293T细胞培养方法

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2009, 31(1): 130 http://www.cjcb.org 293T细胞的培养 293T细胞是由293细胞派生, 达SV40大T抗 原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过 表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。 293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成 分要求并不高。培养条件为: 完全培养基: 高糖 DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培 养基, 10% DMSO。 传代方法为: 1．吸掉 293T细胞培养瓶内的培养液; 2．吸取适量的无 Ca2+和Mg2+的 PBS, 轻轻把 贴壁的细胞洗两遍; 3．加少量的 0.05%胰蛋白酶 -EDTA (一般 25 cm2的培养瓶加 1 ml, 75 cm2的培养瓶加 2~3 ml), 放 到培养箱温育 20 s; 4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并 吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液; 5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。 值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的 干扰就可能使它们脱落。所以, 在更换新鲜培养液 或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进 去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶 -EDTA即可轻松把细胞消 化下来, 不需要消化很长时间。有些同学反映 293T 细胞容易结团不易被吹打开来。如果遇到这样的情 况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿 1 ml移 液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可 见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚 在一起。一般 293T细胞可以长在塑料的培养瓶底 面上直到 90%融合, 再以 1∶4~1∶8的比率传代。 合适的传代周期为 2~3天。传代过程中, 消化的时 间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培 养液中止。完成传代后放入培养箱前, 应该把培养 瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞 都聚在中间或者四周。冷冻 293T细胞的冻存液可 以用 95%小牛血清加 5%二甲基亚砜, 复苏率很高。 293T细胞的生长状态直接关系到包装病毒和转 染的效率, 应尽量选择传代次数少, 培养总时间短的 细胞。从细胞形态上看, 相差显微镜下观察立体感 强并且形态良好的细胞产病毒率或者转染效率都很 高。 虽然 293T细胞的应用非常广泛, 几乎每个实验 室都有一株自己的 293T细胞株, 但是经常有同学提 出: 为什么在正常的培养条件下, 细胞却很难传代下 去, 包装病毒效率很低, 对转染效率也不满意呢？ 事实上, 引起类似问题的元凶是一种生物界最小 的原核细胞生物－支原体。支原体污染后, 它们不 会使细胞死亡而是与细胞长期共存, 培养基不发生浑 浊, 细胞无明显变化, 外观上给人以正常感觉, 但事 实上细胞正在受到到多方面影响, 如引起细胞变形, 影 响DNA合成, 抑制细胞生长等。我们曾经收集到四 株分别来自四个不同实验室的 293T细胞, 经检测均 为支原体阳性, 令人惊讶的是这四株细胞都已经不是 典型的 293T细胞形态, 每两株之间比较竟然形状各 不相同, 很难相信这是同一种细胞！这些支原体阳性 细胞普遍传代周期长, 显微镜下观察细胞碎片多, 长 期支原体感染已经使这些细胞羸弱不堪, 胞内DNA 和蛋白质合成受到严重的影响。 因此, 有效地防治支原体污染, 杜绝交叉感染对 提高实验效率, 稳定实验结果至关重要。我们的经 验是把防治支原体污染作为细胞培养的一项日常工 作, 除了对细胞培养设备环境的清洁外, 还需在器材 消毒, 操作员培训, 严格把关新引入细胞株的质量等 方面做大量细致的工作。 特约综述专题介绍