合物。后者是通过氧化右旋糖苷上的邻二醇为醛基，利用醛基分别连接药物和抗体分子上的氨基制备而成。但本法也可以产生副产物，而且硼氢化还原可能破坏药物结构，影响药物活性[19].用高碘酸钠氧化抗体IgG分子Fc端的糖基，利用生成的醛基与氨基化合物交联。这样，将细胞毒组份区域选择性地连接于远离抗原结合位点的Fc端，可以更好地保持抗体活性。 (四)羰基 醛基化合物如吡哆醛及毗哆醛磷酸酯可以通过与蛋白分子上的氨基形成Schiff氏碱，实现与蛋白的交联。醛或酮均可以通过与O—羧甲基—羟胺反应，转化为O—羧甲基—肟衍生物,引入一个羧基，通过形成酰胺键与蛋白交联。以这种方法交联的半抗原分子有睾酮、孕酮、雌酮及18—乙基炔诺酮。醛固酮及考的松等与对—肼基苯甲酸反应，再利用引入的羧基与牛血清白蛋白交联。在羰基的。位引入一个卤素原子，再与蛋白分子中的氨基反应，可形成碳—氮单键交联的产物。如14—溴代柔红霉素在微碱性条件可与蛋白IgG结合，形成抗体导向偶合物[20]。 (五)巯基 青霉烯酸分子上的巯基，可以与蛋白分子中引入的巯基反应，形成以二硫键交联的结合物。6，β—溴—孕酮及14—溴代柔红霉素[3]可以与蛋白分子中引入的巯基反应形成以硫醚键连接的结合物。 利用巯基反应进行偶联的方法主要用于蛋白毒素与抗体偶联，形成免疫毒素。一般来说，巯基可以通过二硫交换反应形成二硫键，或通过与马来酰亚胺基上双键的加成反应形成硫醚键，实现毒素与蛋白的连接。类似的交联方法同样可以用于制备酶标抗体。 由于蛋白质分子中通常没有巯基反应活性基团，因此，巯基交换反应具有较好的选择性，在一定程度上避免相同分子间的聚合，而且通过定量引进巯基及巯基反应活性基团，可以实现控制交联，以得到化学专一性和生物专一性更好的交联产物。 毒素或抗体分子可以与SPDP、2—亚胺基四氢噻吩十4，4’—二硫吡啶、3—(4’—二硫吡啶基)—丙酰亚胺甲酯等反应，引入保护性巯基—二硫吡啶基(一S—S一 ), 后者可以通过巯基交换反应与另一蛋白分子上的巯基形成二硫键。蛋白分子中的巯基可以由二硫毗啶基的还原产生，也可以通过与2—亚胺基四氢噻吩、3—巯基丙酰 亚胺甲酯、N—乙酰同型半肮氨酸硫代内酯或S—乙酰硫代琥珀酸酐等试剂反应引入。利用马来酰亚胺基活泼酯试剂或碘代乙酸活泼酯于蛋白分子中引入巯基反应活性的马来酰亚胺双键或碘乙酰基，然后与另一蛋白分子中的巯基进行加成反应或取代反应，形成以硫醚键连接的偶合物。 三、结合物的纯化与鉴定 蛋白质交联反应中的小分子如未结合的药物、交联剂、反应副产物可以通过凝胶柱层析、透析或硫酸铵沉淀法与高分子结合物分离。对于蛋白—蛋白交联产物，可以根据产物和反应物分子量的大小，选用合适的凝胶柱层析，将交联产物与未反应的蛋白分离。为了获得分量更均一的产物，也可以采用高效液相层析、电泳及离子交换柱层析进行分离纯化。 对于蛋白结合产物，首先必须测定其中各组份的含量。常用的测定方法有：1两种组份的吸收光谱不重叠者，可以选择合适的波长分别测定OD值，计算两组份的摩尔浓度，推算结合比。一般利用280nm处的特征吸收，测定蛋白含量；2载体蛋白含有一定数目的游离氨基，与含羧基的药物交联后，游离氨基必将减少，可以用三硝基苯磺酸法或二硝基苯酚法测定交联前后氨基的含量，推算结合比：3在交联过程中加入一定量的放射标记药物或蛋白，通过测定结合物的放射比活性，计算结合比；4将结合物水解后，利用药物所特有的颜色反应，测定解离药物的含量；或者利用考马斯亮蓝法及福林—酚法测定蛋白的含量；5对于蛋白—蛋白结合物，可以通过SDS—PAGE电泳测定结合物的分子量，推算结合比。 参考文献 1．Avrames S，et al．Scand J Immunol 1978，8(suppl 7)：7 2，Kulkarni PN，et al．Cancer Res 1981 ; 41:22700． 3．Gallego J，et al．Int J Cancer l984；33：737． 4．Johson JR，et al．Br J Cancer 1981，44：472． 5．Raso V＆Grjffin T．J Immunol 1980；125：2610． 6．Carsson J，et al．Biochem J 1978；173；723． 7．Thorpe PE，et al．Cancer Res l987; 47:5924． 8．WOrrell NR，et al．Anticancer Drug Design 1986；1：179． 9．Philpott GW，et al．J Immun0l 1980; 125：1201． 10．Weston PD，et al．Biochim Biophys Acta l980; 612：40． 11．Nilsson P，et al．J Immunol Methods l981；41：81． 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lmmunoassay，EIA)为例，是以酶标记的抗原(或半抗原)和非标记的抗原(或半抗原)对专一性抗体的竞争性结合反应为基础，其中抗原—抗体之间的免疫反应通式如下： Ag十Ab—＞Ag—Ab 当用酶标记抗原(E—Ag)检测非标记的待测抗原(Ag)时，两者便与其特异抗体(Ab)发生竞争结台作用，此即为竞争性酶免疫分析的理论基础： (E—Ag)十Ab——，(E—Ag)一Ab (F) 十 (B) 、 Ag Ag-Ab 游离(F)与结合(B)部分分离后，测其中(F)a或（B）分的酶活性，则与待测的非标记抗原量成比例。此类分析方法专一强、灵敏度高、操作简便，在分子生物学、生化药理、免疫药理及临床医学研究中易于采用。 3.配体结合分析的类型 在配体结合的大分子生物活性物质称为结合剂。常用的结合剂有酶、抗体、受体和特异结合蛋白等(表2—1)。 目前，根据所用结合剂的不同，可将配体结合分析分为三大类：①以抗体为结合剂者为免疫分析；②以受体为结合剂者为受体分析；③以特异结合蛋白为结合剂者为竞争蛋白结合分析。 以下简要列出上述三类配体结合分析的主要方法： (1)免疫分析(Immunoassay) A．放射免疫分析(1,2) B．酶免疫分析: a．非均相酶免疫分析(Heterogeneous Enzyme Immunoassay)或称酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Imunosorbent Assay，ELISA)； b．均相酶免疫分析(Homogeneous Enzyme Immunoassay)或称酶放大免疫测定技术(Enzyme Multipled Immunoassay Technique，EMIT)[3]； C，荧光免疫分析(F1uoroimmunoassay，FIA)[4]； D．发光免疫分析(Luminescent Immunoassay，LIA)[5]： a．生物发光免疫分析(Bi0luminescent Immun0assay，BLIA)； b．化学发光免疫分析(Chemiluminescent Immunassay，CLIA)； E．无标记免疫分析(Marker-free Immunoassay)[6，7]： a。胶乳凝集免疫分析(Agglutination Latex Immunoassay)； b。颗粒计数免疫分析(Particle Counting Immunoassay，PACIA)； F．仪器免疫分析： a。激光浊度免疫分析(Laser NephelometriC Immunoassay，lNIA)； b．荧光偏振免疫分析(Fluorescence P0larization Immunoassay，FPIA)； (2)受体分析(Receptor Assay)[8]。 A．放射受体分析(Radio Receptor Assay，RRA)； B．酶受体分析(Enzyme Recept0r Assay，ERA)[9,10]； (3)竞争蛋白结合分析(CompetitiYe Protein Binding Assay，CPBA)[11] (二)配体结合分析中的标记(即蛋白连接)技术 1．标记物的种类 (1)放射性同位素：3H、125I； (2)非放射性标记物 1) 酶、辅酶、酶抑制剂； 2) 荧光、生物发光及化学发光物质； 3) 金属原子；稳定自由基； 4) 红细胞、噬菌体；胶乳(Latex)； 。 5) 毒素：白喉毒素、蓖麻毒素及红豆毒素等，此类物质不是用于配体结合分析的标记物，而是用于免疫毒素的制备。 2．标记对象(被标记物) *表示被标记物 (1)生物大分子(绝大多数为蛋白质) 1) Ag或*Ab(●抗原或●抗体)； 2) L—*R(配体—●受体)； 3) Biotin—*Avidin(生物素—●抗生物素蛋白)[12]； 4) *SPA—IgG(●金黄色葡萄球菌A蛋白—IgG)； 5) *PHA—OH—R(凝集素—糖基)。 (2)小分予物质 ①*H(*Hapten，即半抗原)或 ②*L(*Ligand，即配体)：包括各种药物、毒物、固醇类激素等小分子物质。 3．标记方法概述(用于非放射性标记物的标记) (1)化学法 ①蛋白质大分子之间的交联：戊二醛法，高碘酸钠法，SPDP法，苯酯法等； ②蛋白质大分子与小分子配体或半抗原的交联；碳化二亚胺法(EDC)，混合酸酐 (MA)法，琥珀酸酐法，N—经基琥珀酰亚胺法等。 (2)生物亲和配体交联法(或称间接标记法) 标记物本身既是(或作为)标记物，又是被标记物，通过与其相对应的亲和配体的亲和结合作用，达到标记之目的。常用的有以下几种方法： (亲) (亲) (化) 1) Ab——Biotin——Avidin——HRP (亲) (化) 2) IgG——SPA——HRP （ 亲) (化) 3) IgG(Abl)——anti-IgG(Ab2)---HRP 4) 免疫学交联法(或称酶抗酶法，PAP)[l3]: Abl——Ab2——Ab1E(anti—HRP)----HRP(E) 其中Ab1为第一种动物的抗体，AblE为用同一种动物的抗酶(HRP)抗体，Ab2为第二种动物抗第一种动物(IgG，即种属球蛋白)的抗体，通常称为第二抗体(Ab2)，亦称抗种属球蛋白。由上述三组(Ag—Ab)免疫反应关系，达到用酶(HRP)对抗体(Ab1)的标记，这种酶对抗体的交联是不经过任何化学交联的免疫学亲和标记，故又称为不标记酶法。而在前三种生物亲和配体交联方法中，首先是生物亲和结合作用，但是，酶的标记还必需通过化学交联剂进行交联，才能最后完成。 上述各种类型的标记方法，根据所标记的对象，大体上可分为两类，一类是对大分子蛋白质的标记，另一类是对小分子物质的标记。以下则用酶作为非放射性标记物的代表，简要介绍酶对蛋白抗原、抗体和小分子物质的标记，同时也将涉及半抗原(即无免疫原性的小分子物质)与蛋白载体的交联——人工抗原合成制备中的若干问题。 二、酶 标 记 技 术 通过化学反应(在化学交联剂的作用下)或亲和结合作用，使酶与抗原、半抗原或抗体结合的过程，称为酶的标记或交联。经交联所得之产物称为酶标记物或酶结合物。(简称结合物)。 在酶免疫分析及其他各类配体结合分析中，标记结合物的制备甚为重要，是此类方法的关键所在。一般说来，对酶结合物的要求，①具有高的酶活性；②具有高的抗原或抗体免疫活性：②稳定性要好。在标记反应系统中，参与交联反应的组份，既有标记物，又有被标记物，同时还有化学或生物配体交联剂，它们在一定条件下，发生交联而形成标记结合物，此结合物的质量既与各组份的纯度、活性、稳定性有关，也与所选择的交联剂和交联方法有关。在严格控制交联反应条件下，使所得到的标记产物——结合物，能保留各组份原有的活性，以便在此后的配体结合分析中，既能参与与配体高度专一的亲和结合反应，又不失去标记组份的信号放大作用，以保证具有很高的灵敏度。除此之外，对所制备结合物的分离纯化及鉴定也是标记技术的必要步骤。 (一)在酶免疫分析(EIA)中所用的标记酶 酶在EIA中作为标记物，必须具有高活性、高纯度、高稳定性；酶在标记过程的化学修饰及免疫反应(或与配体结合)过程中其活性均无明显变化；对酶活性的检测方法要灵敏、准确、简易；酶源丰富价廉；同时，酶底物应对人体健康无害。 酶免疫分析，从其方法模型来看，可以分为两大类，一类即“非均相酶免疫分析”，其中，酶联免疫吸附试验(ELISA)是最常用的一种，也是大家很熟悉的，又称固相酶免疫分析；另一类称为“均相酶免疫分析”，最具代表性的是酶放大免疫测定技术(EMIT)，此类方法为美国Syva公司首创，目前国内还未见报道[3，14]。 在非均相酶免疫分析(ELISA)进行过程中，结合的（B)与游离的(F)标记酶活性没有变化，因此，在对酶活性进行测定之前，必需将(B)与(F)两部分用物理的方法加以分离，以便曲定，(B)或(F)的酶活性，从而对待测物进行定量分析。在均相酶免疫分析(EMIT)进行过程中，由于酶标结合物与抗体的结合，抗体(免疫球蛋白)大分子对酶的活性中心所引起的空间障碍或变构效应，从而使结合的(B)酶标物与游离的(F)酶标物之间的酶活性有明显的变化(抑制或活化)，因此，在EMIT分析过程中，不需将结合的(B)与游离的(F)两部分酶标物进行分离，而始终是在均一的液相体系中进行反应和酶活性测定。 由于酶免疫分析具有上述两类截然不周的作用机理和方法模型，即ELISA和EMIT，所以两者所用的标记酶也不相同。ELISA所用的标记酶以辣根过氧化物酶(HRP)为最广泛，其次为碱性磷酸酯酶(AKP)(表2—2)[15]。在EMIT中，应用最多的标记酶是葡萄糖-6—磷酸脱氢酶(G6PDH)，另外，苹果酸脱氢酶(MDH)和溶菌酶 （lysozyme）这也使用（见表2—2）[14]。在这里应该强调指出，在EMIT中所用的G6PDH应该是由肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides，LM．)来源的酶[16]，绝对不能使用由酵母来源的G6PDH，这是因为，LM．—G6PDH对NAD’有高度的专—性，用这种酶可以排除溶血样品的干扰，因为相应的人红细胞膜G6PDH对NADP+是专一的，而酵母来源的G6PDH也对NADP+专一，易受影响，不能作为标记酶。MDH的比活性较高，根据文献报道，它仅适用于对尿样的分析。 (二)标记反应中可利用的化学功能基团 用酶作为标记物，通常是对抗原、半抗原或抗体进行标记的；在ELISA中被标记物可以是大分子抗原、抗体或其它蛋白类物质；也可以是小分子半抗原、药物、毒物、激素等而在EMIT中，从目前巳发表的文献资料看，被标记物几乎全部都是小分子半抗原或药物。如抗体是一种含糖的蛋白质大分子物质，而抗原及半抗原则是多种多样的，它们的分子量可从几十、几百、到几十万，含有许多不同的化学基团。从上述各种标记酶或被标记物质的多样性来看，交联双方可以是小分子半抗原与蛋白质大分子之间的连接，也可以是两种蛋白质大分子之间的结合。所利用的主要化学反应基团是羧基、氨基、糖基或芳香胺等。在两类酶免疫分析中，由于所标记的物质不同，可利用的化学功能基团也不同，因而，所选择的化学交联剂和使用的交联方法也不尽相同，必须根据交联双方即酶和抗原、半抗原或抗体分子所具有的化学反应基团而定(表2—3)。 在进行标记时，对化学交联剂和交联方法的选择还必须注意以下几点原则： 1)应采用非常活泼的交联剂，并在温和的条件下进行； 2)对酶、抗原、抗体等蛋白质的生物活性影响要小，以尽量保护其生物活性； 3)对不具有化学反应功能基团的物质，必需进行化学修饰或改造，以引入具有反应功能的基团； 4)化学修饰不能改变或遮盖抗原关键的免疫活性决定簇，以保存酶标结合物在进行免疫分析中的免疫反应专一性； 5)某些小分子物质，虽然具有反应性基团，但为进行更有效的偶联，可预先连接作为“桥”或“间隔臂”的分子，然后再进行交联标记； 6)酶结合物的产量要高，性质要稳定。 (三)在酶标记技术中常用的交联反应类型 1.氨基与羧基交联 1)碳二亚胺(EDC)法：本方法原由Goodfriend提出，是最常用来联接小分子半抗原与蛋白质(载体)的方法。EDC(R（1）N＝C＝NR2)是一种化学性质很活泼的试剂，能使氨基和羧基间脱水缩合而形成酰胺键。蛋白质或多肽分子上的羧基先与碳二亚胺反应，生成一中间物，然后再与另一蛋白质或氨基化合物的氨基反应，形成偶联物。经常使用的水溶性碳二亚胺的化学名称为1—乙基—2—(3—二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)，它既可以和蛋白质或半抗原上的羧基结合，又可与其氨基结合，其结合反应的pH为5~9，要根据交联对象选择最适pH，如为生物蛋白样品，可选择pH7左右。用本方法交联十分方便，只需将酶蛋白(或蛋白质载体)与半抗原按一定比例（M：M）溶解在适当的溶液中，混合均匀，然后加入EDC，在4℃或室温条件下，搅拌反应24小时，经过透析分离除去未结合的半抗原，即得到酶结合物或人工抗原。 2)混合酸酐(MA)法：含羧基化合物的羧基在三正丁胺(或三乙胺)存在时，与氯甲酸异丁酯反应，生成混合酸酐，这一活泼的中间体很容易与另一含氨基化合物反应形成酞胺键。 3)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法：含有羧基的抗原或半抗原可与N—羟基琥珀酰亚胺反应生成活化酯，再与氨基化合物偶联。 2．氨基与氨基交联 1)戊二醛法：戊二醛是一种同型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与两个氨基化合物的氨基形成Schiff氏碱（-N＝C—)，在两个化合物之向插入一个五碳桥。 2)SPDP法[17，18]：Carlsson等应用一种新型的异型双功能交联剂N—琥珀酰亚胺基—3—(2—吡啶基二硫)丙酸酯(简称SPDP)进行蛋白质与蛋白质之间的交联或标记，此反应机理可分为以下四个步骤： 1 SPDP与第一种蛋白质(HRP)的氨基反应，引入保护基—硫醇基，得产物(A)： ②SPDP与第二种蛋白质(IgG)的氨基反应，同反应(1)，引入保护基——硫醇基，得产物(B)： ③用还原剂二硫苏糖醇(DTT）．除去(A)或(B)中的2—硫醇吡啶保护基，得到含巯基的(A)或(B)： ①在含巯基的(C)与含硫醇吡啶保护基的(B)之间，通过巯基与二硫键的交换作用，形成(C)与(B)的蛋白——蛋白结合物： 3)其它双功能交联剂，如二异氰酸甲苯(TDl)、苯醌（BQ)和氟二硝基苯砜(FNP5)等也可用于两种含氨基化合物的交联。 3．巯基(-SH)与巯基(-SH)或巯基(-SH)与氨基、(一NH2)的交联[l9] 1)苯二马来酰亚胺(N；N’-O—Phenylenedimaleimide，PDM)法：PDM是一种同型双功能交联剂，主要用于“—SH”与“—SH”的交联。 马来酰亚胺不仅可与巯基反应，而且可与氨基或羟基反应，当在相同的温和条件下进行反应时，PDM与蛋白质分子中的一SH反应最快，这对保护酶活性相当重要，同时，所形成的交联产物也很稳定，可以满足对交联结合物的要求。用PDM进行交联的方法主要分为两步，而对欲进行交联的两种蛋白质必须都具有一SH。第一步反应是首先用过量的PDM活化处理第一种蛋白，此时，PDM分子中的一个马来酰亚胺基先与第一个蛋白的一SH反应，而同一个PDM分子中的另一个马来酰亚胺基则保持原型不起反应，这是因为使用了过量的