乳酸杆菌的培养与分离

乳酸杆菌的培养与分离 甘肃省动物营养研究所 李 青 罗继学 乳酸菌添加剂在促进畜禽生长，增进畜禽健 康和改善青贮饲料品质等方面有良好作用。为 此，我们结合青贮饲料生产实际，采用液体培养和 固体培养等方法，培养、分离、筛选了 !型乳酸菌 菌种，并确定其适宜的培养条件，为青贮饲料乳酸 杆菌制剂的生产和应用提供了参考。 " 材料与方法 "#" 培养基 采用西红柿汁琼脂培养基，即西红 柿汁 $%% &!、葡萄糖 "% ’、酵母 "% ’、盐溶液 "号 ( &!、盐溶液 ) 号 ( &!、蒸馏水 *%% &!、琼脂 "( ’ （液体培养不加），+, *。 "#) 培养分离筛选的技术路线及措施 采样! 增殖培养!平板分离!第二次增殖培养!第二次 平板分离!第三次增殖培养!第三次平板分离! 初筛（定性和半定量测定）!复筛!再复筛!平板 分离!得出较优菌株（每样 " - .株）!进一步做 生产性能试验或作为育种的出发菌株，必要时还 需做毒性试验等。 "#)#" 采样 以生产青贮饲料乳酸菌添加剂为 目的，通过综合分析和筛选比较确定从发酵植物 中进行采样，主要采集泡菜、浆水、酸菜、青贮饲料 当中的乳酸菌样品。 "#)#) 增殖培养 开始采集的样品中一般都杂 居着多种微生物。为了培养分离出生产所需的专 用乳酸菌，首先需进行增殖培养，以扩大微生物数 量，增加分离机率。增殖培养采用液体培养，共进 行 .次，且培养一次、分离一次。 "#)#. 分离培养 通过增殖培养仍达不到纯化 目的，仍有其他杂菌与之共存，为了取得所需的乳 酸菌纯种，需进一步进行分离培养。根据实验室 条件，采用固体培养平板划线法进行分离培养。 同时为了提高分离纯度，对培养基及环境条件做 了进一步的研究控制。 "#)#$ 营养条件及环境的控制 为了提高筛选 效率，除增殖培养时应控制增殖条件外，在纯种分 离时，培养条件对筛选结果影响很大，更需要注 意。具体分述如下： "#)#$#" 控制营养成分 培养基中的营养成分 主要指氮、碳、维生素及无机盐等。根据乳酸菌的 发酵原理，采用蛋白胨、酵母膏、葡萄糖为主要营 养来源的培养物。 "#)#$#) 控制培养基的酸碱度 各种微生物生 长繁殖所适宜的酸碱度不同，乳酸菌所需最适 +, 在 * - *#(之间。 "#)#$#. 添加抑制剂 采用能促进乳酸菌生长， 而抑制其他菌生长的碳酸钙、西红柿汁及醋酸盐 做抑制剂。 "#)#$#$ 控制培养温度 青贮饲料用乳酸菌多 属低温发酵菌，培养温度以 )/ - .) 0为适宜。 "#)#$#( 控制通气条件 乳酸菌为厌氧菌，需在 厌氧条件下培养。根据本课题实验条件，采用化 学法吸收氧气，即利用焦性没食子酸与氢氧化钠 反应，将氧吸去。 "#)#( 菌株筛选 培养分离后，每个样品获得两 株较优的菌株。为了使乳酸菌有互补作用，将已 获得的 $个样品的菌样按 " 1 "的比例进行混合， 共制成 *个混合菌液，从中筛选获得菌株 "%株。 "#)#* 菌株的驯化诱变 经过培养、分离、筛选 的菌株称为野性菌株，必须进行人工育种，得到变 异菌株。采用驯化与诱变的方法进行培育。 "#)#*#" 驯化 将筛选出的菌种分别接种于 )% 2、$% 2的苜蓿浸汁培养基中，进行培养驯化。 "#)#*#) 紫外线诱变 将乳酸菌悬浮液 ( &!置 于净化台中，进行紫外线光源照射，每次 "( &34， 诱变时搅拌均匀，使菌悬浮于悬浮液中。 "#. 发酵培养方法 采用液体培养和固体培养 两种。 "#.#" 液体发酵培养 按培养基的配方称取各 种原料，加入蒸馏水使之溶解，再加入西红柿汁与 醋酸盐类抑制剂，调节 +,为 * - *#(，进行高压灭 —)"— 中国饲料 )%%)年第 (期 万方数据 菌 !" #$%，取出置入无菌操作台中自然冷却，再倒 入试管中约 & ’ (" #)进行接种。接种采用接种 环刮取少许的菌丝，伸入盛有培养基试管中轻轻 搅动，使菌丝完全溶解于液体培养基中。或者用 吸管吸取菌悬液 "*& #)注入液体培养基中，轻轻 摇匀。用棉塞塞紧试管口，放入恒温箱中在 !+ ’ !! ,的温度培养发酵 -. /。 (*!*+ 固体发酵培养 采用平板划线法。首先 按培养基的配方称取原料，加入蒸馏水溶解，再加 入西红柿汁与醋酸盐类抑制剂，调节 01为 2*&后 加入琼脂，进行高压灭菌 !" #$%，取出置入无菌操 作台中，冷却后倒入平皿或试管中（倒入试管后倾 斜放置），自然冷却至凝固后接种。将接种环伸入 菌悬液中，取出后在平皿或试管斜面固体培养基 上来回轻轻的划线。划线完毕后进行排氧封固培 养。试管斜面培养采用大试管套小试管的方法。 称取 ( 3的焦性没食子酸倒入大试管中，再放入 数粒小玻璃珠，将接种后的小试管放入大试管中， 吸 (" 4 5671沿大试管边注入大试管底部，迅速 用橡皮塞把大试管口塞紧。放入恒温箱于 !+ ’ !! ,温度培养发酵 82 /。平面皿固体培养采用 凡士林与石腊封固平面皿周围的方法。称凡士林 与固体石腊各一半混合放入铁器中置酒精灯上加 热融化成液体状备用。称取 ( 3 焦性没食子酸， 用两层细纱布包住放在倒置的平面皿盖上，将接 好种的平面皿底倒置扣于平面皿盖上，注意使焦 性没食子酸与接好种的固体培养基不要接触，然 后吸 ( #) (" 4 5671，揭起平面皿滴入包焦性没 食子酸纱布上，迅速盖住后用注射器吸取融化好 的液体石腊，均匀地注射涂于平面皿边缝处封固， 使内外空气完全隔绝，放入恒温箱于 !+ ’ !! ,温 度培养发酵 82 /。 (*- 性能测定 (*-*( 菌种生长量的测定 采用直接计数法（全 数法）。每个菌株取 ( #)菌液，加 9 #)生理盐水 混匀后从中再取 ( #)，再加生理盐水 9 #)进行 二次稀释，然后置于载玻片上，在显微镜下观察， 载玻片面积 ( :#+，每次平均观察 +" ’ !"个视野 后代入计算。即：每 #)原菌液含菌数 ; 视 野中的平均数 ( :#+ <视野面积 = ("" =稀释的倍 数。 (*-*+ 杆菌形态 采用革兰氏染色法。 (*-*! 01值 采用精密 01试纸测定。 (*-*- 菌数的测定 活菌数和细菌总数的测定。 (*-*& 实验室青贮试验 采用小塑料袋袋装试 验。以青玉米和苜蓿为原料，液体乳酸菌为添加 剂，按 ("""：-的比例添加。 + 结果 采用液体培养和固体培养的方法，经过几次 增殖培养和分离培养后，又进行初筛和复筛共获 得 -.株菌株（(瓶 (株）。通过鉴定属真细菌目乳 杆菌科，为 )型乳酸杆菌。每株经过涂片染色，在 显微镜下观察，细胞形态呈杆状，大小为 !*" ’ .*" = "*8 = (*"!#，单个或呈短链，不运动，革兰氏阳 性。培养特征为，琼脂斜面生长稀薄；肉汁培养混 浊，有絮状物，石蕊心牛奶凝固；琼脂平板培养生 长菌落小，白色、扁平、圆锯齿形（光学显微镜照 片）。通过直接计数法对菌种生长量测定，每个菌 株含菌数都符合。即：(号样菌液每 #)含菌 数为 & = ("2；+号样菌液每 #)含菌数为 2 = ("2；! 号样菌液每 #)含菌数为 (" = ("8；- 号样菌液每 #)含菌数为 (" = ("2；&号样菌液每 #)含菌数为 . = ("2。达到了原活菌数的要求。 在实验室进行小袋袋装青贮试验，其结果不 论气味、色泽、质地均优于对照组。其中以 !、-、& 三个菌种最好。特别是与日本乳酸菌添加剂相比 较差异不显著，见 (。 表 ( 青贮饲料感官评定结果 试验处理 感官观察结果 01值 一（(号菌样） 黄、绿色、味甘酸香、柔软疏松 & 二（+号菌样） 暗黄、绿色、味酒香略酸、疏松 & 三（!号菌样） 绿色稍黄、醇香味浓、疏松柔软 & 四（-号菌样） 绿色淡黄色亮、甘醇香味、柔软疏松 & 五（&号菌样） 绿色淡黄色亮、酒香味浓、柔软疏松 & 六（对照组） 褐绿色、酸略带霉味、质地疏松 & 七（日本样） 黄绿色、果香味、质地疏松 & ! 小结 综上所述，)型乳酸菌培养发酵的最适条件 为：西红柿汁琼脂培养基，温度为 !+ ’ !! ,，发酵 时间液体培养发酵 -2 /，固体培养发酵 82 /。乳 酸菌含量大于 2 = ("2 < 3。通过扩大培养后，可直 接添加于青贮饲料中。 ［通讯地址：兰州市中山路 (99 号，邮编： 8!""!"］ —!(—+""+年第 &期 中国饲料 万方数据 乳酸杆菌的培养与分离 作者： 李青， 罗继学 作者单位： 甘肃省动物营养研究所 刊名： 中国饲料 英文刊名： CHINA FEED 年，卷(期)： 2002(5) 被引用次数： 9次 本文读者也读过(2条) 1. 谈重芳.王晶晶.李宗伟.常胜合.秦广雍.王雁萍.蔡义民 西北部分地区草样中微生物多样性及乳酸菌种群的 研究[期刊论文]-安徽农业科学2010,38(17) 2. 卢小平.Lu Xiaoping 筛选乳酸杆菌优良菌株的研究[期刊论文]-中国饲料2001(9) 引证文献(9条) 1.张建梅.胡顺珍.穆熙军.谢全喜.谷巍 一株具有产酸能力的芽孢杆菌的筛选及性能检测[期刊论文]-家畜生态 学报 2012(1) 2.贺晓龙 乳源乳酸菌的分离鉴定与抑菌效果观察[期刊论文]-畜牧与兽医 2011(9) 3.俞伟辉.王永奇.郭荣富.李静 北京雏鸭盲肠主要菌群变化规律的研究[期刊论文]-饲料博览 2009(5) 4.余汝华.莫放.赵丽华.冯全禄.马红 切碎和揉切对玉米秸秆青贮饲料发酵特性的影响[期刊论文]-中国畜牧杂 志 2007(15) 5.肖定福.胡雄贵.李文平.姜卫星 黄腹角雉源乳酸菌的筛选与特性研究[期刊论文]-经济动物学报 2007(2) 6.王友湘.陈庆森.阎亚丽 用于乳酸菌分离鉴定的几种培养基的筛选及应用[期刊论文]-食品科学 2007(9) 7.陈理银.李朕杰.郭文博.杨茜 液态饲料对超早期隔离断奶仔猪肠道微生物区系的影响[期刊论文]-饲料研究 2006(6) 8.张瑞强.王红宁.黄勇.赵应望.段少军 牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及PCR-16 S rDNA鉴定[期刊论文]- 中国兽医科学 2006(5) 9.李相前.胥传来.谢正军.姚国 微生物青贮添加剂菌种的优化[期刊论文]-黑龙江畜牧兽医 2003(12) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgsl200205006.aspx