醋酸甲地孕酮去氢氢化可的松与环糊精相互作用的光谱法研究及分子模拟（可编辑）

醋酸甲地孕酮去氢氢化可的松与环糊精相互作用的光谱法研究及分子模拟（可编辑） / : :. ,..浙江工业大学 学位原创性声明 本人郑重声明:所提交的学位论文是本人在导师的指导下,独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外,本论文不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不含为获得浙江工业大 学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献 的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 日期:弘;年月..日 作者签名:船,砀 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允 许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 、保密口,在一年解密后适用本授权书。 、不保密口。 请在以上相应方框内打“寸’ 作者签名:函。弘 日期:汐,多年,月;?日 日期:?,多年石月日 导师签名:名占节浙江工业大学硕士学位论文 醋酸甲地孕酮/去氢氢化可的松与环糊精相互作用的光谱法研 究及分子模拟 摘要 论文采用实验与计算机模拟相结合的方法,研究了醋酸甲地孕酮/ 去氢氢化可的松两种甾类药物分别与环糊精形成的包合物。实验运用 多种手段,包括紫外可见.分光光度法、红外光谱法、圆二色谱法以及 核磁共振法表征了包合物,并测定了包合物的平衡常数和热力学。 计算机模拟在分子理论水平上描述了包合物主客体间的相互作用,并 与实验结果相比较。 甾类药物是临床上一类重要的药物,但是药物水溶性不佳。将其 与环糊精包结后可以增加药物的水溶性。实验以醋酸甲地孕酮 ,和去氢氢化可的松,研究对 象,分别采用、丫环糊精、丫一和、,一二甲基.一环糊精、 包结。首先,利用紫外分光光度法以及圆二色谱法表征:同时,运用 .修正方程计算各包合物在常温条件下的平衡常数,得 到结果分别为:. ~、. 一、. 。和. 一,并 控制水浴温度:?、?、?,依据范德霍夫方程得到热力学参 数,分析结果发现四种包合物的包合过程驱动力均主要为焓驱动,且 包合过程为白发产生。然后,采用饱和水溶液法制各得到四种环糊精 包合物,运用红外光谱法、核磁共振法进一步表征分析包合物,研究 药物与环糊精的相互作用方式及作用部位。实验表明与及浙江工业大学硕士学位论文 包合时,显示均为药物的环与空腔作用较强;与.包 合时,环部分与空腔的作用较强;而与则是其环与空腔 作用明显。 另外,运用对接方法成功模拟研究了两种甾类药物与环 糊精的包合物中主客体间的相互作用,探讨了/与环糊精之间的 相互作用机理。模拟结果表明,与.较其与一、/间的结合能 低,对较与的结合能低,结合能越低说明相互 作用越强,结合物稳定性越高。通过模拟结果的分析,发现的 环部分在环糊精空腔外,靠近空腔大口端,其环在小口端;的 环部分完全进入的空腔,而环在其腔外,靠近空腔大口端, 而与所得结果为环部分进入空腔内,其环部分靠近大 口端。故对接所得结果与实验结果基本一致。 对接方法是半柔性对接,与实际实验有一定区别,为了 更切合实验条件,采用的十力场在水相中模拟对接得到 最稳定结构,并进一步做了分析研究。结果表明氢键作用、疏水 作用以及电荷转移作用都对包合物的形成具有关键作用。 关键词:醋酸甲地孕酮,去氢氢化可的松,环糊精包合物,光谱,分 子 模拟 浙江工业大学硕士学位论文 / , /. . , .. . , 固 . , ? ..~,.一 .~.,, . ,. / . ;. ..,. , . : ,,, , 浙江工业大学硕士学位论文 目录 摘要?. .??............??.......,.,,?..?.....。.,..,.......... 。..........?..?..............?。......... 第一章绪论.. .环糊精及其衍生物概述? ..天然环糊精的结构与性质??. ..环糊精衍生物的特征与性质?一 .环糊精包合物的研究现状与方法. ..环糊精包合物的制各及表征方法 ,.环糊精包合物的分子模拟方法? .甾类药物及其包合物概述. ..甾类药物的结构与性质? ..甾类药物的环糊精包合物之研究现状? .本论文的思路及方案 第二章光谱法研究环糊精与醋酸甲地孕酮、去氢氢化可的松的包 合作用??一 .前言.实验部分. ..仪器和试剂 ..溶液的配制..紫外分光光度法和圆二色谱法的测定. ..物理混合物和包合物的制备?. ..红外表征 ..核磁共振法表征 .结果与讨论??.. ..检测波长范围的考察? ..紫外分光光度法和圆二色谱法测定?. ..包合物的平衡常数及热力学参数的测定??. ..环糊精包合物的红外表征??浙江工业大学硕士学位论文 ..核磁共振法表征 .本章小结一 第三章环糊精包合物的分子模拟及分析?.. .前言??. .模型的构建及模拟方法参数的设置..醋酸甲地孕酮、去氢氢化 可的松及环糊精结构模型的构建一 ..主客体对接及包合物结构优化. .结果与讨论??. ..对接结果分析? ..模拟结构分析? .. 分析??. .本章小结.. 第四章结论与展望. .结论.展望参考文献攻读硕士学位期间已发表的论文:.. 致谢?..浙江工业大学硕士学位论文 第一章绪论 .环糊精及其衍生物概述 ..天然环糊精的结构与性质 环糊精,是在无水条件下,经葡萄糖基转移酶发酵后得到的 一组环状的低聚糖,通常含有.个一吡喃葡萄糖单元,各葡萄糖单 元均以。,. 糖苷键首尾相连成环。由于糖苷键不能自由旋转,环糊精的立体空间结构并不是 简单的圆筒形,而是内空去顶的锥形圆筒状结构,如图.所示。 图卜 的立体结构.? 自年,.首次从发酵液中成功获取以来,有关环糊精的制备、 性质和应用等方面已取得了巨大的进展。环糊精已被广‘泛应用于医药、食品、农 业、化妆品等领域。目前,研究较多的为含、、个葡萄糖单元的环糊精,分别 称作【一、.和丫一,它们的物理化学性质及结构参数见表.。浙江工业大学硕士学位论文 表洳、、勺物理化学性质及分子结构参数【】 、、 结构为环状空腔结构,.位上的伯羟基位于环状空腔的小口端; 一、?位上的仲羟基则位于空腔的大口端,其中.位的伸羟基是外向的,指向 顺时针方向,.位的仲羟基偏向空腔的中心轴方向。空腔内由于.,.氖键屏 蔽作用形成疏水区。因此,环糊精分子形成空腔外部包括顶部和底部亲水,内腔 疏水的独特结构。环糊精结构中糖苷键中氧原子上的游离电子对更趋向于空腔内 侧,产生较高的电子云密度,而呈现一定碱的特点。的独特结构与性质 使之成为~种重要的药物载体,与药物形成包合物,可以提高药物的水溶性和稳 定性。在包合过程中,环糊精内部高能量水分子移出产生驱动力,此外还包括其 他驱动力,如范德华力、氢键作用、疏水作用等弱作用力。并且,客体分子的极 性大小、电离状态、手性立体结构等均对包合过程有一定的影响。由于及其 衍生物的空腔大小适中,能与大多数药物分子相匹配,使其得到较为广泛的应用。 浙江工业大学硕士学位论文 ..环糊精衍生物的特征与性质 分子的空腔直径大小较适合包合药物分子,且成本较低,对药物制剂有 重要的应用价值。然而天然环糊精本身存在一定的局限性,如:分子中一个 葡萄糖单元上的易与相邻葡萄糖单元上的.产生氢键作用,可使得整个环 糊精分子中的仲羟基形成一个首尾相接的分子内氢键【引,整个环糊精分子成为一个 刚性较强的结构,导致其具有溶解度不佳,与其形成包合物,最大溶解度也仅为 .%,使之在药剂学中的应用受到一定的限制。为了进一步改善环糊精的性质, 适应不同的需求,研究人员对环糊精分子进行化学修饰得到环糊精衍生物。环糊 精上的一经化学修饰后,能增大环糊精的水溶性。多年来,人们已相继设计、 合成了各种衍生化的环糊精。 环糊精衍生物主要是通过对天然环糊精上的羟基进行化学修饰,引入新基团, 以调节环糊精的水溶性,改变其包结配位能力等。众所周知,分子间形成氢 键是其水溶性小的主要原因,几乎所有的化学修饰或酶修饰,只要?的任一 被新基团??包括疏水性烃基、芳基醚基、酯基取代,都会使其溶解度大大提高; 分子问氢键也是其具有肾毒性的主要原因,因而经基团修饰可以改变环糊精 的安全性;另外衍生化后环糊精的空腔形状有所改变,也可改变包结物的稳定 性。因此,衍生化环糊精具有的特征主要表现在:增加药物的溶解 度;提高药物 的稳定性:促进药物吸收,减轻药物对机体的刺激性;作为缓释和靶向制剂的载 体;提高药物的生物利用度等。 下面简要介绍几种常见的环糊精衍生物【】:.二甲基..环糊精、羟丙基一一 环糊精、磺丁基..环糊精。 .二甲基一.环糊精是高水溶性环糊精衍生物,对许多疏水性药物均 具有增溶效果。甾类化合物与包合后,其溶解度会增加~倍。但这种 环糊精衍生物的价格昂贵, ‘般允许其有少量的其他的异构体,如:,.或,.二 甲基一。 羟丙基一.环糊精??是纯度较好的羟烷基环糊精衍生物之一。其溶血性 较大大降低,且其非胃肠道给药途径的耐受性良好,.肛具有良好的 增溶能力。但被其包合后的药物所得到的溶液稳定性不甚理想。 磺丁基一.环糊精..是一种高水溶性的阴离子型环糊精衍生物。它主浙江工业大学硕士学位论文 要与药物形成非共价包合物,以提高药物水溶性及生物利用度, 减少药物刺激性 等。其对含氮药物有特殊的亲和力,现在主要应用于注射用药、鼻部、眼部用药 等。 .环糊精包合物的研究现状与方法 自世纪初环糊精被发现以来,在其制备、性质及应用等方面取得了较大进 展。目前,环糊精较多被用于分析化学、医药、食品、化妆品等领域,其中在医 药学方面,环糊精主要被用来制备药物的环糊精包合物,提高药物溶解度、生物 利用度、化学稳定性及掩盖不良嗅味、刺激性等。 环糊精包合物的形成主要受以下几种因素的影响【】:主客体分子的大小, 客体分子的大小需与环糊精空腔相匹配才能形成稳定的包合物;分子极性,当 客体分子的极性即疏水性大,则容易与疏水性的环糊精空腔相结合,反之,则包 合能力较弱;主客体分子电荷,这主要是针对衍生为离子型环糊精而言的。主 客体分子带相反电荷相较于带相同电荷形成的包合物更加稳定;备包合物时 所用介质及添加剂:主客体间相互作用力。日前,认为包合物的主客体间主要 存在疏水性作用力、静电引力、氢键作用力、形成包合物时的环张力及溶剂表面 张力等,且包合过程往往是多种作用力的协同作用,作用力强者,包合物越稳定。 目前,药物的环糊精包合物的研究过程中主要涉及的研究内容有:环糊精包 合物的制备与表征,稳定性和热力学参数的测定,包合物空间构型的研究以及包 合物药动学及药效学性质的研究。其中,前面三项已成为药物分析学科研究的热 点之一。 .. 环糊精包合物的制备及表征方法 随着人们对环糊精包合物的不断深入研究,包合物的制备方法丰富多样。针 对不同性质的药物客体,传统制备方法主要包括 ‘?】:饱和水溶液法又称共沉淀 法、研磨法、喷雾干燥法、冷冻干燥法等,其中饱和水溶液法较为常用。此外, 还有旋转蒸发浏】、超临界流体法以及中和法四等。环糊精包合 物的主客体性 质,以及制备过程中选择的介质均对包合物的制备有一定的影响。 环糊精包合物的表征常用的方法有:紫外分光光度法、荧光光谱法、红外 浙江工业大学硕士学位论文 光谱法、核磁共振法、色谱法、热分析法、.射线衍射法等见表.。 表包合物表征方法 在环糊精包结物研究过程中,包合比、平衡常数以及热力学参数的测定也是 非常重要的。常用的测定技术有:紫外分光光度法、荧光法、差示扫描量热法, 液相色谱法、质谱法等。涉及的具体方法主要有:相溶解度法、等摩尔法、摩尔 比法、.法【等。 相溶解度法是依据相溶解度等温曲线确定包合比。等温相溶解度曲线分为、 】 、、、五种类型‘,其中符合型时,包合比为:。 采用相溶解度法测定槲皮素与、..的包合比,结果显示两种曲线图均浙江工业大学硕士学位论丈 符合型,说明两种包合物的包合比均为:。等‘通过相溶解度法测 定了一,一二氢醉椒素与?的相溶解度曲线,发现其等温相溶解度曲线符合 型。如果相溶解及度曲线符合型时,其包结平衡常数可以根据公式? 计算。 :一型善: 砾丽 式中,是指在没有环糊精存在下客体分子的溶解度。 等摩尔法和摩尔比法是两种运用光谱法测定包合物的包合比和平衡常数的方 法。前者又叫连续递变浓度法,测定时维持主客体总浓度不变,调节两者浓度比 例,通过吸光度差对环糊精摩尔分数作图,其中转折点处的浓度比即为包合物的 包合比。掣采用等摩尔法测定了丁哌卡因与.??的包合比和平衡 常数。摩尔比法是固定其中一种组分多为客体分子,改变另一组分浓度,测定吸 光度值,并以环糊精浓度和吸光度作图,同样以转折点计算其包合比。 法简称?法,已被广泛用于测定包合物的包合比及平衡 常数,其修正方程可用于处理紫外分光光度泫、荧光光谱法及核磁共振法获取的 信息数据,计算包合物的包合比及稳定常数。对:包结物,方程为: .. ‘二 .?????了?广 一一?????????下???气???? ? ?× × ? × 式中,? 代表包合前后,主客体分子的摩尔吸光系数之差;代表客体分子的 起始浓度,代表环糊精的起始浓度;代表包合前后吸光度之差当以荧光 光谱法检测时,为荧光强度差卸。因此,以/鲋对/作图,两者间存在着 良好的线性关系,表明形成了:包结物,依据截距和斜率计算出包结平衡常数。 对于:包结物,/削对/之间具有良好线性关系,依次类推。王睿 等曾提出运用.方程计算包结比和包结常数时,测定体系应符合》【 的条件,认为最低主客体摩尔浓度比以相差一个数量级为佳。目前,.法已得 到广泛应用,等【”】用?法研究柯因与的包合作用,发现其包 结比为:,并计算其在不同温度下的包结平衡常数。张敏等【】用.法研究黄 曲霉素与的包合物,发现低环糊精浓度下,环糊精与客体形成:包合物, 而在高浓度时,则形成了:的包结物,揭示了主客体分子问的多级包合。浙江工业大学硕士学位论文 ..分子模拟方法 随着计算机技术的发展,分子模拟技术被广泛运用于不同的研究领域。由于 实验方法存在局限性,不能从原子结构角度对包合物进行分析。为了更深层次地 研究环糊精包合物,了解包合原理与结构性质,确定或预测包合物分子三维结构 及体系稳定性,近年来分子模拟及理论计算也用于包结物的研究。 常见的环糊精包合物分子模拟方法主要为依据薛定谔方程 ,,量子力 的理论计算方法,包括分子力学方法 , 学方法 ,、蒙特卡洛模拟方法 、分子动力学方法 ,/譬。 分子力学】,以经典牛顿力学为理论基础,依据分子内部作用力的 方式不 同分为不同的模型包括、等,计算优化分子空间结构。 量子力学,一种研究微观粒子运动规律的物理学分支学科,主要通过近 似求解薛定谔方程,获取分子立体结构、构象。主要方法包括:从头算法 、半计算法 、密度泛函理论 ? ,其中半经验法耗时较短,适用于大体系计算。 分子动力学刖,在给定分子势能与力场的情况下,用解经典力学牛顿方程 的方法研究分子的运动和构型空间。法取舍构象时的主要考虑因素包括能量下 降的变化和部分能量上升的构象,达到全局优化,模拟体系能量的分布状况,测 定体系热力学参数,结合了微观与宏观模型。 蒙特卡洛模拟法,这是一种以概率和统计方法为理论基础的随机模拟方 法,其经验力场与分子力学及量子力学相同。此法容易确定计算误差,且工作量 较少,耗时短。 上述分子模拟技术各有利弊,在实际计算中,需依据不同的体系 及研究目的 选择合适的理论模型,得到相对精确的分子模拟结果。 计算机模拟除了上述分子模拟计算之外,分子对接也是研究主客体相互 作用的过程中常用的方法之一。这种方法主要在理论上通过搜索排序,在得到的 众多可能性结构中筛选出较优结构,以得到天然包合物结构的近似构象。分子对 接中常用的计算方法主要有:局部搜索算法包括遗传算法和蒙特卡洛算法、全局 快速傅里叶变换算法以及模拟退火等。浙江工业大学硕士学位论文 分子对接方法义分为:柔性对接、半柔性对接和刚性对接。目前,分子对接 法研究环糊精包合物时常采用半柔性对接,即设定大分子为刚性,小分子设置为 柔性的。随着计算机技术的发展,分子对接软件有了很大的发展,现有的软件有: 、、、、、、等。 .甾类药物及其包合物概述 ..甾类药物的结构与性质 甾类化合物是一类重要的天然有机化合物,广泛存在于生物体组 织内,具有 重要的生物学功能,在医药领域受到的关注度较高。甾类激素是其中一种重要的 甾类药物,主要包括性激素和肾上腺皮质激素,在维持生命,调节生理机能方面 有重要的作用。从化学结构角度出发,这类药物是一种环戊烷多氢菲碳骨架的化 合物群,其结构中均包含个六元环及个五元环,分别称为、、、环, 其母核结构见图.。然而,甾类药物的水溶性相对较差,限制了其药物剂型与药 物疗效。 图甾类化合物母核结构. ..甾类药物的环糊精包合物之研究现状 由于甾类药物的重要医药价值和普遍较低的水溶性特质,其环糊精包合物的 制各与研究越来越受到重视,以提高其在水中溶解度,增强稳定性,加大生物利 用度。许多学者己开展了甾类药物的环糊精包合物的研究,主要涉及甾类药物与 环糊精相互作用的研究,包合物药理、药效的研究。 谷福根等【运用紫外分光光度法、圆二色谱法、红外光谱法及.射线衍射法 表征了前列素与包合物,并测试其稳定性。王大伟等采用相溶解度法浙江工业大学硕士学位论丈 测定了左炔诺孕酮与??的包合比为:,通过饱和水溶液法制备出了 包合物,并采用紫外光谱与红外光谱表征,验证了包合物的形成。 研究结果表明,甾类药物与环糊精及衍生物可以形成不同包结比的包合物【, 如:、:、:.、:等。 】采用核磁共振法测得在水溶液中肛与氢化可的松的包合比为 ::而. 等酬运用相溶解度法测得与氢化可的松形成:包结物。 最近,分子模拟技术在甾类药物与环糊精包结物研究中也得到应用。主 等将二维核磁技术与分子动力学模拟相结合研究去氢氢化可的松、雌 三醇以及炔雌醇与的包合物的包结作用。姚雪霞采用了分子动力学 模拟的方法预测了和雌二醇的包合模式,分析结果得出这种包结物的包结存 在环取向和一环取向两种方式,均是从环糊精空腔大口端插入,且都形成了稳 定的包合物。 .本论文的设计思想 综上所述,甾类药物与环糊精包合物的实验研究手段已趋成熟。分子模拟方 法作为一种理论研究工具,可以直观地反映包合物的结构,呈现主客体间相互作 用力及作用方式。因此,结合实验与分子模拟两种研究手段,能够有效而全面地 分析包合物内主客体间的相互作用。 ‘本论文选用醋酸甲地孕酮 ,和去氢氢化可的松 ,作为研究对象,拟采用宏观与微观相结合的方法,即实验与分子 模拟相结合的方法,研究两种药物与不同环糊精形成包合物时的主要驱动力和相 互作用力,并测定其稳定性常数、热力学参数等。具体研究内容: 采用紫外分光光度法、园二色谱法、红外光谱法及核磁共振法表征 ?、吖、?以及.四种包合物。 运用改进的?法测定四种包合物的稳定性常数并计算包结过程一的热 力学参数,探讨其包结作用的驱动力。 运用分子对接、力场进行包合物结构的模拟优化及分析,从微 观角度探讨醋酸甲地孕酮和去氢氢化可的松与环糊精及衍生物的包结作用。浙江工业大学硕士学位论丈 第二章光谱法研究环糊精与醋酸甲地孕酮、去氢氢化可的松 的包合作用 .前言 是孕激素的一种,主要用于治疗晚期乳腺癌和晚期子宫癌,对于肾癌、前 列腺癌和卵巢癌也具有一定的疗效。可以改善晚期肿瘤癌患者的癌性厌食.恶病质。 可作复方口服避孕,也可单独使用作速效避孕,具有一定临床价值。其结构式如 图所示。的主要剂型包括片剂和胶囊剂,给药途径有限。 图醋酸甲地孕酮和去氢氢化可的松的结构图 .属于肾上腺皮质激素,具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等多种药理作用。其 结构式如图.所示。目前,常见的剂型有:片剂、注射剂以及软膏剂等。 和均呈现水溶性差的特性,而环糊精包合物的形成有利于增强疏水性 药物的水溶性,从而增强生物利用度。因此,研究、与环糊精之间的相互 作用,对改善其药物剂型,增强药物药效等具有一定的临床指导意义。 目前,有关上述两种甾类药物及相关药物与环糊精包结的研究已有文献报道。 等【“采用质谱技术研究了孕酮与,发现孕酮与可形成: 和:两种包合物。马红燕等采用荧光光谱法及紫外分光光度法研究了醋酸甲羟 孕酮与?的包合物,利用改进的.法测定包结物的平衡常数,并探讨了溶 液的酸碱度、小分子溶剂及表面活性剂等因素对荧光强度的影响。王宪英等酬以 饱和水溶液法制备出黄体酮与的包合物,并证明了黄体酮一.包合物可以 浙江工业大学硕士学位论文 明显提高黄体酮的溶解度和溶出度。 .采用液相色谱法测定了等种甾类药物与、 的稳定性常数,研究表明与所形成的包合物的稳定性大于与 的包合物。主 掣】采用核磁共振与分子动力学模拟相结合研究 等甾类药物与的包合物,发现插入环糊精的空腔,并与其形成:的包 合物,二维核磁图谱中旱现出的、、、环上的多个氢原子均与环糊精 腔内的、存在耦合现象,说明可能与的包合方式存在多样性, 理论计算上也得出了包合物的几种不同几何结构,实验与理论比较对照后得到一 个相互吻合的结果。 删等运用相溶解度法、.、差示扫描量热法 研究了醋酸氢化可的松与及其衍生物的相互作用,分析发现与 形成了:和:两种包结物。 】采用相溶解度法、差示扫描量热 法、射线衍射法与力场模拟相结合研究泼尼松与环糊精的包合比、热力学 及其包结物结构。 本章我们选择和为研究对象,运用多种光谱技术研究、与环 糊精及其衍生物的包结作用,探讨其包结常数平衡常数、包结比;通过测定包结 过程中的热力学参数,探讨包结过程的驱动力。 .实验部分 ..仪器和试剂 紫夕卜一可见分光光度计公司;圆二色谱仪日本分光公司; 红外光谱仪美国尼高利公司: 核磁共振波谱仪瑞士公司;水浴锅; 醋酸甲地孕酮浙江仙琚制药股份有限公司:环糊精泰龙科技有限公司, %;丫一环糊精武汉祥和精细化工有限公司,.%:去氢氢化可的松浙江仙 琚制药股份有限公司; .二甲基.环糊精江苏昆山瑞斯克化工有限公司, .%。 其它所用试剂均为分析纯试剂。浙江大学硕士学位论文 ..溶液的配制 醋酸甲地孕酮储备液:称取适量醋酸甲地孕酮,用乙醇溶解,并定 容至 , /。 其溶液浓度为. 去氢氢化可的松储备液:称取适量去氢氢化可的松,用乙醇溶解, 并定容至 ,其溶液浓度为.× /。 ,其溶液浓度为 储备液:称取适量,用水溶解,并定容至 . /。 储备液:称取适量,用水溶解,并定容至 ,其溶液浓度为 . /。 ,其溶液浓 储备液:称取适量,用水溶解,并定容至 /。 度为./,混合溶液:吸取 储备液和一定量储备液置于 容量瓶中,用适量蒸馏水稀释,超声 ,然后在水浴锅中恒温保持 , 定容, 摇匀备用。该混合液中与的摩尔比为:~:。/.混合溶液:吸取 储备液和一定量储备液置于 容量瓶中,用适量蒸馏水稀释,超声 ,然后在水浴锅中恒温保持 ,定容, 摇匀备用。该混合液中与的摩尔比为:~:。/;.混合溶液:吸取 储备液和一定量储备液置于 容量瓶中,用适量蒸馏水稀释,超声 ,然后在水浴锅中恒温保持 ,定容, 摇匀备用。该混合液中与.的摩尔比为:~:。/混合溶液:吸取 储备液和一定量储备液置于 容量瓶中,用适量蒸馏水稀释,超声 ,然后在水浴锅中恒温保持 ,定容, 摇匀备用。该混合液中与 的摩尔比为::。 ..紫外光谱和圆二色谱法的测定 /.混合溶液、/?混合溶液、/混合溶液和/ 混合溶液的紫外光谱在紫外一可见分光光度计上,扫描波长范围为 。以相应浓度的环糊精溶液做空白溶液。 /混合溶液、/?混合溶液、/混合溶液和/浙江工业大学硕士学位论文 混合溶液的圆二色谱记录在圆二色谱仪上。扫描波长范围为 /~ ,扫描速度为 ,累计扫描次数 /,频带宽度 次。 ,.物理混合物和包合物的制备 物理混合物制备:称取适量甾类药物和和环糊精及衍生物、 和混合,保持其药物与环糊精的摩尔比为:,研磨均匀即可。 包结物的制备:称取适量、,用尽可能少量的无水乙醇溶解。然后 再 称取相应适量环糊精及衍生物?、.及,用水溶解,在?? 条件下搅拌,缓慢加入药物溶液,继续搅拌 ,在室温下搅拌 ,于冰箱中冷 藏静置 。用. 的微孔滤膜过滤。其中与的包合物取其滤液, 其余三种包合物取滤渣,分别在??烘箱中真空干燥.,既得。 ..红外表征 ,,,,以及物理混合物和包合物片的红外 光谱记录在 红外光谱仪上。 ..核磁共振谱测定 ?、?、??和?分别溶解于或, 并置于核磁共振仪上测定。参数设置为:光谱宽度. ,弛豫时间 ,重复次扫描。 测定,?两种包合物的.谱。重复扫描次, 其他参数同上。 .结果与讨论 ..检测波长范围的考察 图.是、和环糊精及衍生物的紫外光谱。由图可知,和的最 大吸收波长分别位于 和 ;而环糊精及衍生物在~ 内无吸浙江工业大学硕士学位论文 收。这表明了在所考察的波长范围内,游离的环糊精及衍生物的 存在对、 的紫外光谱测定无干扰。 《.... . . . .《 《 八, . . ~ . . 一. .. 图. 、和环糊精及衍生物的紫外光谱图 , . 。 /,.. ,. .~,×。 /, . ..紫外光谱和圆二色谱测定 依据紫外光谱的扫描,分别对、在不同浓度环糊精存在下进行紫 外扫 描,得到图谱,见图。 . . . . . . 《. 《. . ... 浙江工业大学硕士学位论文 《《 , “。。朗”? 图环糊精存在下×。 /与×。 /拘光谱图 . 由图?可知,在的两张图谱中处出现最大吸收峰,归属为 的共轭结构?一?跃迁,随着.、浓度的增加,该吸收峰均发生变化:吸 收峰强度均减弱,其中随着不同浓度的变化使的紫外最大吸收波长产生 明显的蓝移。表明两种环糊精均与发生相互作用,改变其发色基团的化学环 处 境,意味着环糊精与包合物的形成。在的两种图谱中,发现在 产生最大吸收峰,峰强度存在变化,与及混合后的吸收强 度均随环糊精浓度增大而减弱,且最大吸收波长略微蓝移,说明进入环糊精空 腔内,导致电子跃迁能级改变,与两种环糊精形成了包合物。 等删和等曾提出在环糊精空腔内时,当电子跃迁偶极矩 与环糊精对称轴平行时,出现正效应,垂直时则出现负效应。预测 了客体与环糊精空腔对称轴之间的空间位置关系。在此基础上】提出,若 客体分子发色团在空腔外,则其偶极矩与空腔轴之间的位置关系所产生的诱导 效应刚好相反空腔外的电子跃迁偶极矩与空腔轴平行时产生负效应,垂 直则产生正效应。图为醋酸甲地孕酮与去氢氢化可的松及其加入相应 不同浓度的环糊精后所得到的圆二色谱图。由其中的圆二色谱图可知 和 附近出现波峰,分别由共轭结构的【一【跃迁和位羰基的一?跃迁 处产生了正效应, 导致的。且与混合的圆二色谱测定中,在 而 处发生正 处变化不明显。而在与混合的测定中,除了 变化外, 也产生了变化,且为负效应。而的圆二色谱图中则是 在 、 处出现两个波峰,分别归属为的共轭结构的一?跃迁与 处峰出现正 位羰基基团的一跃迁,其中与混合的图谱中浙江工业大学硕士学位论文 效应, 处的峰位置出现正 /处为负效应,而在中只在 效应, 处的峰未见明显变化。这些跃迁偶极矩与环糊精空腔的空间 位置关系有待在分子模拟部分进一步讨论。 :. , :”“。~‖一\ :.、 :.? . 飞 :.?。 , \ 。 :/ 蠹:?/ 御 鎏 : / 、 /弋 昙 莩 一 ?\勘 泠一 . .。 ‰匙连 队。爻;撵 \ 一 . 乡 劣 . 图环糊精存在条件下 /和×一/的圆二色谱图 ...包合物的平衡常数及热力学参数的测定 将药物与环糊精的混合溶液分别在?、?、?温度条件下水浴锅 中 控温 左右,快速在紫外分光光度仪内扫描。以/对/作图见图., 均呈良好线性。依照?修改方程见式.,说明四种环糊精包合 物的主客体摩尔比均为:。由.方程可计算包合物的平衡常数目, 其结果见 表.,,,。由表.可知在常温时,与环糊精的稳定性常数:, 且与两种环糊精形成的包合物的稳定性常数均随着温度的升高 而降低,说明 温度降低有利于包合物的形成;与两种环糊精的包合物稳定性常 数为: 雎。且与两种环糊精的包合物稳定性也是随着温度的升高而降低, 说明此种包合物同样也是温度越低越有利于其形成。其中?时测得..的 稳定性常数为. ~,这与 .【】采用方法测得的 /测/. // /.浙江工业大学硕士学位论丈 ’基本一致。 ??稳定常数为: 以对/作图见图.,并依据范德霍夫方程见式.、计算得到药物 与环糊精及衍生物包合过程中的热力学参数:、??、?。其结果如表一所示。 ::????士?? . . ?一. 式中为固定常数,为各温度条件所得平衡常数。热力学参数小于,表明 包合过程为自发、焓驱动过程,温度降低有利于包合进行。熵值减小,说明药物 插入环糊精后其分子无序程度降低。焓变主要取决于客体分子进入空腔后的稳定 性变化以及空腔内水分子被排除空腔的过程产生的变化,焓变值大于熵变值,说 明包合物形成后稳定性的变化对包合物的形成贡献较大。由热力学参数可知,两 种药物与环糊精形成的包合物中主客体间相互作用方式主要有范德华力、氢键作 用、疏水作用等。 表包合物的、热力学参数及相关性:,:?,:一一,:?、 浙江工业大学硕士学位论文 :岛为方程的截距::为.方程的斜率::为.方程的相关系数;:.; :’为范德霍夫方程的相关系数 与; 两加曲?弱?舾如?;;筋 伽舌;?阳??加?加 , , 目 至 ? ; ’‘ ,。,.。......、..,..,,,.。。。 、 , , 图包合物的双倒数关系曲线,?、, 、.?.浙江工业大学硕士学 位论文 . . . . 亡 一. . . . . . . . . . . 厂 . . . . . . 董. 董. . . . . . . . . . . 。 , / 厂 图包合物的范德霍夫线性图 ’ . ..环糊精包合物的红外表征 图.和?分别为、、、、以及主客体物理混合 物、包合物的红外图谱。其红外图谱归属如表.??。从图中可见, 药物与环糊 精的物理混合物 ,为药物与环糊精的谱图叠加,而在包合 物的图谱中发现峰的位置均存在明显变化。 、. ~、. 、. 在的两种包合物中,的. 、. 的裂峰被掩盖,. 。处的峰均消失,说明部分甲基、亚甲 、, 基以及位羰基可能被包埋于空腔内:另外. 处的峰发生 、. 移动,.中分别移至. ,.?中则移至. ,而. 处的峰没有变化,位置移动程度不一样,表明两种环糊精对 中共轭结构部分的影响不同。浙江工业大学硕士学位论文 \/??????、厂~ \/飞,?????,厂帆、厂~一 \/厂???飞 \厂/一???、、,~ \/~?????、旷~飞,厂~一‘ \/?????~~、.厂~ 。 图.红外光谱图. :?;:丫;:吖;:;:;邙;: 、: ;、,:表环糊精的红外归属 、、 浙江工业大学硕士学位论文 表的红外归属波数/ 归属 ~、. 、 的红外结果表明,包合物图谱中. 及。 . 处的峰均被掩盖。其中..的谱图显示,共轭结构的. ~,. 处的峰移至. 处的峰没有移动,. 处的位羰基 , 峰移至. 移至. :在.的图谱中则是. . 移至. . 处的峰消失。由此表明的共轭结构与 空腔作用更加明显,并且的环很有可能已插入空腔,而 在中则是位羰基与空腔的相互作用强于环与空腔的作用。可见, 两种 环糊精与的包结方式存在差异。浙江工业大学硕士学位论文 、?//一、??????????、、厂??一 \/?、/?????????\厂~ \/????????、?、、,厂~一 \//????、.。~ \/???????~、\ 一 图.红外光谱图. :;:;:;:;:;.?;: 、: ;、?:表 的红外归属 归属 波数/ . .伸缩振动 . ,伸缩振动 . 伸缩振动 . .弯曲振动 .、. ,不对称弯曲振动 .、. ,对称弯曲振动 .,.,. ,..伸缩振动浙江工业大学硕士学位论丈 表的红外归属 波数/ 归属 . .伸缩振动 .、.、.、, 伸缩振动、伸缩振动 . 位伸缩振动 . .共轭体系中位伸缩振动 . 共轭体系对称伸缩振动 ..核磁共振法表征 法表征环糊精包合物时,可由主客体包合前后化学位移的变化证明包合 物的形成。在包合物的形成过程中,主客体之问没有形成化学键,而是靠比较弱 的分子间作用力范德华力、氢键、疏水作用力等结合在一起,因此形成包合物后, 化学位移的变化较小一般小于 ‘。图和.分别为、? 和及吖一的 谱图。由于与、及包合物分别采 用了不同的氘代试剂溶解其中、及一肛以溶解,其余以 溶解,药物包合前后核磁测定的条件不同,因此的化学位移变化不具参 考性,我们仅将其中环糊精在包合前后的原子的化学位移变化值进行分析,见 表。这些位移值的变化在一定程度上可以说明包合物的形成。环 糊精的一均 向高场移动,其中口一的.,依据文献说明从环糊精大口 端进入空腔;而包合后则.筋一,说明从小口端进入环 糊精空腔。 表环糊精在包合物形成后的化学位移变化值?乒反。唧,一雠浙江工业大学硕士学位论文 图 谱图:争;?包合物化学位移从. 到. . .。 ? 。 辞? ?. ? ? 。让: 图 谱图:;吖.包合物化学位移从. 到. . . 与的环糊精包合物得到的一维氢谱化学位移变化不甚明显,这有可 能是对包结物产生影响所致。因此,为了进一步验证.?的形成, 我们进行了.的测定。环糊精的.、.在空腔内,常常用来表征客 体分子与环糊精之间包合物的形成。由图.可知,醋酸甲地孕酮位上的 原子与环糊精的.存在耦合作用。依据文献,.图中的交叉峰说明 分 子间空间距离在. 以内。由此说明的环与环糊精大口端间的距离 较近。与的二维核磁结果表明醋酸甲地孕酮进入环糊精空腔内, 两者形 浙江工业大学硕士学位论文 成了包合物。 盯 回 ‘。‘’’’ 。。’ 。 ‘’ 一’ 图. ...的.谱 ? .: ;,: , . 谱图。 图?和为、..和、?的 与环糊精包合前后环糊精的 化学位移变化见表.。与 的位移变化均为.,表明是从大口端进入环糊精的空腔中。 与不同,在水中有一定溶解度,可以检测到 信号, 与环糊精的 检测均以溶解,包合前后的 测定条件?致,其 药物化学位移变化具有参考价值,因此将与环糊精包合前后去氢 氢化可的松的位 移变化进行了分析,见表?。与包结后测得原子化学位移变化值 普遍比与包结产生的位移变化值大,可见与前者的相互作用强。与 环糊精包结后的部分原子的化学位移向高场移动,可能是环糊精分子中富 含电子的甲氧基靠近,氧原子对质子产生了屏蔽效应。而向低场移动的则可 能是由于药物被包结后产生的局部极性变化,或者药物与糖苷元的范德华作用力 引起的去屏蔽效应引起的。其中与包结的化学位移变化中去氢氢化可的 松,,以及,,出现较大幅度地向高场移动的变化,说明这些原子与环 糊精甲氧基较靠近;而与包结后的.也存在向高场移动的现象,并 且变化幅度较大,说明的位碳与环糊精腔内作用较强。浙江工业大学硕士学位论文 ?? ? .? 图 到. 谱图:;..包合物化学位移从. . .一 、 ,??, 、 ?. ???、 一, ? 一 一 ? ‘。 ? 。 ? 、...?.,、.?一??‘ ? ? % 。。甜;二? 图 谱图:;包合物化学位移从. 到. . . 浙江工业大学硕士学位论丈 表.环糊精在包合物形成后的化学位移变化值?乒瓦唧一稚 表 在包合物形成后的化学位移变化值 为了进一步分析与的空间结构,进行了实验。由图 .可知。 、、位上的均与环糊精一有耦合,此外环上位 碳的原子与环糊精的.之间同样存在耦合,说明这些原子与环糊精的 位置接近。.谱表明的环可能进入空腔内,环靠近空腔大口端。浙江工业大学硕士学位论文图. .的.谱.、、: , ;: .本章小结 采用各种手段表征醋酸甲地孕酮/去氢氢化可的松与各自两种环糊精的包合 物,包括测定平衡常数,以及热力学参数,得到结论如下: 经、、圆二色谱以及核磁共振手段的表征,醋酸甲地孕酮与 和均可形成包合物,且的位与环糊精空腔的相互作用明显,其环 均靠近环糊精空腔大口端。另外,通过平衡常数及热力学参数的测定,得知 与环糊精的包合物的稳定性为’,与两种环糊精的包合过程均为自 发,焓驱动过程,且与两种环糊精的相互作用存在范德华力、疏水作用以及 氢键作用。 对的环糊精包合物检测手段基本与醋酸甲地孕酮的环糊精包合物检测 手段一样。由表征结果可知与.和均形成了包合物,通过平衡常 数与热力学参数的测定,得知形成包合物的稳定性?,且两种环 糊精的包合过程均为白发,焓驱动过程,与环糊精的相互作用方式同样包括了浙江工业大学硕士学位论丈 范德华力、疏水作用和氢键作用。核磁检测表明,的环在空腔内,与大口端 距离近:的环部分与作用明显,被包结在空腔内的可能性高。且药 物与的相互作用强于其与之间的作用。浙江工业大学硕士学位论丈 第三章环糊精包合物的分子模拟及分析 .前言 近年来,分子模拟技术发展迅速,运用广泛。计算机模拟有利于直观研究主 客体分子间的相互作用。越来越多的研究人员采用计算模拟技术研究分子结构, 获取分子三维结构,以便更有效、直观地分析研究对象。 在环糊精包合物的研究中,主客体空间位置关系的模拟是研究内容的重要方 面。分子模拟首先要确定包合物结构,其中分子对接是一种取得最优结构的有效 手段。舱酬等四采用格点计算模拟了阿立哌唑与羟丙基 等四将实验方法与软件模拟方法结合研究虎 肛的结构; 杖苷与.陟的包合物,发现药物的苯环进入了环糊精空腔,形成: 的包合 物。 然而半柔性埘接中小分子构象变化,大分子构象不变,与实际实验中的包合 过程存在一定的差别,因此一般需要对得到的最优对接结构再进一步的优化。在 中可以采用方法模拟,限于计算机能力,主要以理论计算。 目前此种方法引起的关注度较高,比如,删等吲采用不同的方法 成功模拟了.丁烯和异丁烯在.沸石上的作用:? 等【】则在研究 .对甲基.扁桃酸酯的手性识别中采用的方法对主客体进行模拟 并优化结构。的方法得到的结果虽精密,但是耗时较长,只能计算 较小的体系。 除上述方法外,软件也是一种较为常见的优化模拟软件, 其中包合物的研究一般以分子力学理论为依据,在力场加水分子优化包合物 结构。矗等利用软件力场研究、、与茅香醇之间 的相互作用,验证实验结论。啪等】在分子对接的基础上采用该软件, 研究柯因与.的相互作用,得知柯因的环进入环糊精空腔内。 】采用紫外、.射线衍射法、核磁共振法多种手段研究阿替洛尔与.的 包合物,并以的”力场在理论上对实验结果加以验证。相对于 方法,的分子力学模拟计算时间较短,更为高效。浙江工业大学硕士学位论文 计算机模拟包合物除了模拟其结构之外,还可被用来研究包合物内主客体问 的相互作用。其中分析是一种常见的分析主客体间氧键作用的方法。 分析,即自然键轨道分析,包括了自然自旋轨道、自然 键轨道和自然杂化轨道,可由此得到分子内、分子问超共轭相互作用。分析 主要依据二级微扰理论的‖’稳定化能来判断主客体分子问的超共轭能,计算 方法见公式?: 一, 一。鲁 肚鸭万 矩阵元,岛和岛。分别代表相互作用的成键轨道 式中,盯同矿和,巧代表 和反键轨道的能量,,。为电子供给轨道上的电子占据数。 叠’的值越大,表明电子受体轨道?和电子供体轨道之间的相互作用越强, 常常被用于描述质子接受体与供体反键轨道之间的相互作用强度 。并且,当‖’. / /时,相互作用力为强氢键作用,当. ‖’. /时为弱氢键作用删。 .模型的构建及模拟方法参数的设置 ..醋酸甲地孕酮、去氢氢化可的松及环糊精结构模型的构建 阻、初始结构取自剑桥晶体数据库【,用软件将结 构位上的羟基换成甲基,得到初始结构,三个环糊精的结构分别 用 .,,软件包【运用方法进行初优化, 以矫正不合理的键长键角等,醋酸甲地孕酮和去氢氢化可的松的 初始结构采用 软件构建,药物结构先用方法粗优化,再用/? 水平优化至矩阵无虚频优化后的结构见图.。