不同促性腺激素添加方式对猪卵母细胞生发泡染色质构型和卵母细胞成熟能力的影响

不同促性腺激素添加方式对猪卵母细胞生发泡染色质构型和卵母细胞成熟能力的影响 不同促性腺激素添加方式对猪卵母细胞生发泡染色质构型和卵母细胞成熟能力的影 响 黑龙江动物繁殖第l4卷第2期2006年 不同促性腺激素添加方式对猪罗同母细胞生发泡 染色质构型和罗同母细胞成熟能力的影响 包磊,周洪彬,李跃民 (西南大学胚胎工程重点实验室,重庆400716) 摘要:在卵母细胞体外成熟培养过程中,培养基中添加激素与否及其激素添加的先后顺序是影响猪 卵母细胞核成熟和质成熟的一个重要因素.本试验将猪卵母细胞分别在FSH一不含激素,FSH—LH, FSH+LH不含激素中培养48h(培养第2O,22h后换液),并于成熟培养的第24h(未换液),48h将卵 母细胞进行荧光染色,观察其生发泡内染色质构型及卵母细胞核成熟情况.实验表明:(1)在IVM的前 24h,添加FSH+LH组的GVIV期卵母细胞比例低于只添加FSH组,但差异不显着(8.99%比l7.19%, P>0.05);(2)在FSH存在的情况下,IVM的前期和后期添加LH能促进卵母细胞发生GVBD;(3)FSH+ LH培养24h后转入不舍激素培养基组,卵母细胞的核成熟比率显着高于添加FSH组和先添加FSH培 养24h后转入添加LH组(P<0.05). 关键词:激素;卵母细胞;体外成熟;猪 中图分类号:$828-3;$814文献标识码:A 在对卵母细胞体外成熟质量诸多影响因素中,激 素是重要因素之一.目前,猪卵母细胞[VM体系中广 泛采用PMSG+hCG和FSH+LH的激素添加方式,并 认为卵母细胞IVM的后期(后24h)不宜在含有激素 的IVM液中培养.近来的研究显示,卯母细胞IVM 的前2O一22h在含FSH的IVM液中培养,然后再在 含LH的IVM液中培养24h,采用此种激素添加方 法成熟的卵母细胞IVF后囊胚发育率达33.8%t, 44.4%t.另外,部分实验室在IVM液中仅添加FSH 仍能获得较高的发育能力嘲,研究表明,在IVM液中 添加LH并不能提高卵母细胞的核成熟率,但能促进 卵母细胞的细胞质成熟. 本实验将卵母细胞置于几种不同激素环境中体 外成熟培养,在培养的第24h(未换液),48h时对猪 卵母细胞进行荧光染色(Hoechst一33342),检测并比 较了卵母细胞在各激素环境中的核成熟及各分裂阶 段的分布情况,以期找出一种适合该培养体系下的激 素添加方法. 1材料及方法 1.1药品及试剂 除FSH和LH购自中科院动物所,其它药品均购 自Sigma.4孔培养板(NUNC).PBS:Na2HPO4?12H20 3.73geL+KH2PO40.43g/L+NaCI7.2g/L+2×10IU/L 青,链霉素;抽卵液:DPBS+1.0mg/mLPVA+1.6×10 收稿日期:2006—03—06 作者简介:包磊(1977一),男,新疆人,硕士. Email:baolei1977@126.COIn 通讯作者:李跃民,Email:lymin126@126.cOffl. 文章编号:1005—2739(2006)02—0001—03 IU/L庆大霉素;洗卵液:DPBS+1.0mg/mLBSA+0.8×10 IU/L庆大霉素;体外成熟培养液(IVMM):TCM1999.80 mg/mL+BSA(0.1%)1.0mg/mL+NaHCO32.20mg/mL+ Hepes(10mmol/L)2.383mg/mL+D-glucose0.550 mg/mL+内酮酸钠0.055mg/mL+cysteine0.0691 mg/mL+0.8×105IU/L庆大霉素;除自制PBS(高压蒸汽 灭菌)外,所有液体都在配制好后经0.221"11微孔滤膜 过滤分装,并于2周内用完. 1.2卵母细胞的收集 卵巢从刚屠宰母猪体内取后放入25—28c【=的自 制PBS液+2×10IU/L青,链霉素中,5h内运回实验 室.用PBS液清洗3次后,置于无菌实验室.用60mL注 射器和18G注射针头预先吸入1,2mL抽卵液后抽取 卵巢上3,6mm透明卵泡内的COCs. 1.3卵母细胞的成熟培养 在体视显微镜下将卵捡于洗卯液中,并于洗卵液中 清洗3次.抽卵和捡卵在1.5h内完成,将卵母细胞移入 到装有IVM液已预孵3h以上的4孔培养板中(每孔含 500/xLIVM液),然后放入39oC,5%CO2,饱和湿度的 CO培养箱内培养. 1.4卵母细胞的成熟鉴定 染色方法参考孙兴参等人的报道嘲.具体方法为:将 COCs移入约300L成熟液中,用100/.zL移液枪反复 吹打将卵丘细胞去净,另取一平呷.在lmL经预热的成熟 液中加入10LH,荧光染料,移入经吹打后的卵母细 胞,39.【=二氧化碳培养箱中染色10min.染色完成后捡 出卵母细胞,在成熟液微滴中清洗3次,压片(压片时用 力须适度,以免卵母细胞被压破或没有压扁影响观察), 在倒置显微镜下紫外光激发荧光观察.根据所显示核 黑龙江动物繁殖第l4卷第2期2006年3 3讨论 存培养液中添加卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素 (LH)可有效抑制颗粒细胞的凋亡并维持颗粒细胞之 间的缝隙连接,促进颗粒细胞增殖,膨散,促进卵母细 胞成熟及受精.Omran等人采用FSH不含激素组的激 素添加方法获得了85%以上的核成熟率1.近来的研究 显示【l12j.采用FSH(前20—22h)一LH(后26—28h)的激 素添加方式获得了80%以上的成熟率,30%以上的囊 胚发育率,这种激素添加方法更接近体内成熟卵母细 胞的激素作用方式.然而,本实验的结果显示FSH(前 20,22h)LH(后26,28h),FSH不含激素组的两种 激素添加方式显着降低了卵母细胞的核成熟率.在含 FSH和FSH+LH的成熟液中培养24h后.GV期卵母 细胞比例差异不显着(P>0.05).但FSH组的GVI期卵 母细胞比例低于FSH+LH组(/9>0.05),而GVIV期卵 母细胞的比例高于后组(P>0.05).研究认为.在体内 成熟过程中.很少出现GVIV期的卵母细胞.本实验 参考文献: 【1]MasayukiShimada,MasahideNishibori,NaokiIsobe,ela1. LuteinizingHormoneReceptorFormationinCumulusCells SurroundingPorcineOocytesandItsRoleDuringMeiotic Maturati0n0fP0rcine0ocytes,Bi0lR叩mci,2O()3,68:l142-1149. MingWu,Qing—YuanSun,JiudeMao,eta1.High [21Guang— DevelopmentalCompetenceofPigOocytesafterMeiotic InhibitionwithaSpecificM-PhasePromotingFactorKinase Inhibitor,ButyrolactoneI.BiolReprod,2002,67:170-177. [31OmranAlgriany,MartBever~EricSchoevera,etatFollicle size-dependenteffectsofsowfollicularfluidoninvitrocumulus expansion,nuclearmaturationandblastocystformationofsow cumulusoocytescomplexeaTheriogenology,2004,69.1483-1497. 【4]J.Ye,K.H.S.Campbell,J.Craigon,eta1.Dynamicchangesin 中.FSH不含激素组和FSHLH组卵母细胞在成熟过 程中,GVIV期卵母细胞比例较高可能与这两组卵母 细胞核成熟率较低有关;另外.卵母细胞体外成熟的后 期不宜在含有激素的IVM液中继续培养【8J.可能也是 导致FSHLH组卵母细胞核成熟率较低的重要原因. 在不同激素添加方式的成熟液中培养48h后, FSH不含激素组的GV期卵母细胞显着高于其余各 组,而FSHLH组的GV期卵母细胞与FSH+LH不含 激素组,FSH+LH组差异不显着,这说明LH能促进卵 母细胞GVBD的发生,且在成熟培养的后期加入LH也 能起到促进卵母细胞GVBD的发生的作用.Ye等人[41 认为,LH能提高猪卵母细胞的细胞质成熟.但并不能 提高卯母细胞的核成熟率.而本实验表明,在IVM的 前期添加LH能显着提高猪卵母细胞体外成熟的核成 熟率,这种结果的差异性可能与老龄母猪的卵母细胞 对LH的敏感性增加有关 meioticprogressionandimprovementofdevelopmental competenceofpigoocytesinvitrobyFSHandcycloheximide. BiolReprod,2005,72:399—406. 【5]岳奎忠,陈新,孙兴参,等潴卵巢体外保存温度对卵母细胞 染色质构型和成熟能力的影响fJJ.动物,2005,51(5): 919—923. 【6】Motlik,J,J.Fulka.Breakdownofthegerminalvesicleinpig ooeytesinvivoandinvitro.J.Exp.Zoo1.1976;198:155-162. 【7]孙兴参,伊亚玲,岳奎忠,等.注射hCG后不同时间猪所排卵 泡内COC的形态和卵母细胞减数分裂进程fJJ-中国兽医学 报,2002,22(4):327—329. 【8】DelosReyesM,LapierreL,SaenzL,eta1.Effectofthelenth ofthehormonalsupplementationoninvitromaturationof porcineoocytesfJJ1Theriogenology,2001,55(1):468abstr. Ect0fAdditiveMannersofHormoneintlleMaturationMediumontheGerminal VesicleChromatineConfigurationandPOmineOocytesMaturedinvitro BAoLei.ZH0UHong—bin.LIYue-min (keylabofemb~oengineering,southwestuniversity,Chongqing400716) Abstract:Hormoneisanimportantfactoraffecttheoocytenuclearmaturationandcytoplastmaturationin—vitro maturationfIVM1ofporcine.ViastainedwithH33342.thisexperimentcontractedeffectofappenddifferenthormone inthematurationmediumofporcineoocytesmaturedinvitrowhiletheoocyteswereculturedinthemediumwith FSHwithouthormone,FSH+LHwithouthormone.Duringtheformer24handtheninthemediumwithorwithout hormoneinthelater24h.Theresuhsindicate:f1)Informer24hofIVM.theGVIVrateofoocytescuhuredinIVM mediumwithFSH+LHwaslowerthanthatcuhuredinthemediumwithFSH(8.99%vsl7.19%,P>0.05).(2)The additionofLHduringtheformer24hand~llow24hIVMhadalsoimprovedoocytestoGVBD.(3)Nuclear maturationrateofgroupFSH+LHwithouthormoneisdistincthighertheothersgroup(P<0.05). Keywords:FSH;LH;OocytesMaturein—vitro;Porcine