产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养

产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养 产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养 科技情报开发与经济SC1一TECHINFORMATIONDEVELOPMENT&ECONOMY2010年第2O卷第11期 文章编号:l0o56o33(2010)ll—Ol28—04收稿日期:2010-02—28 产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养 郑正 (清远职业技术学院食品药品系,广东清远,5ll5lO) 摘要:L_苯丙氨酸是人体8种必需氨基酸之一.酶法转化是目前生产L.苯丙氨酸的 主要.为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量,对可高效表达苯丙氨酸解氨酶基因的重 组大肠杆菌JM105进行培养,对发酵过程中pH值对工程茵生长的影响进行了研究. 结果表明,摇瓶培养条件下,控制发酵过程中发酵液的pH值可显着提高茵体产量,当 控制pH值为7.0左右时,茵体量比对照高87%.在初始pH值为7.5的情况下,培养 10h后将培养液pH值分别调整为5.5…606.5…707.5和8.0,则以pH值为7.5时的 茵体量最高.lOL发酵罐中控制发酵液pH值为7.5,茵体密度可达A~=20mol/L (DCW=IlL).比不控制pH值高出33%.试验结果为进一步开展该工程茵的高密度 培养提供了一定的参考. 关键词:苯丙氨酸解氨酶;重组大肠杆菌;工程茵;发酵pH值 中图分类号:Q939.11文献标识码:A 1苯丙氨酸及其生产 L一苯丙氨酸是人体8种必需氨基酸之一,用于制备多种氨 基酸输液,综合氨基酸制剂以及营养强化剂,是功能性食品添加 剂阿斯巴甜(APM)生产的主要原料【I'.L一苯丙氨酸的生产主要 有蛋白质水解提取法,化学合成法,发酵法和酶法.其中,发酵法 和酶法是主要的生产方法.直接发酵法由于可直接利用农副产 品生产苯丙氨酸而受到人们的重视,但该方法仍面临着微生物 体内复杂的调控机制,发酵液组分复杂,提取困难等问题.酶法 又称二步生产法,是首先通过发酵培养获得大量微生物,再利用 微生物细胞内的酶系催化L_苯丙氨酸的合成前体如苯丙酮酸或 肉桂酸合成L一苯丙氨酸.因此实际是发酵和酶法转化的结合.酶 法生产由于具有产物浓度高,纯化步骤少,生产能力强等优点, 目前被大部分苯丙氨酸生产厂家所采用,但是该方法的一个致 命缺点是生产成本过高.酶法苯丙氨酸生产有两条常用的生产 路线,一条以苯丙酮酸转氨酶催化苯丙酮酸生成苯丙氨酸,另一 条途径是以苯丙氨酸解氨酶催化肉桂酸生成苯丙氨酸.近年来, 由于肉桂酸合成技术的不断发展,肉桂酸的生产成本不断下降, 加之苯丙氨酸解氨酶转化法简便,转化率高,所以该方法在 工业生产中极富竞争力. 目前在国外,L一苯丙氨酸主要由美国纽特公司,日本味之素 公司,韩国大象公司,德国迪高萨公司等几家大公司生产,主要 利用酶法生产,国外报道的利用苯丙氨酸解氨酶生产苯丙氨酸 的产量(以累积产量计)可达60r/L左右. 在国内.L一苯丙氨酸的生产主要是通过培养粘红酵母 (Rhodotorulaglutinis)来获得含有苯丙氨酸解氨酶的酵母菌体, 收集菌体后以肉桂酸为底物生成苯丙氨酸.但粘红酵母由于自 身生理特性影响.导致培养过程中苯丙氨酸解氨酶酶活和酶量 的波动性非常大,生产不稳定,而且粘红酵母细胞壁含有较多的 氨基葡萄糖和由半乳糖,墨角藻糖与甘露聚糖形成的特殊结构, 加之可能在外层还有一层蛋白质分子,造成粘红酵母细胞的通 l28 透性较低.不利于细胞内苯丙氨酸解氨酶与细胞外肉桂酸之间 的接触,从而使转化效率降低,使得目前国内苯丙氨酸的生产成 本长期居高不下,严重制约了我国苯丙氨酸的生产.因此一些学 者采用苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌来高效表达合成PALt蚓, 进行L_苯丙氨酸的生产. 虽然目前PAL在大肠杆菌中可以得到高效表达,但如何实 现重组菌株的高密度培养方面的研究少见报道.基因工程菌高 密度发酵技术是基因工程技术生产应用的基础,能否实现高密 度培养及高目标产物浓度,是工程菌能否以较低成本实现规模 ,必须结合高密度发酵的各个工艺条 生产的决定性因素.因此 件,简化操作工艺,降低工业成本,最终使目标产物生产的规模 化和产业化得以实现. 2影响工程菌生长的因素 2.1营养物质 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几 倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产 物的需要.一般使用的培养基为半合成培养基,培养基各组分 的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长, 特别是碳源和氮源的比例.葡萄糖(Glu)因细菌利用快且价廉易 得,已被广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质.一般Gh的 质量浓度控制在l0L左右,如果超过20srL将会抑制细胞的 生长.同时已有人用甘油代替Glu作为细菌生长的碳源,以减少 代谢抑制物质——乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外 源蛋白的高表达.NO3-.胰蛋白胨(Tr),酵母提取物(Ye)作为氮源 有利于细胞的生长.有些营养物质在高密度培养过程中可以控 制细胞的死亡率.曾有报道在非洲绿猴肾成纤维细胞系(VERO cel1)培养过程中,加入半乳糖和谷胱甘肽可以阻止细胞程序性死 亡【.另外还有实验数据表明,在培养基中加入重组蛋白表达的 前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高.比如利 用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(GSH)时,在发酵开始和进行12h 郑正产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养本刊E-maihbjb@sxinfo.net科技论坛 后,各添加2.0g/L腺苷三磷酸(ATP)和9mmol/L前体氨基酸,可 以使细胞浓度和GSH的产量分别比不添加这两种物质提高 24%和1.4倍e. 2.2培养条件 2.2.1接种量 接种量大小的控制对很多细胞培养和代谢物积累都起到重 要的作用[9】.接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响 较明显.接种量小(0.5%-4%)时,比生长速率大,对数生长期持 续时间长,接种量大(>8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生 长时间短,自溶也较快,所以接种量一般选择在4%以下[1o-lH. 2.2.2溶氧浓度 溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之 , .大肠杆菌的生长代谢过程需要氧气的参与,溶解氧浓度对菌 体的生长和产物生成的影响很大,溶解氧的浓度过高或过低都 会影响细菌的代谢.在高密度发酵过程中,由于菌体密度高,发 酵液的摄氧量大,一般通过增大搅拌转速和增加空气流量以增 加溶氧量.随着发酵时间的延长,菌体密度迅速增加,溶氧浓度 随之下降.因此在高密度发酵的后期,需要维持较高水平的溶氧 浓度. 目前,提高溶氧量的方法主要有:通入纯氧来提高氧的传递 水平,但可能导致局部混合不匀,易使微生物氧中毒;在菌体中 克隆具有提高氧传递能力的透明颤藻蛋白(VHB);培养基中 添加HO:,利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生O;提高氧的分 压. 2.2.3pH值 稳定的pH值是菌体保持最佳生长状态的必要条件.由于外 界的pH值变化会改变菌体细胞内的pH值,从而影响细菌的代 谢反应,进而影响细胞的生物量和基因产物的表达.E.coli发酵 时产生的有机酸(主要是乙酸)可导致发酵液的pH值降低,细胞 释放的CO:溶解于发酵液内与H20作用生成的碳酸也会导致发 酵液pH值的降低.在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸 和CO:,可使pH值显着降低.必须及时调节pH值使之处于适宜 的pH值范围内,避免pH值激烈变化对细胞生长和代谢造成不 利影响.菌体生长和产物合成过程中,常用于控制pH值的酸碱 有HC1,NaOH和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充 氮源的作用.但有研究发现,NH4~浓度对大肠杆菌的生长有很大 影响,当NHd的浓度高于170mmol/L时会严重抑制大肠杆菌的 生长. 2.2.4温度 培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素.较 高的温度有利于细菌的高密度发酵,低温培养能提高重组产物 的表达量,而且在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提 高细菌的生长密度和重组产物的表达量,并可缩短培养周期.但 细胞生长的温度突然升高细胞内就会生成某些热激蛋白,以适 应变化的环境,外源蛋白相对量降低,给后续的纯化造成困难. 如果温度升高的范围不太大,热激蛋白合成的速度会很快下降, 恢复正常蛋白的合成.对于采用温度调控基因表达或质粒复制 的重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不 同的培养温度.但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组 蛋白量. 2.2.5补料控制 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键在于补料策略,即采 用合理的营养流加方式.常用的流加模式有非反馈补料和反馈 补料. 2.3生长抑制因子 2.3.1乙酸 以Glu为碳源的大肠杆菌的生长,常伴随着乙酸的分泌.进 而影响细胞生长和蛋白表达.乙酸的分泌可以通过维持较低浓 度的Glu或补充Ye等来减少合成代谢.当残留的Glu的质量浓 度<1g,L和乙酸的质量浓度<2?L时,不存在大肠杆菌细胞生长 的抑制因子.乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环 有关.目前国外已有研究希望通过代谢工程改变重组大肠杆菌 的代谢途径,从而降低乙酸的生成. 2_3.2C0的积累 高密度发酵过程中,细菌代谢产物CO的积累也会抑制外 源蛋白的表达.因为CO:对菌体具有直接的毒害作用,而且溶解 于发酵液中也会导致pH值的下降. 3论文的研究内容 在已成功构建含苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌基础 上,对工程菌生长的适宜pH值及培养过程中pH值的控制策略 进行初步研究,为工程菌的高密度培养提供参考资料. 4材料与方法 4.1菌种 重组大肠杆菌JM105(PBV1-PAL,携带PAL基因,Amp抗 性),天津科技大学天津工业微生物重点实验室提供. 4.2培养基 4I2.1种子培养基 蛋白胨1,酵母粉O.5,NaC11,葡萄糖0.1,氨苄青霉素O.05, pH值7.0. 4.2.2发酵培养基 葡萄糖2%,KH2PO41.33%,(NH4)2HPO4O.4%,MgSO4?7H20 0.12%,柠檬酸O.17%,微量元素:EDTA8.4ms/L,COC12"6H202.5 mg/L,MnCI,'4H2015mg/L,CuCI~'4H201.5mS/L,HsB043mg,L, Na2Mo04?2H202.5ms/L,Zn(CH3C00)2"2H20,pH值7.0. 4.3主要仪器设备 主要仪器设备及生产厂家见表1. 表1主要仪器设备 仪器名称生产厂家 JA1103电子天平上海民桥电子仪器厂 HH?B11?360一S电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂 DGG型电热鼓风干燥箱天津天字机电有限公司 SW—cJ-IF洁净工作台苏净集团安泰公司 B10TECH一2002.10BSl0L上海保兴生物设备工程有限公司 全自动发酵罐 4.4培养方法 4.4.1种子培养 将菌种吸取1mL转入装有50mL种子培养基的500mL三 角瓶中,30?,200r/min培养12h. 129 郑正产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养本刊E—maihbjb@sxinfo.net科技论 坛 4.4.2摇瓶培养 上述种子以10%接种量转入装有100mL发酵培养基的500 mL三角瓶中,30?,200dmin培养24h. 4.4-3发酵罐培养 10L发酵罐装液量6L,以10%接种量将种子接人发酵培养 基,3O?,初始转速350r/min,培养过程转速随溶氧(DO)变化自 动调整,保持DO值为30%. 4.5菌体浓度测定 发酵液稀释一定倍数,在600nm下测定吸光度,并乘稀释 倍数得到.以A表征菌体浓度. 5结果与讨论 5.1pH值对菌体生长的影响 在摇瓶发酵过程中,用2mol/LNaOHi皓j整发酵液pH值,使 其始终控制在7.0左右(大肠杆菌最适生长pH值为6.8—8.0),并 设立对照(即不控制pH值),观察菌体的生长情况.实验结果表 明,在控制pH值条件下,培养24h后,达到4.09mol/L,明显 高于对照(见图la).不控制pH值条件下,培养24h发酵液pH 值已经降到4.72(见图lb),这种pH值抑制了菌体的生长.试验 结果说明培养液pH值对工程菌的生长有重要的影响. 5 蓄4s 羞-控制pH值对照一控制pH值对照 ab 图1pH值对菌体生长的影响 5.2不同pH值对工程菌生长的影响 从以上实验得出,pH值对菌体生长影响很大.为了进一步 了解发酵过程中不同pH值对菌体生长的影响,将发酵培养基的 初始pH值设定在7.5,并在整个发酵过程中监控pH值的变化, 当发酵液pH值降到6.5左右时(大约培养l0h后),分别用灭菌 的2mol/LNaOH以及5mol/LH3PO调整发酵液pH值分另0为 5.5,6.0,6.5…707.5,8.0,并控制pH值直到发酵结束,观察菌体 生长情况. 试验结果见图2.在pH值低于7.5时,菌体量随着控制发酵 液pH值的升高而升高,当pH值控制在7.5左右时,菌体量达到 最大.随着控制发酵液pH值的继续升高,菌体量开始下降,表明 当发酵液pH值控制在7.5以上时已经不适合_T程菌的生长.试 验结果进一步表明,该重组大肠杆菌的最适生长pH值应为7.0, 7.5,过高的pH值对于菌体生长同样不利. 5.3发酵罐培养中控制pH值对工程茵生长的影响 在以上摇瓶发酵基础上,利用10L发酵罐研究发酵工程中 控制pH值对菌体生长的影响.试验结果见图3.在不控制pH值 时,工程菌在5h一10h培养前期,菌体生长较快,但培养10h后, 发酵液的pH值下降,导致菌体生长缓慢,在培养至18h时,葡 萄糖耗净,菌体开始利用乙酸等代谢副产物,从而使发酵液的 pH值又有所上升,但菌体量基本不再提高.而控制pH值在培养 130 三 量 褪 5.O5.56.06.57.O7.58.08.5 pH值 图2pH值对菌体生长及产酶的影响 的6h一20h期间,生长非常迅速,在培养至20h时菌体浓度 ()达到20mol/L左右,而不控制pH值的最高菌体浓度(^) 为15mol/L左右.控制pH值比不控制pH值菌体量提高了 33% 星 垦 矮 翘 02468lOl2l4l6l8202224 时问,h 图3发酵罐控制pH值对菌体生长的影响 以上试验结果表明,pH值对于工程菌的生长具有重要的影 响,在培养前期,工程菌大量利用碳氮源来满足自身的生长需 求,而培养基的pH值也基本可以满足菌体对培养环境中pH值 的要求,从而菌体能够迅速生长.当菌体生长到一定时期时,菌 体开始合成酶,同时开始合成和分泌大量酸性副产物,如乙酸 等,这些副产物使发酵液的pH值开始下降,开始抑制菌体的生 长,到培养后期,培养基中的pH值已经完全抑制菌体生长.从而 使菌体过早的停止生长而进入衰亡期.因此,控制发酵过程中发 酵液的pH值,使其始终处于菌体生长最适的pH值范围,对获 得高密度菌体是非常必要的.Ryan等在培养产/3一内酰胺酶的重 组大肠杆菌DB时,研究在控制3种不同pH值(7.0…748.O)条 件下菌体生长以及B一内酰胺酶产酶情况,结果表明,随着pH值 的增加,菌体的比生长速率在下降,但是B一内酰胺酶的酶活和菌 体量却是在pH值为7.4时达到最高.这表明过高的pH值并不 适合菌体生长和产物表达.PinarCalik等】研究了重组大肠杆 菌生产苯甲醛裂解酶时维持pH值(5.0,6.4,6.7,7.0,7.2,7.8)与 不维持pH值(初始pH值7.2)对菌体生长和苯甲醛裂解酶生产 的影响.结果表明,当控制pH值为7.8时,副产物乙酸的积累量 是最高的,而此时的菌体量却是较低的,原因可能是由于当维持 较高的pH值时,胞外pH值高于胞内pH值,从而在胞内外形成 了不利菌体生长的质子电化学梯度,导致菌体生长受到抑制.吴 军等【l】在培养rI1一工程菌K802时发现,适当提高发酵培养基的 初始pH值有利于减小乙酸的抑制作用,菌体量和产物表达水平 都有一定幅度的提高.我们的试验也发现,当控制pH值在7.5 5O5O5O5如加.加墙Mm8642O 郑正产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养 时,得到的菌体密度是最高的.同时表明适当提高培养基的初始 pH值可以减少乙酸等有机酸的积累,有利于菌体生长和产物的 形成.' 参考文献 [1]KoukolJ,CounEE.Metabolismofaromaticcompoundsin higherplants,IV,Purificationandpropertiesofphenylalanine deaminaseofHordenvulgare[J].Biolchem,1961(236):2692,2698. [2]JahuenW,HahlbrockK.Differentialregulationandtissue specificdistributionofenzymeofphenypropanoidpathwaysin developingparsleyseeding[J].Planta,1988(173):453-458. [3]JenRosier,lqorianKrekel,NikolausAmrhein,eta1.Maize phenylalanineammonialyasehastyrosineammonialyase activity[J].Plantphysiol,l997(1l3):175—179. [4]SikoraLA,MarzluffGA.RegulationofL-phenylalanine ammonialyasebyL—phenylalanineandnitrogeninNeurosporo Crassa[J].JBacteriol,1982(150):1287—1292. [5]MarusiehWC,JensenAR.InductionofL-phenylalanine ammonialyaseduringutilizationofphenylalanineasacarbonsource ornitrogensourceinRhodotorulaglutinis[J].JournalofBacteriology, 1981(146):1013—1019. [6]OmdorffSA,ConstantinoN,StewartD.Strainimprovementof RhodotorulegraminisforproductionofanovelL—phenylalanine ammonialyase[J].ApplEnviromMicrobiol,1988(54):996—1002. f7]WatanabeSK,Hernandez—VelazwG,lturbe—ChinasF. PhenylalanineammonialyasefromSporidioboluspararoseusand Rhodospordiumtorulides:applicationforphenylalanineand tryrosinedeamination[J].WorldjMicrobiolBiotechnol,1992(8): 406—4lO. [8]AmbrusCM,AmbrusJL,HorwathC.Phenylalaninedepletion formanagementofphenylketonuria:useofenzymereatorswith 本刊E-mail:bjb@sxinfo.net科技论坛 immobilizedenzyoleslJJ.Science,1978(201):837—839. 【9JEl—Bata1.Optimizationofreationconditionandstabilizationof phenylalanineammonialyase—containingRhosotorulaglutiniscells duringbioconversionoftrans—cinnamicacidtoL—Phenylalanine[J]. Acta—MicrobiolPo1.2002(51):l39—152. [10]GodwinB,CunhaD.Enrichmentofphenylalanineammonia lyaseactivityofRhosotomlayeastlJj.EnzymeandMierobial Technology.2005(36):498—502. [11]杨顺楷,李果龙,赵健身.酵母全细胞苯丙氨酸鲜氨酶 (PAL)活性的紫外分光光度测定法[J].天然产物研究与开发, 1990(1):59—62. [12]WenRyan,SatishJParulekar,BenjaminCstark.Expression of13-lactamasebyrecombinantEscherivhiaColistrainscontaining plasmidsofdifferentsizes—effectsofpH,phosphate,anddissolved oxygen[J].BiotechnologyandBioengineering,l989(34):309—319. [13]PinarCalik,PinarYilgor,AyhanSDemir.Influenceof controlledpHanduncontrolledpHoperationsonrecombinant benzaldehydelyaseproductionbyEscherichiaColi[J].Enzymeand MicrobialTechnology,2006(38):617—627. [14]吴军,于公义,冯尔玲.基因工程菌培养过程中乙酸的积累 及其对工程菌生长和产物表达的影响[J].生物技术通讯,1996,7 (2):71—74. (责任编辑:王永胜) 第一作者简介:郑正,男,1983年生,2007年毕业于宁夏 大学,实验员,清远职业技术学院食品药品系,广东省清远市, 5l151O. TheCultureofRecombinantEscherichiacoli ProducingPhenylalanineAmmoniaLyase ZHENGZheng ABSTRACT:L— phenylalanine(L-phe)isoneofeightnecessaryaminoacidsinhumanbody.Conversionby phenylalanineammonialyase(PLA)istheprimarywaytoproduceL-phe.InordertoincreasetheyieldofPLA,a recombinedEscherichiacolistrainJM105wasculturedandtheeffectofpHvaluesofmediumonthegrowthofthisstrain wasstudies.Theresultsshowthatintheshakeflask,biomassofrecombinedE.coliincreasesobviouslybycontrollingthe pHvalueofmedium.WhenthemediumpHvalueismaintainedaroundthepointof7.0,thebiomassofE.coliis87%higher thanthatofthecontro1.WhentheinitialpHis7.5,after10hours'culture,themediumpHvalueisadjustedto5.5,6.0, 6.5,7.0,7.5and8.0respectively,andthehighestbiomassofE.coliisobtainedunderthepHvalueof7.5.Inthe10L fermentor,biomassofE.coliA600reaches20mol/L(DCW=I1g/L)whenpHofmediumismaintainedaround7.5,whichis 33%higherthanthatofthecontro1.Thetestresultsprovidetherefereneetothehigherdensitycultureofthisrecombined bacterium. KEYWORDS:phenylalanineammonialyase;recombinantEscherichiacoli;engineeringbacteria;pHvaluein ferlnentati0" l3l