医药学论文-自体窦房结组织移植治疗心脏传导阻滞的研究

医药学论文-自体窦房结组织移植治疗心脏传导阻滞的研究 作者:赵璧君，金振晓，张金 【摘要】 目的: 观察兔窦房结组织同体移植后心脏电生理的变化以及窦房结与心肌细胞连 接，以期为房室传导阻滞的治疗探索新思路与方法. 方法: 将兔窦房结组织移植于同体右心 室心外膜下，于1，2，3，4 wk观测右心室心电生理及移植后的窦房结组织学及超微结构变 化. 结果: 移植窦房结组织可以存活，并与心肌细胞建立桥粒连接，但细胞连接数目不多， 不能起搏心室. 心脏电生理无明显变化. 结论: 移植入同体心室的窦房结组织细胞可以和心 肌细胞建立细胞连接. 【关键词】 移植;窦房结;心脏传导阻滞 【Abstract】 AIM: To observe the electrical coupling of sinoatrial node cells with ventricular muscle cells after sinoatrial node autotransplantation,and to probe new methods for cure of atrioventricular block. METHODS: The sinoatrial node of rabbits was cut off, and was autotransplanted into right ventricle. At week 1,2,3,4, electrocardiogram of the rabbits was examined, and transplanted sinoatrial node was observed under microscope and transmission electron microscope. RESULTS: The autotransplanted sinoatrial node lived. Desmosome was seen between myocardial cells and sinoatrial node cells. But the number was small, and didn t pace heart. The electrocardiogram didn t change obviously.CONCLUSION: Electrical coupling between ventricular myocardial cells and sinoatrial node cells is seen at the edge of transplanted sinoatrial node. 【Keywords】 transplantation; sinoatrial node; heart block 0 引言 完全房室传导阻滞是心脏手术严重并发症之一，洛杉矶儿童医院 5662例先心病手术统计结果，65例发生永久性完全房室传导阻滞(1.18%). 放置人工起搏 器价格较高、寿命有限，且婴幼儿放置人工起搏器的并发症也较多. 文献明在原代培养几 小时内的心肌细胞间可以建立起细胞连接，成为电活动的统一体. 窦房结组织的起搏信号是 通过细胞连接传导入的. 我们研究将窦房结组织移植于心室中，观察其能否存活并与心室肌 建立细胞连接;探索新的治疗思路. 1 和方法 1.1 材料 新西兰兔30只，雌雄不拘，质量2.8,3.1 kg，第四军医大学实验动物中 心提供，将新西兰兔随机分为移植组和对照组，各15只. 日本电子JEM2000EX透射式电子显 微镜，8导生理记录仪由第四军医大学生理教研室提供. 1.2 方法 1.2.1 试验方法 30 g/L戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉(30 mg/kg),仰卧位固定，牵 引门齿，胸部脱毛、消毒、铺单. 沿胸骨右缘纵切口(约5 cm)，开胸暴露心脏. 根据解剖 位置找到窦房结，仔细观察最先搏动点，用5 0涤纶无创线缝一针作为标记，以其为中心， 5 0普洛林线缝合一个直径约6 mm的荷包，轻轻提紧标记线，结扎荷包线，以标记线为中 心，剪下2,3 mm大小的组织. 在剪下窦房结组织之前，在右心室表面无血管区选择一个直 径约6 mm的区域，在4个角分别用5 0普洛林线间断缝合一针固定线，剪下窦房结组织之 后，在区域中间切一个长约5 mm，深及右心室厚度一半的切口，将窦房结组织连同标记线放 入切口内，4根固定线两两相对打结，用以固定、包埋窦房结组织，并起到止血作用. 关胸， 并穿刺吸尽胸腔残气. 对照组仅取掉窦房结组织，并在右心室表面切5 mm长，深及心室厚度 一半的切口并缝合. 1.2.2 电生理观测 在手术后1，2，3，4 wk分别从每组取2只动物麻醉开胸，用8 导生理记录仪分别记录正常组对照组和移植组右心室心表心电图. 1.2.3 组织学观察 家兔心脏取出后,用清水缓流冲去心腔血液,以标记线和固定线为 中心，将右心室壁全层切下7 mm见方的组织，立即置于10,15 g/L甲醛溶液中固定72 h,常规脱水浸蜡包埋,作水平面连续切片,片厚6 μ,,每10取1,进行常规HE染色、Masson三色染色后,在日本Olympus双目光学显微镜下观察、测量、照相. 1.2.4 超微结构观察 以标记线为中心取右心室移植区域的组织立即置于25 g/L戊二醛溶液中, 4?固定2 h以上,以0.1 mol/L磷酸缓冲液浸洗,再用10 g/L四氧化饿后固定2 h,0.1 mol/L磷酸缓冲液再浸洗,乙醇系列脱水,Epon 812#包埋,聚合后做半超薄切片,美兰染色,在光镜下定位,选取细胞小、界限不清、染色淡的组织团块作为观察目标,再以瑞典CKB超薄切片机切片,厚度50 nm左右,柠檬酸铅、醋酸铀染色,在日本电子JEM2000EX透射式电子显微镜下观察、拍照. 2 结果 2.1 光镜组织学观察 P细胞较小,在结的中心区多见,细胞质胞浆淡染有空旷感,边界不清楚,T细胞介于P细胞和普通心肌细胞之间,具有中间过渡性质,直径较P细胞小,以窦房结周边部多见. 窦房结移植于同体右心室后，窦房结细胞部分是和心室肌细胞毗邻，部分中间相隔2,3层纤维细胞. 2.2 电镜超细微结构观察 窦房结细胞胞质内有少量散乱的肌微丝,未见到明显Z线和完整的肌节,线粒体数目较少;心肌细胞肌丝密集、排列整齐，肌节整齐(图1A)，窦房结细胞和心室肌细胞建立了桥粒连接(图1B). A: 对照组，箭头所指为心肌细胞间的闰盘(连接复合体) ×25 000; B: 移植组(1 wk)箭头所指为窦房结细胞与心肌细胞间的桥粒连接 ×30000 图1 窦房结细胞超微结构(略) 作者:赵璧君，金振晓，张金 2.3 电生理记录 发现每一组在4 wk过程中，移植组和对照组的心电图无明显区别(图2A，B). A: 对照组; B: 移植组 图2 心电图变化(略) 3 讨论 窦房结组织中心区域起搏细胞比例大，越向外周过渡细胞及心房肌细胞逐渐增多. 窦房结组织和周围心房组织之间没有绝对的分界，起搏细胞、过渡细胞、心房肌细胞从形态上也是逐渐过渡的. 窦房结的起搏细胞并非只和过渡细胞有细胞间连接，也可以与心房肌细胞建立细胞间连接，从窦房结的中心区域到外周，细胞间连接越来越多，传播速度越来越快，既满足起搏的需要，也可防止折返. 心肌细胞通过细胞间连接使心脏形成电活动的统一体，而其他细胞没有这一特点，所以心肌细胞和纤维细胞之间不能建立连接，因此心房的电信号不能跨越房室环到达心室，只能通过房室束传导，或者是其他的跨越房室环的变异的特化心肌纤维束如Kent束等，损伤了房室束就会造成房室传导阻滞. 心房肌除了有分泌功能外，其他特点和心室肌细胞十分相似,2-3, . 本研究电镜结果可见移植到心室的窦房结组织不但可以存活，还和心室肌细胞建立了桥粒连接，意味着可以传导电活动，因此移植的窦房结就有可能成为心室的起搏点. 窦房结组织的边缘区存在着大量的心房肌细胞、起搏细胞和过渡细胞混合在一起，彼此间已经证实存在有细胞连接，如果不能判断心房肌细胞和心室肌细胞，很可能把窦房结细胞和心房细胞原有的连接误判成窦房结细胞与心室肌细胞新建立起来的连接. 判断桥粒两边窦房结细胞和心室肌细胞主要根据其超微结构，电镜下窦房结的特点是细胞核大，胞浆、线粒体和肌丝少，排列和肌节不规则. 而心肌细胞不管是哪种切面，都会看到大量的整齐排列的肌丝，纵切面还可以看到明显而整齐的肌节. 心房肌细胞因为有分泌功能，胞浆内一般都可以找到分泌颗粒，借此与心室肌细胞区别. 本研究移植组15只动物中有3只因故死亡，另12只动物标本中只有2例发现了窦房结细胞和心肌细胞的桥粒连接，说明这种连接建立的比例不高. 观察细胞间的连接，除了用电镜方法外， 还有两种方法，一是免疫荧光法，将连接蛋白用荧光标记，然后在荧光显微镜下观察，但荧光显微镜下细胞背景不清楚，只能证明有连接蛋白的存在，而不容易分清楚连接蛋白两侧的细胞到底是窦房结细胞，还是心肌细胞. 另一种是免疫组织化学的方法标记连接蛋白，然后在激光共聚焦显微镜下观察，由于缝隙连接蛋白在心脏细胞间连接所占比例较大，所以这种方法阳性检出率高. 在电镜下心房肌细胞一般都有分泌颗粒，籍此分别两种细胞，误判的可能性比上两种方法大大减少,4-5,. 电生理结果令人失望，移植组心电图没有变化，移植的窦房结并没有起到起搏作用. 可能是由于房室结下传的冲动频率很快，移植的窦房结电活动被周围的心室肌电活动所抑制,6,. 除了移植窦房结组织和心肌细胞建立的连接少，不足以起搏心室之外，窦房结的电生理特点是否在心室环境中发生了改变,有待进一步研究. 【参考文献】 ,1, Boyett MR.Regional differences in effects of 4 aminopyridine within the sinoatrial node,J,. Cardiovasc Res,2000,47(20):658-687. ,2, 仝识非. 模拟缺血对培养乳鼠窦房结细胞膜KATP通道电流的影响,J,.重庆医学,2007,36(10):945-946. ,3, 张 倩. 线粒体KATP通道开放剂与缺氧预适应对乳鼠窦房结细胞起搏离子流作用的比较,J,.中国病理生理杂志,2006,22(10):1909-1912. ,4, 魏益平. 原代培养乳鼠窦房结细胞的形态和kir2.1蛋白表达,J,. 南方医科大学学报,2007,27(11):1701-1705. ,5, 张 倩. 模拟缺血预适应对原代培养乳鼠窦房结细胞起搏离子流的影响,J,. 第三军医大学学报,2006,28(4):305-307. ,6, 张 浩. 自体窦房结细胞移植治疗心脏传导阻滞的初步研究,J,. 第二军医大学学报,2007,28(3):233-236.