siRNA干扰纺锤体伴随蛋白Astrin表达对HepG2细胞周期及凋亡的影响

siRNA干扰纺锤体伴随蛋白Astrin达对HepG2细胞周期及凋亡的影响 siRNA 干扰纺锤体伴随蛋白 Astrin 表达对 HepG2 细胞周期及凋亡的影响 姜迎亮，黄柏炎 (暨南大学生命科学技术学院，广州 510632) 5 摘要:前期研究发现 Astrin 与 ORP8 之间存在相互作用，为进一步证实此相互作用的存在， 探索 Astrin 在 ORP8 功能中所扮演的角色，本文利用了免疫共沉淀技术证实两个者的相互作 用，通过一个小干扰 RNA，转染人肝癌细胞系 HepG2，western blot 检测蛋白敲低效果， 通过流式细胞检测技术，观察 Astrin 敲低后对细胞的影响。实验结果表明利用 Astrin 抗体进 行的免疫共沉淀实验成功检测到 ORP8，证实了二者在 HepG2 细胞内存在物理相互作用。 10 依据参考文献设计的干扰 RNA 有效地敲低了 Astrin 的表达。经流式细胞仪分析发现，在 HepG2 细胞中敲低 Astrin 以后，细胞周期发生显著变化，其中处于 G1 期细胞减少，S 期细 胞数显著增多，G2/M 期细胞则无明显变化，表明受 Astrin 敲低的影响，细胞停滞于有丝分 裂的 S 期。通过检测细胞内 DNA 的含量判断细胞的凋亡情况发现，敲低 Astrin 以后细胞凋 亡比例显著上升。上述实验结果证实本文设计的针对 Astrin 的 siRNA 的有效性，同时发现 15 在人肝癌细胞系中敲低 Astrin 会显著改变细胞周期，并引起细胞的凋亡，结合 Astrin 与 ORP8 的相互作用，该 siRNA 的成功应用将为探索脂类调控与细胞周期之间的关联提供有力的工 具。 关键词:纺锤体伴随蛋白 Astrin;小干扰 RNA;细胞周期;氧化固醇结合蛋白 ORP8 中图分类号:Q51 20 Cell Cycle and Apoptosis Impact of Astrin siRNA on Human Hepatoma Cell HepG2 JIANG Yingliang, HUANG Boyan (Biology School, Jinan University, GuangZhou 510632) 25 Abstract: The interaction between Astrin and ORP8 had been preliminarily found. To confirm this interaction and explore the role played by Astrin in ORP8 functions, we made a CO-IP experiment, designed a siRNA to inhibit Astrin expression and monitored the impact on the cell after RNA interfering basing on flow cytometry technology. The result showed that Astrin and ORP8 really had physical interaction in the CO-IP experiment. The siRNA designed according to reference 30 significantly reduced Astrin expression. Knocking down Astrin in HepG2 cells significantly changed cell cycles, of which G1 phase cells decreased, S phase cells remarkably increased, but G2 / M phase cells did not have an obvious change. The above experiment results confirmed the validity of this siRNA against Astrin, and Astrin knocking down significantly alterd the cell cycles and induced apoptosis. Considering the interaction between Astrin and ORP8, the successful 35 application of siRNA will be powerful to explore the association between lipid regulation and cell cycles. Keywords: Astrin; siRNA; cell cycles; ORP8 0 引言 40 Astrin (也称作 SPAG5，hMAP126), 最早于 2001 年由 Mack, G. J 等鉴定发现，其作为有 丝分裂微管相关蛋白的一员，大小约 134 kDa。该蛋白 C-末端有一个大型的卷曲螺旋结构域， N-末端为球状结构域 [1]，目前已知其在有丝分裂全程伴随微管运动，且与 hNinein[2]， 基金项目:国家自然科学基金(30971104) 作者简介:姜迎亮，(1987-)，男，硕士研究生，主要研究方向:氧化固醇结合蛋白功能及应用研究。 通信联系人:黄柏炎，(1964-)，男，副教授，主要研究方向:蛋白相互作用的分子机理。E-mail: thboyan@jnu.edu.cn -1- GSK3beta[3](糖原合酶激酶 3beta)存在相互作用，对有丝分裂的正常进行有重要作用。 45 本课题前期实验发现该蛋白与氧化固醇结合蛋白相关蛋白 8(ORP8)存在物理相互作 [4] 用 ，而后者能够结合氧化固醇[5]，调节细胞的脂质平衡，在巨噬细胞，肝脏细胞等中呈现 高表达，并与肝脏癌症的发生具有重要关系。 小分子 RNA 干扰(siRNA)作为一种新兴技术，为基因功能的研究，提供了新的思路，其 通过将双链 RNA 瞬时转染细胞，特异性的下调靶基因的表达[6]。本研究为探索 Astrin 在 ORP8 功能中所扮演的角色，我们设计了针对 Astrin 的 siRNA，通过在人肝癌细胞系 HepG2 中的 50 应用试验，确认其有效性，并发现 HepG2 细胞敲除 Astrin 以后其细胞周期及凋亡均发生显 著改变，为进一步探索其在 ORP8 的脂质调节中的功能提供基础。 1 和方法 材料 1.1 试剂 55 1.1.1 人 肝 癌 细 胞 株 HepG2( 暨 南 大 学 生 化 与 分 子 生 物 学 实 验 室 保 存 ) ， pcDNA4-HismaxC-Astrin，pcDNA4-HismaxC-ORP8 质粒(暨南大学生化与分子生物学实验室 保存)，DMEM 培养基 (美国 Thermo 公司) ，胎牛血清(美国 GIBCO 公司),ProteinG Sepharose 4B Fast Flow(美国 GE 公司)，Lipofectamine 2000 (美国 Invitrogen 公司)。 仪器和器材 60 1.1.2 二氧化碳培养箱(美国 Thermo 公司)，Western 水平电泳系统，SD 半干转印仪(美国 Bio-Rad 公司)，台式超净工作台(美国 Labconco 公司)，流式细胞仪(美国 BD 公司) 实验方法 1.2 1.2.1 设计、合成 siRNA 及使用方法 根据 GenBank 获得人 Astrin 基因(GenBank ID AF_399910)的 cDNA 序列，根据参考文 65 献，设计 siRNA 序列后，进行全基因组扫描(BLAST)和序列同源分析(通过 NCBI 提供的基 因组数据库和分析软件进行)，确保选择的 siRNA 序列与基因组中其他基因无明显同源性。 siRNA 序列由广州锐博有限公司合成，同时合成与 Astrin 基因序列无关的阴性对照 siNC。 合成的目标序列如下:siAstrin:5'-CCCGUUUCGAGGUCUCGGAGU-3' 配制方法:用 DEPC 70 水溶解合成的 siRNA 至终浓度为 20μM，分装为 100μl 后于-80?C 保存，避免反复冻融。 1.2.2 siRNA 转染 将对数生长期的 HepG2 细胞用胰酶消化，离心收集后，用 PBS 重悬计数，以 1×105 的 密度均匀平铺在 6 孔板中，细胞密度约为 30%-50 %，进行转染。依照 Lipofectamine 2000 说明书配制 Lipofectamine 2000 与 siRNA 的混合转染试剂，然后均匀加入各孔中，siRNA 终 75 浓度为 100 nmol,L，轻轻混匀。于 37 ?、5 %的 CO2 恒温培养箱中培养 6 h，换为完全培 养基继续培养约 70 小时，收细胞样品进行 Western 分析。实验分为野生细胞组，空白对照 组以及实验组，分别不做处理，加入 siNC，加入 siAstrin。 -2- 1.2.3 免疫共沉淀实验(CO-IP) 将对数生长期的 HepG2 细胞用胰酶消化，离心收集后，用 PBS 重悬计数，以 1×106 的 80 密度均匀平铺在 6 孔板中，培养至时细胞密度约为 80 %-90 %，进行转染。依照 Lipofectamine 2000 说明书配制 Lipofectamine 2000 与质粒载体的混合转染试剂，然后均匀加入各孔中，轻 轻混匀。于 37 ?、5 %的 CO2 恒温培养箱中培养 6 h，换为完全培养基继续培养约 20 小时， 去除培养基，用冰冷的 PBS 洗两次，后加入预先加入蛋白酶抑制剂的细胞裂解液 100 μL / 每孔，完全裂解后收细胞样品，高速离心取上清液。:将细胞裂解液平均分为两管，分别加 85 入目标抗体与对照抗体，抗体终浓度为 1 μg/mL，然后分别加入 50 μL 已平衡的 50 % 的 ProteinG Sepharose 4B Fast Flow，样品置于冰上轻摇过夜。将结合后的树脂用 CO-IP 细胞裂 解液洗涤三到五次，最后一次洗完，吸尽上清，加入 50 μL 2 X SDS 上样缓冲液， 98 ?煮 5 min，进行 Weatern Blot 分析。 流式细胞仪测定细胞周期及凋亡 90 1.2.4 取处于对数生长期的 HepG2 细胞，按上述条件铺板，转染 SiRNA36 h 后，将细胞用 PBS 洗两次，胰酶消化后离心，再用冰冷的 PBS 洗一次后，逐滴加入 70 %的乙醇，边加边于振 荡器上振荡，使细胞良好的分散，于 4 ?固定过夜。 将固定后的细胞离心，去除上清液，用冰冷的 PBS 洗 1 次，加入含有 Rnase 的 PI 染液， 95 PI 终浓度为 50 μg/mL，暗室中染色 30 min。将细胞过滤后，用流式细胞仪检测细胞 DNA 含 量，并测定细胞周期，每个实验组随机选取 10000 个细胞进行统计分析。 统计学分析 1.2.5 所有的统计学实验结果均重复三次，各分组所得计量数据采用均数?标准差( X ?S)表 示。数据之间的统计学差异分别采用双尾 t 检验和 ANOVA 方差分析计算 P 值。 p<0.05 有统计学意义。 100 2 实验结果 2.1 确证 Astin 和 ORP8 之间的相互作用 首先我们通过免疫共沉淀(CO-IP)的方法确证 Astrin和 ORP8 之间的相互作用，在 HepG2 细胞同时过表达 ORP8 和 Astrin，以 Astrin 兔多克隆抗体和对照兔多克隆抗体进行免疫沉淀， 105 结果显示与对照抗体相比，Astrin 抗体可特异地将 ORP8 共沉淀下来，表明 Astrin 与 ORP8 在 HepG2 细胞中发生相互作用。(图 1) -3- 图 1 Co-IP 确证 ORP8 与 SPAG5 在 HepG2 细胞内存在相互作用。 左:Astrin 抗体免疫沉淀样品 Western blot 检测 Astrin; 右:Astrin 抗体免疫沉淀样品 Western blot 检测 ORP8 110 Figure 1 Co-IP analysis of Astrin-ORP8 interaction in HepG2 cells 2.2 验证 SiRNA 有效性 我们将合成的 Astrin 的干扰片段 siAstrin 及阴性对照片段瞬时转染 HepG2 细胞。转染 115 72h 后收集细胞，用 RIPA 裂解液裂解，进行 Western blot 检测，结果显示对照 siNC 并不影 响 HepG2 细胞中 Astrin 的表达。而与对照组相比，siAstrin 可以几乎完全敲除 Astrin 的表达。 (图 2) 图 2 Western blot 检测 siAstrin 对靶蛋白表达的影响 Figure 2 Western blot analysis of the impact of siAstrin on target protein expression 120 流式细胞仪检测细胞周期改变 2.3 已知 Astrin 是一个纺锤体伴随蛋白，有研究表明其在 Hela 细胞中对调节有丝分裂的进 程具有重要作用，基于其 ORP8 之间的相互作用，我们选取在 HepG2 细胞系中与敲低 Astrin， 125 并通过流式细胞术观察细胞周期的改变。如图 3 所示，与对照组相比，敲低 Astrin 导致 G1 期细胞显著减少，而 S 期细胞显著增多。因此 Astrin 能显著影响 HepG2 的细胞周期，当敲 低以后，会导致细胞有丝分裂停滞于 S 期，从而影响有丝分裂的进程。统计结果见于表 1。 -4- 图 3 Astrin 敲低对细胞周期的影响 Figure 3 The impact of Astrin knock-down on cell cycles 130 表 1 Astrin 敲低(siAstrin group)和对照(siNC group)的 HepG2 细胞周期( ?s)对比 Table 1 Analysis of cell cycles in HepG2 siNC and siAstrin cells Group G1 (% ) G2/M (% ) S (%) siNC group 73.4?1.73 1.6?0.3 25.0?1.47 siAstrin group 63.83?1.14* 1.8?0.46 34.3?1.31* Note : *: P,0.05 compared with control group 135 流式细胞仪检测细胞凋亡变化 2.4 在观察到细胞周期的显著改变以后，我们进一步观察了 Astrin 是否会影响细胞的命运。 通过三组重复实验结果，经统计学分析发现，当 Astrin 敲低以后，细胞凋亡百分比显著上升， 由此可见在 HepG2 细胞中，Astrin 在有丝分裂及细胞存活中有显著地作用。 140 -5- 图 3 Astrin 敲低对细胞凋亡的影响 Figure 3 The impact of Astrin knock-down on cell apotosis 145 3 结论与讨论 Astrin 是一种纺锤体伴随蛋白，目前已发现其与多种细胞有丝分裂相关的蛋白存在相互 作用，并在某些细胞系中能够影响细胞活动[7]，但未见于肝癌相关的细胞系中的相关报道。 有研究表明，大鼠精子相关抗原 5(SPAG5)与人类的 Astrin 有高度的同源性，而 SPAG5 在大鼠睾丸中有较高的表达量，在卵巢中则没有表达，表明该蛋白可能也与性别决定存在关 联[8]。本文确证的与之相互作用的 ORP8 则为氧化固醇结合蛋白，目前本课题组研究其与肝 150 癌发生发展存在关联。 肝癌是目前是临床上最常见的恶性肿瘤之一，而我国的肝癌患者比例远高于其它国家。 关于肝癌的成因目前有多种研究，其中有观点认为内质网应激引起的肝细胞凋亡有密切关 系。氧化固醇结合蛋白 ORP8 在肝脏细胞，巨噬细胞等中存在高表达，而且在肝癌细胞系 HepG2 中过表达 ORP8 能显著引起细胞的凋亡，其本身作为氧化固醇的受体，对细胞内的 155 脂质平衡具有重要的调节作用，而如何影响细胞凋亡则尚不明确。 本文基于前期研究，通过免疫共沉淀的技术，利用 Astrin 的特异性抗体将 ORP8 沉淀下 来，证实二者存在相互作用。我们假设 ORP8 对细胞的功能可能经由 Astrin 蛋白来介导，从 而有可能将脂类代谢引起的细胞行为的变化与有丝分裂相关的纺锤体结合蛋白 Astrin 建立 联系。通过合成 Astrin 的特异性 siRNA，我们成功的将细胞内的 Astrin 几乎完全敲除，我们 160 发现在肝癌细胞系 HepG2 中，Astrin 敲低能显著影响细胞周期与凋亡，为进一步研究 Astrin 在 ORP8 作用中所扮演的角色提供了有力的工具。 [参考文献] (References) [1] Mack, G. J. and D. A. Compton. Analysis of mitotic microtubule-associated proteins using mass spectrometry 165 identifies astrin, a spindle-associated protein[J]. Proc Natl Acad,2001, 98(25): 14434-9. [2] Cheng, T. S., Y. L. Hsiao, et al. hNinein is required for targeting spindle-associated protein Astrin to the centrosome during the S and G2 phases[J]. Exp Cell Res, 2007, 313(8): 1710-21. [3] Cheng, T. S., Y. L. Hsiao, et al. Glycogen synthase kinase 3beta interacts with and phosphorylates the spindle-associated protein astrin[J]. J Biol Chem, 2008, 283(4): 2454-64. 170 [4] 罗玮,周天鸿,闫道广. ORP8 与 SPAG5 相互作用并影响细胞周期[J]. 现代生物医学进展, 2011, 11(14): 2601-2604 -6- [5] Farrell GC, Larter CZ. Nonalcoholic fatty liver disease: from steatosis to cirrhosis[J]. Hepatology, 2006, 43: S99-112 175 [6] A Reynolds, D Leake, Q Boese et al.Rational siRNA Design for RNA Interference[J]. Nat Biotechnol, 2004, 22(3):326-330. [7] Gruber, J., J. Harborth, et al. The mitotic-spindle-associated protein astrin is essential for progression through mitosis[J]. J Cell Sci, 2002, 115(Pt 21): 4053-9. [8] Suzuki, H., M. Yagi, et al. Duplicated insertion mutation in the microtubule-associated protein Spag5 (astrin/MAP126) and defective proliferation of immature Sertoli cells in rat hypogonadic (hgn/hgn) testes[J]. 180 Reproduction, 2008, 132(1): 79-93. -7-