飞秒激光与细胞的作用机制及其在细胞纳米手术中的应用

研究生课程考试成绩单 （试卷封面） 院 系 电子科学与工程 专业 微电子与固体电子学 学生姓名 伏星源 学号 111146 课程名称 微电子机械系统 授课时间 2012年3月至2012年6月 周学时 36 学分 2 简 要 评 语 考核论题 总评成绩 （含平时成绩） 备注 任课教师签名： 日期： 注：1. 以论文或大作业为考核方式的课程必须填此，综合考试可不填。“简要评语”栏缺填无效。 2. 任课教师填写后与试卷一起送院系研究生秘书处。 3. 学位课总评成绩以百分制计分。 飞秒激光与细胞的作用机制及其在 细胞纳米手术中的应用 综述：现代光学、激光技术、图像处理及显示技术的发展，为细胞生物学家提供了高科技研究手段，使得能够对活体细胞和细胞器进行极其细微的操作和手术。1970年，美国加州大学欧文分校的M.W.Berns[7]提出，以聚焦成微米量级的微束激光作为剪刀对细胞进行手术，这标志着光刀的诞生。相衬显微镜下观察结果清楚表明，激光微型手术刀能使生物细胞内特定细胞器改性，而不伤及周围其它细胞器。例如，利用飞秒激光微型手术刀对细胞内的目标线粒体进行操作后，目标线粒体在激光作用下被气化，而在该作用区域邻近的细胞结构及其胞质未受激光影响。激光微型手术刀能选择性地消除染色体上的核仁组织，并成功实现通过照射着丝粒将整条染色体从纺锤体移走[8]．梁宏等人还进一步将微束激光照射到有丝分裂细胞染色体的DNA部位，从而将受照单细胞克隆成核糖体基因缺失的细胞株亚系[9]。还有关于激光光刀与生物组织作用以及进行眼科手术的报道。 随着激光技术的不断发展，飞秒激光的应用也越来越普遍，其具有极高峰值功率的特性也很自然地被应用到了激光手术中。具有极高峰值功率的飞秒激光脉冲在极短的时间内和生物组织相互作用，而不伤及周围组织，极高的空间分辨率使得飞秒激光手术的精度非常高，目前我国已经有医院引进了国外的飞秒激光手术系统治疗近视等眼科疾病。 将外源基因导入受体细胞可以获得转基因植物、动物和微生物。尽管转基因技术的研究取得了显著的进展，但常用的方法都有很大的局限性随着激光技术的发展，人们开始考虑用激光微束穿刺细胞，导入外源基因。即用激光微束对细胞穿刺，在细胞膜上产生可逆性穿孔，使外源基因由孔进入细胞，随后小孔闭合，外源基因留在细胞内。 日本理化研究所的Tsnkakoshi[10]等首次报导了激光微束对细胞穿刺导入基因。其后美国加州大学和德国的海德堡大学[11]等也有相关报道。我国的中科院遗传所和清华大学等单位[12]也进行了此项研究。最近，飞秒激光的应用使该技术又有了新的发展。Uday[13]首次使用飞秒激光进行细胞穿刺，外源基因的转化率和细胞的存活率有很大程度的提供。 细胞穿刺导入外源基因的机理是激光微束照射引起细胞的可逆性穿孔。细胞先在高渗缓冲液中预处理，洗去高渗液，将细胞悬浮于培养液中，加入一定浓度的外源DNA，用激光束照射。因为经过高渗缓冲液的预处理，细胞膜内外存在渗透压梯度。激光微束在细胞表面形成穿孔后，外源DNA可以顺着渗透压梯度进入细胞，随后(5秒内)穿孔闭合，进入细胞的外源基因滞留在受体细胞内，随机整合到目标细胞的DNA上。 较之其它转基因方法，细胞穿刺法的最大优点是适应性强。转化受体不为种属及基因型限制，且受体材料可以用悬浮细胞培养物、愈伤组织、胚、分生组织或花粉粒等多种形式。因此该方法可用于多种动植物细胞，尤其是那些具有坚硬细胞壁的植物细胞。 与传统的手术刀相比，激光手术刀对生物组织的损伤小，精度高，而飞秒激光手术刀更具有极高的精度，必将在今后的生物学发展中发挥重要的作用。 摘要：激光类型不同，其与生物组织的作用机理也不同。其中飞秒激光由于脉冲持续时间短、瞬时功率大、聚焦尺寸小的特点，使得其在超快、超强和超精细领域有着广阔的应用前景。而结构微小的细胞的动力学研究，如有丝分裂、变形和凋亡，对于了解细胞的生物和发育行为有着重要作用。且生物大分子和水几乎不吸收近红外波长的光，故考虑应用近红外飞秒激光对细胞进行手术。这种激光手术技术已用于对细胞内结构进行切割和蚀除。介绍了该技术在细胞领域中的一些应用，如纳米手术、基因转染和染色体切割等。与传统技术相比，该技术精度高，可在不损伤细胞活性的前提下对细胞进行实验。 关键词：飞秒激光；细胞；纳米手术；切割；微手术 Applications of the femtosecond laser on cell nanosurgery Abstract：The effects of different lasers on biological tissues are various．With short duration time, great instantaneous power and small focus dimension, the femtoseeond laser pulses have expansive application future on the ultra-fast, the ultra-in-tense and the ultra-fine fields．And the study on tiny cell’s dynamics，such as mitosis, metabolism, and apoptosis, is of great importance to understand the biological and developmental properties of cells．Meanwhile the biological big molecules and the water do not absorb the light in the near-infrared region, so it is considered to do experiments on the biological cells with the near-infrared femtosecond laser pulses. This laser technique has been applied to dissect and ablate intracellular structures. Some applications of this technology on cells，such as nanosurgery, gene transfection and chromosomal dissection are introduced．It has higher precision than the traditional technologies, and can be used without compromising the cell’s viability． Key s：femtoseeond laser; cell; nanosurgery; dissection; microsurgery 一：引 言 自20世纪60年代诞生以来，在基础科学研究和相关技术中，激光一直是一个重要的工具[1]。用激光所做的实验已加强了人们对光与物质相互作用的理解，特别是在非线性领域；激光也可永久改变材料的性能。19世纪80年代飞秒激光的发展打开了许多领域更具活力研究的窗口[2，3]。今天，飞秒激光正用于高精度的光反应的研究、材料性能的探测、单分子的成像以及材料的制备。飞秒激光在医学中已用于时间选通门扫描成像技术、光学相干层析成像、逆问题算法与图像重建技术以及双光子荧光诊断与治疗；在细胞工程与基因工程方面，已用于荧光显微镜、光镊及细胞手术系统和飞行质谱DNA排序[4]。 透明材料一般不吸收可见或近红外光。然而，强聚焦飞秒激光脉冲强度足够大，以至在透明材料中能产生激光能量的非线性吸收，从而导致光致击穿和材料的永久改变。因为吸收过程是非线性的，能量的吸收和材料的改变都局限在特别小的焦点体积内。在透明或半透明生物组织中的光致击穿取决于光强而不是能量，达到光致击穿所需的飞秒脉冲能量远小于长脉冲激光能量，所以应用飞秒脉冲时沉积在样品目标区域的能量最小，使临近组织产生边缘损伤的机械效应和热效应也降到最小。飞秒激光的分辨本领高，对组织破坏性小，我们相信飞秒激光必将在医学和生物领域引发新的技术革命。本文首先对激光微手术技术做了简要介绍，说明应用飞秒激光进行细胞手术的优势；介绍了超短激光与生物组织的作用，飞秒激光技术在细胞领域中的一些应用，如线粒体的蚀除、基因转染和染色体切割等。 二：激光微手术技术 激光首次应用是在眼科，眼睛及其内部结构因其高透明度而属于最容易接近的器官。60年代后期开始，激光器逐步引入其它医学学科。激光大多数的应用属于微创手术，这一术语描述了非接触、非流血的外科手术过程。在过去的10年，细胞研究和手术中激光的使用大大增加。目前为止，对细胞的微切除技术包括微探针技术、原子力显微镜探针、聚焦紫外光“微剪刀”、发色团辅助激光失活(CALI)、纳秒激光和皮秒激光技术。微探针技术是入侵式的，通常会破坏细胞结构间的物理联系。该技术的空间分辨率在10um，且过程作用力大。原子力显微镜探针只作用在样品表面，也是入侵式的。商用紫外微剪刀用近紫外(337nm)纳秒激光脉冲切除了1um的组织。然而，因为大多数细胞成分对近紫外光具有强烈的吸收，样品光路径上的焦平面以外的成分也会吸收辐照。这样就很难在活细胞内蚀除亚细胞器的同时不破坏细胞膜。CALI技术用可见光照射具有可见光吸收染料的特定蛋白质，产生自由激子从而选择性地使蛋白质变性。然而，这些失活的蛋白质没有脱离这些区域。CALI的作用效果是短时的，需要在几小时内补充新的功能性蛋白。聚焦纳秒绿色激光微手术的作用效果随细胞结构的不同类型而定，有报道称在激光焦点处和焦点外均有蛋白质分子的变性。为了研究细胞的纳米级别的生物作用，需要一种精确的亚细胞手术技术，该技术能提供纳米尺度的精度，能对细胞结构产生最小的改变，且可应用于活的生物样品。 激光手术近年来的发展使得我们可以应用不同脉宽的激光精确蚀除生物材料，从连续激光到10fs的脉冲激光。与紫外、可见光相比，近红外飞秒激光具有以下优点：适用于任何类型的生物组织，高精度，三维方向的可控制性，不影响细胞的活性，在近红外区细胞对热的吸收小，从而焦点体积周围的热损失小，蚀除仅发生在焦点体积处及其周围很小的区域内。 三：超短激光与生物组织作用 激光辐照通过许多方式影响组织，如，加热、键的断裂、蚀除或蒸发。蒸发过程限制在亚微米尺寸的焦点体积内，由激光激励引起的加热和间接机械应力会导致较大范围的有害的边缘效应。因为活细胞生存的温度范围很窄，即使是稍微的加热也会导致细胞的坏死，所以必须限制沉积在样品上的总能量。因此，必须调整激光参数保证有害的边缘效应最小。 物镜数值孔径越大，焦点光斑越小，达到强度阈值所需能量越低。而且，脉冲持续时间越短，脉冲能量强度越高。因此，在强聚焦下脉冲持续时间越短，达到强度阈值的能量越少。除了要研究激光诱导等离子体引起的热效应，还需要考虑焦点体积周围的机械效应。材料被激励后，等离子体以超音速扩展到周围组织，当速度降到声速时会产生压力波。而且，焦点处被蒸发的材料形成向外膨胀的空穴气泡，而后在外压下破裂。这个受机械效应影响的区域(被称为“冲击区域”)的尺寸随着激光脉冲能量的增加而增加。对于纳秒持续时间的1mJ的脉冲，冲击区域大约有0.5mm。对于持续时间更短(相应脉冲能量较低)的脉冲，冲击区域小了很多:40ps、8uJ的脉冲尺寸在100um，100fs的尺寸只有11um。在一些实验中，试验者采用的是100fs、2nJ的脉冲，冲击区域小于1um。 如上所述，亚皮秒脉冲的边缘热和机械效应都达到了最小。当这些脉冲被强聚焦在生物组织上时，激光焦点体积处强度通过多光子电离、隧道电离和雪崩电离引起材料对激光能量的非线性吸收。这种非线性吸收产生了亚微米尺寸的高激发的等离子体，使焦点体积处材料蒸发产生手术效应。因为吸收是非线性的，激光能量只在材料内部焦点处被吸收，焦点处激光强度最高。因此，除了使边缘效应达到最小，亚皮秒激光脉冲也有两个其它的优点。第一，无论在哪个波长下，均不产生线性吸收现象，因此介质内任何区域都可以作为靶材而不用考虑激光的波长。第二，把激光焦点调到样品表面以下，焦点体积处样品材料会被蒸发，形成表面下空穴，而样品表面不会受到影响。 四：飞秒激光在细胞手术中的应用 (1)活细胞内细胞器的蚀除 细胞复杂的功能，如有丝分裂、生长、运动、新陈代谢、分化和凋亡，都是由于空间不同的亚细胞区域发生的不同作用的联系而引起的。为了研究这些行为，需要对细胞进行结构调整或去除活细胞内纳米级的这些功能性区域。然而，传统的切开工具如微米针都是入侵式的，空问分辨率限制在了10um级别，而且通常会破坏结构间的联系。因此，为了研究细胞作用，有必要发明一种精确进行亚细胞手术的技术，该技术能提供亚微米的分辨率，对细胞周围环境改变最小并能应用在活的生物样品内。 图1实验装置示意图 日本大阪大学的Wataru Watanabe等人[3]以及哈佛大学Eric Mazur课题组等都从事了有关应用飞秒激光将活细胞内细胞器蚀除的研究。该纳米手术技术为在活细胞内操纵或是去除单个细胞内细胞器或染色体的片断提供了一种直接、非接触的方法，打开了精确研究细胞器功能和细胞作用的大门，允许在单个细胞器的破坏或去除后对细胞行为进行观察。实验装置如图1[3]。 实验用黄色荧光蛋白(enhanced yellow fluores．cent protein，EYFP)标记线粒体。图2是飞秒激光辐照海拉细胞前后的共焦图像[3]。 实验前后激光焦点体积外线粒体的位置变化证明了细胞质仍存在流动性，同时证明了细胞在实验后仍具有活性。也有报道用辐照后细胞仍发生有丝分裂证明细胞的活性。蚀除的线粒体对周围线粒体没有影响说明了线粒体是独立分布的，而不是像有些人认为的网络结构。 细胞器的蚀除实验通常使用的是低重复率的钛蓝宝石激光放大系统，飞秒激光的重复率在1kHz。飞秒激光放大系统脉冲能量高，热损失小，实验后对周围线粒体和细胞的活性无明显的影响。Tomoko Shimada和Wataru Watanabe等人比较了飞秒激光放大系统和振荡器的优缺点，并采用飞秒激光振荡器(重复率在76MHz)对线粒体进行了蚀除，发现在不同的辐照时间下引起线粒体蚀除所需的脉冲能量有所不同，实验后细胞仍存在活性。用黄色荧光蛋白标记线粒体时，当辐照时间为32ms时，脉冲能量在0.40+0.14pulse时，不影响周围的线粒体；但脉冲能量大于0.5nJ/pulse时，如0.53nJ/pulse，发现目标线粒体以外的线粒体发生了变形。辐照时间越短，需要的临界脉冲能量越高。使用不同的荧光染料，不影响周围线粒体的临界脉冲能量也不同。也有实验应用80MHz的飞秒激光辐照细胞，实验后细胞分裂减弱、产生了巨细胞，导致了细胞凋亡。 图2激光辐照前(a)、后(b)的共焦图像 箭头指向的线粒体在辐照后消失 (2)飞秒激光转染技术 基因转染(gene transfection)又称基因转移(gene transfer)，是指向受体细胞中导入外源基因，是改造细胞遗传性状的常用手段[43]。在活细胞体内引导外源基因进入的技术在生物医学应用方面有重要作用。这项技术关键性问题是如何在不损伤细胞结构完整性前提下提高基因转染效率。常用的转染技术有裸露DNA直接注射、等离子膜渗透转移等，但这些技术都有自身的缺陷，不能提供非破坏性的、稳定的基因转染。 用钛蓝宝石飞秒激光器在细胞膜上产生单个的、特定位置的、瞬时的穿孔，允许DNA通过，并保存了细胞的完整性。这种技术不仅转染效率高、保存了细胞的活性，而且可以同时观察到外源基因的整合和表达。而用纳秒或紫外激光产生的膜穿孔精确度低，细胞的完整性也遭到了破坏。 这种转染技术的效率达100％，且对细胞没有选择性，对细胞的生长和分裂不会产生有害影响，而且可同时运用双光子荧光成像技术对外源基因进行表达。这种对特定细胞类型(包括干细胞)能安全有效地进行外源基因转染的技术给很多领域带来广阔的应用前景，包括目标基因治疗和DNA接种疫苗。 (3)染色体纳米切割 Karsten Konig[6]应用80MHZ钛蓝宝石激光对人类的染色体进行点蚀除和线切割。飞秒激光作用于细胞后，应用原子力显微镜对细胞进行观察。实验表明在其他参数相同的情况下切割线的宽度与扫描次数有关，次数越多，线宽越大；曝光时间越长，点蚀除的深度和直径也越大。该技术为研究各个基因的功能提供了有效、精确的工具。 (4)神经细胞激光轴索显微外科术后功能性再生 懂得神经如何再生是治疗人类的神经疾病跨出的重要一步，但目前的研究一直都只局限在对复杂的生物有机体的不精确的轴索显微外科术。 飞秒激光能够产生高峰值强度，能降低组织切除(蚀除)的能量阈值，并能降低激光外科手术所需能量。使用脉冲能量10-40nJ、强聚焦、200fs、近红外的激光脉冲在样品内成功的切除了单个的神经轴突。实验中轴突体积蒸发了大约0.1-0,3fL，可以猜测轴突的直径平均为0.3um。实验用100个200fs、40nJ、lKHz的飞秒激光脉冲，轴突用绿色荧光蛋白标识。对手术过的神经的漂染说明观察到的轴突的断裂不是因为光漂白，而是由于轴突的物理断裂。手术后24h内蠕虫运动得到了改善，就像没做手术的一样，这就说明再生的神经元是正常运作的。 飞秒激光轴突显微外科术是一种新型的技术手段，其效率100％、精度达到亚微米级、速度快。正如C.elegans这样的简单生物有机体，它们具有有用的遗传信息。利用飞秒激光轴突显微外科术可以帮助对基因和影响神经再生和生长的分子的快速识别。 五：结论 本文介绍了飞秒激光在细胞领域中的应用实例，证明了飞秒激光在细胞手术中的应用前景。由于飞秒激光脉冲持续时间短、强度高、在细胞中穿透深度大的特点，使得飞秒激光在细胞纳米手术中得到了广泛地应用。飞秒激光可以在不破坏细胞活性的条件下蚀除和断裂亚细胞器，为研究亚细胞器对细胞性能的影响提供了一种有效的方法，也为研究细胞中基因和特定分子的作用提供了有效的途径。然而，在一些方面仍存在问题，如等离子体诱导蚀除 的机理、高重复率激光辐照下由能量累积引起的热效应和脉冲与脉冲之间的相互作用。这些都值得我们傲进一步的研究与探索。 参考文献： [1]Maiman T H．Stimulated optical radiation in ruby[J]．Nature，1960，187：493--494． [2]魏赫颗，邢岐荣，张伟力，等．飞秒激光在生物医学中的应用[J]．光电子-激光，2002，11(6)：672---676． [3]Wataru Watanabe,Sachihiro Matsunaga,omoko Shirnada，et．Femtosecond laser disruption of mitochondria in living cells[J]．Medical Application，2005，20：185—191． [4]狄建科.周明.杨海峰.戴娟 飞秒激光与生物细胞作用机理及应用[期刊论文]-激光生物学报 2008(2) [5] 7.尹国盛.顾玉宗.黄明举.毛艳丽 非线性光学及其若干新进展[期刊论文]-物理 2002(11) [6] Kongig K. 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