口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装_cropped

口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装_cropped 口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装 1 1 1 2 1 1 郭慧琛,刘在新,孙世琪,冷青文,刘湘涛,谢庆阁 (11 中国农业科学院 兰州兽医研究所 农业部畜禽重点实验室 ,兰州 730046 ; )21 石河子大学 动物科技学院 ,石河子 832003 摘要 : PCR 扩增获得包含口蹄疫病毒 P1 、2A 、3C 、3D 及部分 2B 编码区的目的基因片段 P12 X3C3D ,将 P12 X3C3D 经 ( ) A f l ?和 X ba I 双酶切后 ,定向克隆于真核表达质粒载体 pcDNA3 . 1 + ;另将 PCR 扩增获得的 P12 X3C3D 直接与 TM 真核表 达 质 粒 载 体 p TAR GE T连 接 , 进 行 筛 选 、鉴 定 及 DNA 序 列 分 析 , 分 别 获 得 重 组 质 粒 pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D 、p TAR GE T/ P12 X3C3D。将重组质粒分别转染 B H K221 细胞 ,通过双抗体夹心 EL ISA 方法和间接免疫 荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原 ,用磷钨酸负染 ,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装 的口蹄疫病毒空衣壳 。结果表明 ,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上 ,重组质粒 pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D 、p TAR GE T/ P12 X3C3D 均 可 在 B H K221 细 胞 中 表 达 FMDV 目 的 蛋 白 。其 中 重 组 质 粒 p TAR GE T/ P12 X3C3D 表达的口蹄疫病毒抗原蛋白 ,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳 。 关键词 :口蹄疫病毒 ; 真核表达质粒 ; B H K221 ; 体外表达 () 文章编号 :1000 - 8721 200503 - 0228 - 07 中图分类号 : S856165916 文献标识码 :A () 口蹄疫 foot2and2mo ut h disease , FMD是偶蹄 空衣壳对于研究重组疫苗是一个很好的选 FMDV 动物共患的一种急性 、烈性 、接触性传染病 ,通过空 择 。本研究则利用 FMDV 空衣壳的这种特点和优 气传播 ,有广泛的动物宿主 ,对人有一定的感染性 , 势 ,并根 据 非 结 构 蛋 白 的 免 疫 功 能 选 择 了 FMDV 是一种受到关注的人畜共患病 。引起口蹄疫的病原 P1 、2A 、3C 、3D 等基因 。 由于基因免疫是将带有目的抗原基因的重组表 (为小 RNA 病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒 foot2 达载体直接导入动物体内 ,利用其表达出的抗原蛋 ) and2mo ut h disease virus , FMDV。在 FMDV 感染细白诱发机体的免疫应答反应 ,因此 ,在将重组真核表 胞中 , 由病毒基因组 RNA 编码合成的多聚蛋白首 达质粒作为 FMD 基因疫苗进行动物实验之前 , 必 先在病毒蛋白酶的作用下 ,裂解为 4 个原始的裂解 须首先证明这些重组真核表达质粒能够在体外哺乳 1 ( ) 产物 , 即 前 导 蛋 白 酶 L 、P122A 、P2 和 P3 。P12动物细胞中表达目的蛋白 。据此 ,本实验利用真核 2 ,3 表达质粒的生物学特性 ,将包含有 FMDV 有关抗原 2A 氨 基 末 端 对 于 衣 壳 的 正 确 组 装 是 必 需 的。 基因的重组真核表达质粒分别转染 B H K221 细胞 , FMDV 的衣壳由 V P1 、V P2 、V P3 、V P4 四种蛋白构 检测其在真核细胞中的蛋白表达及病毒衣壳的组装 成 ,V P4 连接于衣壳内表面 。而衣壳外的一个结构 情况 。实验结果将为口蹄疫基因疫苗的研制提供有 特征是 ,在 V P1 蛋白上带有一个长的 、结构稳定的力的实验依据和支持 ,并可能为口蹄疫病毒衣壳的 G2H 环 ,环上的氨基酸包含能刺激免疫反应的 T 、B 组装提供新的思路 。 细胞表位 ,这在病毒表面形成一个主要的抗原位点 。 有实验显示 ,缺乏核酸但包含病毒抗原蛋白的病毒 衣壳 ,不仅能诱导机体产生免疫反应 ,而且这些空衣 壳能诱导与完全病毒粒子相同的特异性中和抗体 。 材料与方法 这可能是病毒衣壳和完全病毒粒子都具有中和抗体 4 ,5 的主要靶目标 ,即两者有相似的抗原性。因此 , 1 主要材料 大肠杆菌 J M109 、B H K221 细胞 、口蹄疫兔阳 性血清 、口 蹄 疫 豚 鼠 阳 性 血 清 均 由 本 室 保 存 。pcDNA3 . 1 收稿日期 :2004 - 06 - 04 ;修回日期 :2004 - 11 - 12 TM ( ) ( 基金项 目 : 国 家 重 大 基 础 研 究 发 展 规 划 973 基 金 资 助 No ( ) + 、Lipofectamine PlusReagent 购 自 Invit rogen 公 司 。)G1999011903 TM p TAR GE T 、工 具 酶 为 Pro mega 公 司 产 品 。F I TC2羊 抗 兔 ( ) 作者简介 :郭慧琛 1974 - 女 ,宁夏人 ,博士 ,主要从事动物病毒 Ig G、HR P2兔抗豚鼠 Ig G 为 Sigma 公司产品 。质粒 pcDNA3 . 分子生物学研究 。1/ P12 X3C、p GEM/ 3D 由本室构建 。 通讯作者 :刘在新 、谢庆阁 , Tel : 86 - 0931 - 83420585 ; E2mail : liukey @p ublic . lz. gs. cn , xieqgkey @p ublic . lz. gs. cn 2 引物的和合成 根据 FMDV 毒株 China/ 99 株的序 ) ( ) (( ) ( ) () 列设计两对引物 ,分别为 A + 、B 2和 C + 、Dg - 。A GE T/ P12 X3C3D 图 1。 ( ) ( )+ 5′- gg ct taag at gggagccggacaatccagcccggcgac - 3′; B - 5 序列测定及分析 对筛选出的阳性真核表达质粒 pcD2( ) 5′- gg ggtaccaacgat gaaagtctcggctccgtcc - 3′; C + 5′- gg NA3 . 1/ P12 X3C3D 、p TAR GE T/ P12 X3C3D 进 行 序 列 测 定 ,( ) ggtacc cactccgcaggcggcaacggagt t gg - 3′; Dg - 5′- gg tctaga 测定结果用 DNAstar 软件分析 。 ( ) at gcgtcaccgcacacggcgt tacaa - 3′。其 中 在 引 物 A + 中 引 入 TM 6 BHK221 细胞的转染 按照 Lipofectamine PlusReagent( ) ( ) A f l ?位点和 A T G 启始密码子 ,在引物 B - 、C + 中引 μμ(说明书操作 。4g 质粒 DNA 溶于 250l 培养液中 无胎牛血 ( ) 入 Kp n I 酶切位点 ,在引物 Dg - 中引入 X ba I 酶切位点和 TM UA G 终止密码子 。引物由大连宝生物工程公司合成 。 ) μ清和抗生 素, 再 加 入 8l PlusReagent , 混 合 后 室 温 放 置 μμ 20min 。另将 12l Lipofectamine Reagent 转染试剂溶于 250l3 重组质粒 pcD NA3 . 1/ P12 X3C3D 的构建 从 pcDNA3 . 1/ () 培养液中 无胎牛血清和抗生素,室温放置 20min 。两者混 P12 X3C 和 p GEM/ 3D 质粒上分别扩增 P12 X3C 和 3D 片段 , 合后于室温放置 20min ,将混合液缓慢添加到细胞中 , 37 ? 将回收得到的目的基因片段经 ?/ I 、I/ IA f l Kp n Kp n X ba 孵化 5 h ,移去转染混合液 ,添加 5ml 含有 10 %胎牛血清的营 ( ) 酶切后 , 与 经 A f l ?/ X ba I 酶 切 处 理 的 pcDNA3 . 1 + 连 养液 ,37 ?培养 24,48 h 后 ,收获转染细胞进行检测 。 接 ,转化大肠杆菌 J M109 ,并经电泳 、酶切 、PCR 扩增等方法 7 间接免疫荧光检测 收取培养皿中转染细胞生长密度达鉴定筛选得到阳性重组质粒 ,定名为 pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D () 图 1。 90 %以上的盖玻片 , PBS 液漂洗 1,2 次 ,冷丙酮 - 20 ?固定30min ,漂洗后吸干液体 ,滴加口蹄疫兔阳性血清 , 37 ?湿盒 中孵化 30min , PBS 液 漂 洗 5 次 , 加 F I TC2羊 抗 兔 Ig G , 37 ? 湿盒中染色 30min ,甘油封片 ,于 Olymp us 荧光显微镜下观 察 。以未转染的 B H K221 细胞作为阴性对照 。 8 双 抗 体 夹 心 EL ISA 检 测 按 文 献 报 道 的 方 法 略 加 改 6 ,7 进,转染 48 h 后取出细胞 , PBS 洗涤后胰酶消化 ,离心弃 上清 ,细胞沉淀裂解并再次离心 ,上清用于 EL ISA 检测 。96 孔酶标板用口蹄疫兔阳性血 清 包 埋 , 4 ?过 夜 , 马 血 清 封 闭 后 ,将 FMDV 抗原 、转染 pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D、p TAR GE T/ P12 X3C3D 的细胞裂解液及未转染的空白对照细胞裂解液 , 做 2 倍梯度稀释 ,每个稀释度设两复孔 。37 ?作用 1 h 后 ,洗 涤 ,加入口蹄疫豚鼠阳性抗血清 ,37 ? 作用 1 h ,洗涤后加入 HR P2兔抗豚鼠 Ig G , 37 ? 作 用 1 h , 加 入 底 物 O PD2HO, 于 2 2 λ37 ? 作用 15min ,用终止液结束反应 ,于492nm 处测定 OD值 。 9 病毒空衣壳的电镜观察 将转染 p TA GR E T/ P12 X3C3D的细胞及未转染的空白对照细胞 48 h 后取出 ,011mol/ L PBS () p H714漂 洗 3 次 后 将 细 胞 刮 下 , 反 复 冻 融 3 次 后 3000r/ min 离心 10min ,上清用于电镜观察 。 结 果 1 目的基因的获得 以 pcDNA3 . 1/ P12 X3C 质粒 DNA 为模板 ,以 A ( ) ( ) + 、B - 为 引 物 , 通 过 PCR 扩 增 反 应 得 到 的 ( ) () PCR 产物 P12 X3C大小约为 3 . 0 kb 图 2。同时以 图 1 真核表达质粒的构建 ( ) ( ) p GEM/ 3D 质粒 DNA 为模板 , 以 B + 、Dg - 为 The scheme of co nst ructio n of reco mbinant plas2 Figure 1 ( ) 引物 , 通过 PCR 扩增反应得到的 PCR 产物 3D大 mid ( ) 小约为 1 . 4 kb 图 2 。另以 pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D 4 重 组 质 粒 pTARGET/ P12 X3C3D 的 构 建 利 用 引 物 A ( ) ( ) ( ) ( ) + 、Dg - 从 pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D 质粒上 PCR 扩增目 质粒为模板 ,以 A + 、Dg - 为引物 ,通过 PCR 扩 的片段 P12 X3C3D , 将 回 收 得 到 的 目 的 基 因 片 段 直 接 与 ( ) 增反 应 得 到 的 PCR 产 物 P12 X3C3D 大 小 约 为TMp TAR GE T连 接 , 转 化 大 肠 杆 菌 J M109 , 并 经 电 泳 、酶 切 、 () 414 kb 图 2。这些片段大小均与预期片段大小一 PCR 扩增 等 方 法 筛 选 得 到 阳 性 重 组 质 粒 , 定 名 为 p TAR2 致 。 图 2 目的片段电泳结果 Figure 2 Elect rop horetic analysis of PCR p roduct s 图 4 阳性质粒 p TAR GE T/ P12 X3C3D 的鉴定结果 1 . 3D f ragment ; 2 . P12 X3C f ragment ; 3 : P12 X3C3D f ragment ; Figure 4 Identificatio n of reco mbinant vector p TAR GE T/ λM . DNA/ EcoR ?+ Hi nd ? mar ker1 P12 X3C3D 2 重组质粒的鉴定1 . p TAR GE T plasmid ; 2 . p TAR GE T/ P12 X3C3D reco mbinant vecto r ; 3 . PCR amplified P12 X3C3D f ragment ; 4 . B a m HI cleav2 对 转 化 后 经 初 步 筛 选 得 到 的 重 组 质 粒 pcD2λage ; 5 . Kp n ?cleavage ; M1DNA/ EcoR ?+ Hi n d ? mar ker1 NA3 . 1/ P12 X3C3D 用 A f l ?/ Kp n I 酶 切 得 到 入到载体质粒 p TA R GE T 中 。310 kb 和 6 . 4 kb 的 片 段 ; 用 Kp n I/ X ba I 酶 切 得 到 3 P12 X3C3D 基因的序列测定及分析() 约 1 . 4 kb 和 8 . 0 kb 的片段 图 3。根据这些片段的 对重组质粒中插入的 P12 X3C3D 基因进行 的 大小初步判定全长目的片段 P12 X3C3D 与质粒载 序列测定结果表明 , P12 X3C3D 基因的阅读框架长 体正确连接 。 4 452 bp , 编 码 1 484 个 氨 基 酸 。将 其 与 亲 本 毒 株 China 99 株的相应 基 因 序 列 进 行 比 较 , 结 果 发 现 , P12 X3C3D 基因在第 2 268,2 270 核苷酸处缺失 3 ( ) 个碱基 ,即第 757 处氨基酸缺失脯氨酸 Pro 。目的 基因片段 P12 X3C3D 与亲本毒株 China99 株的相应 编码序列的核苷酸和氨基酸同源性均为 99 . 7 % 。 4 夹心 EL ISA 的检测结果 转染 48 h 后收获的细胞裂解液用双抗体夹心 EL ISA 方 法 检 测 , 结 果 显 示 , 转 染 重 组 质 粒 pcD2图 3 阳性质粒 pcDNA311/ P12 X3C3D 的鉴定结果 NA3 . 1/ P12 X3C3D 和 p TA GR E T/ P12 X3C3D 的 细 Figure 3 Identificatio n of reco mbinant vector pcDNA311/ 胞裂解液 OD 值随倍比稀释度的增加逐渐下降 ,其 P12 X3C3D ( )1 . pcDNA311/ P12X3C3D recombinant vector ; 21pcDNA311 + ( ) 变化规律与 FMDV 抗原的 OD 值变化相同 图 5,plasmid ; 31 PCR amplified 3D f ragment ; 41 PCR amplified P12 X3C 说明重组质粒转染的 B H K221 细胞中有目的蛋白产 f ragment ; 51 PCR amplified P12 X3C3D f ragment ; 61 Kp n ?、 生 。而未转染的细胞其 OD 值随倍比稀释度的增加 λ ?cleavage ; 71 cleavage ; M1DNA/ R ?X ba A f l ?、Kpb ?Eco+ Hi nd ? mar ker . 无规律变化 ,说明细胞中无特异蛋白产生 。 用 B a m H I 酶 切 重 组 质 粒 p TA R GE T/ 对四组细胞液的原液 OD 值进行比较分析 ,结P12 X3C3D ,分别得到 1 . 5 kb 、2 . 3 kb 、6 . 2 kb 大小的 果显示 ,A 组 、B 组 、C 组的 OD 值均比作为阴性对照 片 段 , 再 以 Kp n I 酶 切 重 组 质 粒 p TA R GE T/ 组的 D 组高 ,说明质粒转染组均在 B H K221 细胞中 P12 X3C3D ,分 别 得 到 了 1 . 5 kb 和 8 . 6 kb 的 片 段 。 这些片段均与正向插入后应得到的预计片段大小相 表达出目的蛋白 。其中 C 组的 OD 值比 B 组的高 2 () 同 图 4。结合两个酶切结果说明 ,通过 PCR 扩增 () 倍左右 图 6。 反应获得的 P12 X3C3D 基因序列 ,已以正确方向插 5 间接免疫荧光检测结果 将分别转染 pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D 、p TA R 图 5 夹心 EL ISA 法检测 B H K221 细胞中目的蛋白表达 图 6 夹心 EL ISA 检测转染细胞原液抗原表达量 Figure 6 Quantit y of target p rotein in B H K221 cells tested 情况 Exp ressio n of target p rotein in B H K221 cells by sandwich2EL ISA Figure 5 A. FMDV antigen ; B. Transfected wit h pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D ; tested by sandwich2EL ISA C. Transfected wit h p TA GR E T/ P12 X3C3D ; D. U nt ransfected B H K221 cell . GE T/ P12 X3C3D 的细胞飞片和未转染的细胞飞片 异荧光 ,而未转染的空白细胞中没有出现特异荧光 , () 经荧光染色后 ,在镜下观察并拍照 。结果显示 ,转染 说明目的蛋白能够在 B H K221 细胞中表达 图 7。以上重组真核表达质粒的 B H K221 细胞中均出现特 图 7 转染的 B H K221 细胞间接免疫荧光染色 Figure 7 Transfected B H K221 cell tested by indirect immunofluorescent assay A. Transfected wit h pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D ; B. Transfected wit h p TA GR E T/ P12 X3C3D ; C. U nt ransfected B H K221 cell1 6 口蹄疫病毒空衣壳的电镜观察 将转 染 p TA R GE T/ P12 X3C3D 的 细 胞 和 未 转 讨 论 染的 细 胞 分 别 用 于 电 镜 观 察 。结 果 显 示 , 转 染 DNA S TA R 分 析 扩 增 的 用 基 因 分 析 软 件 p TA R GE T/ P12 X3C3D 的 B H K221 细胞中出现类似 病毒粒子的空衣壳 ,大小约为 30 nm 。而未转染的细 P12 X3C3D 基因序列 , 与 China99 株 相 应 基 因 片 段 胞中没 有 出 现 同 样 粒 子 , 说 明 口 蹄 疫 衣 壳 蛋 白 在 的核苷酸同源性和氨基酸同源性均为 99 . 7 % 。这 () B H K221 细胞中正确组装为空衣壳 图 8。说明得到的目的基因与亲本毒株的相应基因片段的 同源性较高 ,但两者均在氨基酸 601 位 、650 位 、766 ()图 8 转染 B H K221 细胞中的 FMDV 空衣壳 100 000 k ()Figure 8 FMDV emp t y cap sid in t ransfected B H K221 cells 100 000 k A. Transfected wit h p TAR GE T/ P12 X3C3D ; B. Purified FMDV empt y cap sid. 11 830 位发生改变 ,且在 2 268,2 270 碱基处缺失 不同组 织 中 均 表 现 出 很 高 的 活 性。而 且 , 由 于位 、 3 个碱基 ,致使氨基酸 757 处缺失一个脯氨酸 。造 CMV 启动子的转录水平高于其它启动子 ,能够优先 12 成这一缺失的原因可能与基因扩增时所用的不同聚 诱导 C TL 和抗体应答, 因此 CMV 启动子被广 合酶有关 ,提示在随后的基因获得程序中应采用高 泛应用 。本研究选用的两种哺乳动物细胞表达载体 保真 聚 合 酶 。对 O 型 FMDV 抗 原 位 点 的 研 究 发 均带有 CMV 启动子 ,这将为体外及体内的蛋白表 达提供有效保证 。 本研究为验证目的蛋白能否在现 ,O 型 FMDV 至 少 有 5 个 抗 原 位 点 , 位 点 1 由 () V P1 G2H 环 133,157和 V P1 碳末端 200,213 位 体外哺乳动物细 氨基酸残基的线性表位构成 ,是 FMDV 主要抗原位 胞中表达 ,并为检测目的蛋白的免疫原性 ,将鉴定及 点 ,其关键氨基酸为 144 、148 、154 和 208 。位 点 2 序列分析证实的 、正确的真核表达质粒转染 B H K2 βββα21 细胞后 , 采用双抗体夹心 EL ISA 方法和荧光标 位于病毒表面 V P2 的B2C 环和E2B 上 ,在三重 轴附近 ,由 4 个表位构成 ,关键氨基酸为 70 、71 、73 、 记方法检测目的蛋白的表达情况 。结果显示 ,目的 蛋白在转染重组质粒的 B H K221 细胞中能够正确表 75 、77 、131 。位点 3 位于病毒粒子表面五重轴周围 ββ V P1 的B2C 环上 , 关键氨基酸为 43 、44 。位点 4达 ,且具有免疫原性 。但转染质粒的 B H K221 细胞 ( ) β中 ,目的蛋白的表达量低于感染 FMDV 细胞中的抗 位于五重轴附近 V P3 的B“结节”kno b上 , 关键 氨基酸为 58 。位点 5 位于 V P1 G2H 环内 ,关键氨基 原量 。这可能与转染条件及转染后细胞的最佳收获 8 - 10 时间有关 。因此 , 摸索质粒 DNA 和转染试剂之间 酸为 149 ,它与位点 1 是相互独立的。本研究 得到的目的基因片段在不同氨基酸位的变异及缺失 的最适比例 ,以及转染操作的最佳条件 ,将有利于提 均不在上述的关键位点上 ,所以不会对本研究构建 高转染效率 ,从而可提高目的基因的表达量 。而且 的重组质粒的体内外表达及目的蛋白的抗原性等有 针对研究中选用的真核表达质粒载体的特点 ,掌握 明显影响 。这一理论分析将在重组真核表达质粒的 目的蛋白表达量最高的时间段 ,也将有利于保证目 体外表达实验中得到进一步证实 。 的蛋白的表达量 。除此之外 ,转入哺乳动物细胞中 本文根据基因疫苗的基本特点及研制原则 ,选 的外源基因的蛋白质表达水平还与以下因素有关 , 择能够在哺乳动物细胞中高效表达目的蛋白的真核 如 DNA 的拷贝数 、转录的效率 、mRNA 的加工过程 TM ( ) 表达质粒 载 体 pcDNA3 . 1 + 和 p TA R GE T, 以 及其稳定性 、转译的效率 、蛋白质的加工过程 ,以及 确保重组质粒在导入动物体内后目的蛋白得以表 启动子与基因的匹配 、启动子与宿主细胞的匹配情 达 ,继而刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应 。 况等 。因此 ,为了提高外源基因的表达量还必须根 哺乳动物细胞表达载体必须带有真核细胞启动子 , 据实际情况 ,选择合适的表达调控元件 ,构建合适的 根据启动子来源不同 ,可分为病毒源启动子和细胞 表达载体 。 源启动子 ,但在这些启动子中只有 CMV 启动子在 许多研究证实 ,带有内含子的载体能够使其下 13 - 16 exp ressio n systemJ . J Gen Virol ,1995 , 76 :3089 - 3098 . 游的目的蛋白表达量提高 2 , 500 倍。通过 3 Krausslich H G , Holscher C , Reuer Q , et al . M yristoylatio n of t he 进一步的研究证实 ,内含子促进蛋白表达的主要机 poliovirus polyp rotein is required fo r p roteolytic p rocessing of cap sid 制与有内含子的 RNA 腺苷酸化要比无内含子的腺 and fo r viral infectivit yJ . J Virol , 1990 , 64 : 2433 - 2436 . 苷酸化更有效有关 。因此 ,以上的研究结果为本研 4 Rowlands D J , San gar D V , Brown F. A co mparative chemical and 究选用带有内含子的真核表达载体 p TA R GE T 提 2and2mo ut h disease serological st udy of t he f ull and particles of foot virusJ . J Gen Virol , 1975 , 26 : 227 - 238 . 供了研究前提 。而本研究中 ,用带有内含子的表达 5 Francis M J , Fr y C M , Rowlands D J , et al . Immunological p rim2 质粒 p TA R GE T 转染 B H K221 细胞后蛋白表达量比 ing wit h synt hetic peptides of foot2and2mo ut h disease virus J . J 没有内含子的表达质粒高 2 倍左右 ,这为内含子促 Gen Virol ,1985 , 66 :2347 - 2354 . 进其下游目的蛋白的表达提供了进一步证实 。 ) ( 6 杜念 兴. 兽 医 免 疫 学 M . 第 二 版. 上 海 : 上 海 科 技 出 版 社 , 对于口蹄疫病毒组装的具体细节还不是太清 1989 . 208 - 209 . ) ( 杨汉春. 动物免疫学 M . 第二版. 北京 : 中国农业大学出版 7 楚 ,但在病毒感染的细胞中可获得几种中间体 ,其中 社 ,1996 . 305 - 306 . 包括包含有 V P0 、V P1 、V P3 各一个拷贝的 5 S 原体 , 8 Xie Q C , McCaho n D , Crowt her J R , et al . Neut ralizatio n of foot 2 包含 5 个拷贝 5 S 原体的 12 S 五聚体 ,包含 12 个拷 and2mo ut h disease virus can be mediated t hro ugh any of at least 贝 12 S 五聚体的 70 S 空衣壳 。由于这些衣壳的组装 t hree separate antigenic sites J . J Gen Virol , 1987 , 68 : 1637 - 17 取决于衣壳前体的十四烷基化以及 3C 蛋白酶的 1647 . 9 Barnet t P V , Ouldrid ge E J , Rowlands D J . Neut ralizing epitopes of 裂解活性 ,因此本研究构建的真核表达质粒均包含 t ype O foot2and2mo ut h disease virus :1 Identificatio n and charateri2 有 FMDV China99 的 P122A 、3C 基 因 。通 过 夹 心 zatio n of t hree f unctio nally independent co nfo r matio nal sites J . J EL ISA 和荧光染色证实 , FMDV 目的蛋白在细胞内 Gen Virol , 1989 , 70 :1483 - 1491 . 表达 ,但无法说明这些表达的蛋白能否正确组装成 10 Kit so n J D A , Mccaho n D , Belsham G J , Se quence analysis of 空衣壳 。为了证实这一点 ,本研究利用电子显微镜 mo noclo nal antibo dy resistant mutant s of t ype O foot2and2mo ut h disease virus :evidence fo r t he involvement of t he t hree surface ex2 观察质粒转染细胞中病毒衣壳的存在情况 。结果证 po sed cap sid p roteins in fo ur antigenic sites J . Virolo gy , 1990 , 明 ,本研究构建的真核表达质粒携带的目的基因不 179 :26 - 34 . 仅能够在细胞中表达 ,而且能够正确组装成病毒空 11 Chen g L , Ziegelhoffer P R , Yang N S. I n v i vo p ro moter activit y 衣壳 ,这一结果为随后的重组质粒体内免疫研究提 and t ransgene exp ressio n in mammalian so matic tissues evaluated by 供了有力的实验依据 。 using particle bo mbardment J . Proc Natl Acad Sci U SA ,1993 ,90 : ( ) 连接 于 真 核 表 达 质 粒 载 体 pcDNA3 . 1 + 、4455 - 4459 . TMp TA R GE T上的目的基因能够在体外细胞中正确 12 Bo hm W , Kuhro ber A , Paier T , et al . DNA vecto r co nst ruct s t hat 表达 ,这不仅说明成功构建了真核表达质粒 ,而且提 p rime hepatitis B surface antigen2specific cytoto xic T lymp hocyte 示带有 FMDV 抗原蛋白基因的真核表达质粒也可 respo nses in mice af ter int ramuscular injectio n J . J Immunol 能在动物体内表达目的蛋白 ,从而可能刺激机体产 Met ho d ,1996 ,193 :29 - 40 . 生特异的免疫反应 ,这一部分工作将在今后继续进 13 Gro ss M K , Kainz M S , Merrill G F. Int ro ns are inco nse quential 行 。本研究结果为口蹄疫基因免疫的基础研究提供 to efficient fo r matio n of cellular t hymidine kinase mRNA in mo use L cellsJ . Mol Cell Biol ,1987 , 7 :4576 . 了实验数据 ,为研制口蹄疫基因疫苗奠定了实验基 14 Buchman A R , Ber g P. Co mpariso n of int ro n2dependent and in2 础 。 t ron 2independent gene exp ressio n J . Mol Cell Biol , 1988 , 8 : ( 致谢 :本研究承蒙兰州医学院程杰老师在电镜实验中的协助 ,4395 . )在此对他表示衷心的感谢 。 15 Evans M J , Scar p ulla R C. Int ro ns in t he 3′2unt ranslated regio n can inhibit chimeric CA T and beta2galacto sidase gene exp ressio n J . Gene , 1989 , 84 :135 . 参考文献 : 16 Huan g M T F , Go r man C M . Intervening sequences increase effi2 1 Ward G , Rieder E , Maso n P W. Plasmid DNA enco ding replicat2 ciency of RNA 3′p rocessing and accumulatio n of cytoplasmic RNA ing foot2and2mo ut h disease virus geno mes induces antiviral immune J . Nucleic Acids Res , 1990 , 18 :937 - 947 . respo nses in swine J . J Virol ,1997 , 71 :7442 - 7447 . 17 Ansardi D C , Po rter D C , Mo rrow C D. M yrist ylatio n of po2 2 Abrams C C , Kin g A M Q , Belsham G J 1 Assembly of foot2and2 liovirus cap sid p recurso r P1 is required fo r assembly of subviral par2 mo ut h disease virus empt y cap sids synt hesized by a vaccinia virus ticlesJ . J Virol ,1992 , 66 :4556 - 4563 . Expression of Foot2an d Mouth Disea se Virus Proteins i n vi t r o with Eukaryot ic Expression Pla smid 1 1 1 2 GU O Hui2chen, L IU Zai2xin, SU N Shi2qi, L EN G Qing2wen, 1 1L IU Xiang2tao, XI E Qing2ge ( 11 L a nz hou V eteri na ry Resea rch I nst i t ute , CA A S , L a nz hou 730046 , Chi na ; )21 Col lege of A ni m al S cience a n d Tech nology , S hi hez i U ni versi t y , S hi hez i 832003 , Chi na Abstract :The geno mic f ragment P12 X3C3D t hat includes f ull lengt h P1 , 2A , 3C , 3D and a part of 2B of foot2 ( ) and2mo ut h disease virus FMDVwas o btained by PCR. Af ter being digested by rest rictio n enzymes respective2 ( ) ly , t he f ragment P12 X3C3D was clo ned into pcDNA3 . 1 + t hat had been digested by t he same enzymes and t he reco mbinant plasmid was named pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D . Meantime , P12 X3C3D was inserted into p TA R2 TM GE Texp ressio n vecto r and t he resulted reco mbinant plasmid was named p TA R GE T/ P12 X3C3D . Reco mbi2 nant plasmids were identified by rest rictio n enzyme analysis and nucleic acid sequencing. Furt her , B H K221 cells were t ransfected wit h pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D , p TA GR E T/ P12 X3C3D by using lipoid. The p roteins of foot2 and2mo ut h disease virus exp ressed in B KH221 cells were co nfir med by sandwich2EL ISA and IFA , and t he cap sid of FMDV was o bserved under elect ro n micro scope . The result s showed P12 X3C3D was clo ned into eukaryotic exp ressio n plasmid co rrectly. The reco mbinant eukaryotic exp ressio n plasmid pcDNA3 . 1/ P12 X3C3D , p TA R2 GE T/ P12 X3C3D co uld exp ress p roteins of foot2and2mo ut h disease virus in B KH221 cells , and t he exp ressed p ro2 teins by p TA R GE T/ P12 X3C3D had immunoco mpetence and co uld assembly into emp t y cap sid st ruct ures of FMDV . ( ) Key words : foot2and2mo ut h disease virus FMDV; eukaryotic exp ressio n plasmid ; B H K221 ; i n v i t ro exp res2 sio n )( T his w ork w as s u p ported by Gra nt f rom“973”M ajor S t ate B asic Resea rch Develop ment Prog ra m of Chi na N o. G1999011903 Cor respon di n g a ut hors : L I U Zai2x i n , X I E Qi n g2ge . Tel : 86 - 0931 - 83420585 ; E - m ai l : li ukey @p ublic . l z . gs . cn ; x ieqgkey @p ublic . l z . gs . cn