神经原纤维缠结及胶质纤维酸性蛋白的影响

神经原纤维缠结及胶质纤维酸性蛋白的影响 ,,，,,,, ,(),,,,, ,, ,,,,,,, ,,,(,, ,,(, ,,,, 解剖学杂志,,,,年第,,卷第,期 异丙酚预处理对拟阿尔茨海默病模型大鼠神经行为学和 神经原纤维缠结及胶质纤维酸性蛋白的影响 赵冬梅, 李清春, 刁汇玲, 黄 飞, 李 滨,陈立东, (,滨州医学院解剖学教研室，,滨州医学院生理学教研室，滨州 ,,,,,,) 摘要 目的:观察异丙酚预处理对拟阿尔茨海默病(,,)模型大鼠的神经行为学及海马损伤神经原纤维缠结(,,,’和胶质 纤维酸性蛋白(,,,,)表达的影响，分析异丙酚的脑保护作用。方法:大鼠海马,,,区微量注射冈田酸(,,)，建立拟,, 大鼠模型。异丙酚预处理组大鼠于拟,,模型制作前,, ,,,，腹腔注射异丙酚,,, ,,,,,,。并以,,,,,,水迷宫实验观察大 鼠行为学变化，,,,,,;,,,,,,染色观察,,,及免疫组织化学方法观察,,,,表达的变化。结果:与对照组大鼠相比，模型组 大鼠学习记忆能力显著降低;,,,,,;,,,,,,染色观察海马,,,区域出现大量,,,的特征性病理变化，,,,,免疫组织化学阳 性细胞明显增多。与模型组大鼠相比，异丙酚预处理组大鼠学习记忆能力明显提高;海马,,,区,,,明显减少或消失， ,,,,免疫组织化学阳性细胞明显减少。结论:拟,,模型建立前,, ,,,异丙酚预处理能改善拟,,模型大鼠学习记忆能 力，降低,,,和,,,,的表达，有明显的脑保护作用。 关键词阿尔茨海默病;异丙酚;学习;记忆;神经原纤维缠结;胶质纤维酸性蛋白 ,,,,;,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,，,, ,,,,;,,,,，,,,, ,,,,,,,,，,,,,, ,,,,，,, ,,,,，,,,, ,,,,,,, (, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,，, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,，,,,,,,,，,,,,,,，,矗,,,) ,,,,,,;, 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评分，评价异丙酚的脑保护作用。因而具有一定的清除自由基和抑制脂质过氧化作 ,材料和方法用〔,〕，一些在体动物实验表明异丙酚具有脑保护效 ,(,动物及分组作者,,,,,,:,,,,,,,,,,(;,, ,,,月龄健康雄性,,大鼠,,只，体质量,,,收稿日期:,,,,—,,—,,;修回日期:,,,,—,,—, , ?,,——,,,—,,—— 万 方数据,,, ,，均购自山东大学实验动物中心，动物合格证号分 标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后行大鼠海马冠状别为,,,,,,,,，,,,,(鲁),,,,,,,,。随机分为正常对 位切片，片厚,脚。同时观察每只大鼠标本海马注射轨照组、拟,,模型组、异丙酚预处理组，每组,,只，自然 迹，注射深度或位置未达要求者不纳入统计处理。条件下饲养，自由饮食，光线湿度适中。 ,(, ,,,,,;,,,,,,染色,(,实验试剂和仪器 切片脱蜡至水化，用,,硝酸银水溶液避光浸染于 一,,粉剂(,,,,,公司)，临用前溶解于,,,二甲亚 ,,?水浴箱内孵育,, ,,,;,,,福尔马林液还原数秒砜(,,,,)，配制成,(, ,,,,,,溶液;,,,试剂盒购 钟至切片呈现黄色为止;用氨银溶液滴染,,,,, ,，倾自北京中杉金桥生物技术有限公司;抗,,,,多克隆 去染液，直接用,,,福尔马林液再次还原,,, ,,,,，使抗体(兔抗人多克隆抗体)购自上海基因公司，二抗为 切片呈棕黄色;用,(,,氯化金溶液调色,,, ,,,;,,羊抗兔通用型，,,抗体(,,,段)一,,,多聚体(,,, 硫代硫酸钠水溶液固定,,, ,,,;然后脱水、透明，中,,,,免疫组织化学检测试剂盒)购自北京中杉金桥生 性塑胶封固。物技术有限公司;异丙酚(,,,, ,,,,,,,,，英国阿斯利康 ,(,免疫组织化学两步法(,,法)制药公司，批号,,,,,，进口编号,,,,,,,,,);研究用 切片常规脱蜡至水;滴加,,,。,:阻断内源性过生物显微镜带摄像装置及图像分析系统为德国,,,;, 氧化物酶;热修复抗原:将切片浸入,(,, ,,,,,枸橼公司产品;全自动,,,,,,水迷宫，上海吉量软件科技有 酸盐缓冲液(,,,，,,,(,)中，微波炉“高火”加热至沸限公司;脑立体定位仪,,,,，，中国天津生产。 腾, ,,,,，后改为“保温”,, ,,,。冷却后磷酸盐缓冲液,, ,拟,,模型制作及异丙酚腹腔注射 (,,,，,, ,(,,,(,)洗涤,次;滴加适当稀释的一抗 模型组、异丙酚组大鼠称重，选择右侧海马为注射 (,:,,,，兔，,,)，,,?恒温水浴箱孵育,, ,,,，,,,靶区，,,,水合氯醛腹腔麻醉(,,, ,,,,,)后，固定于 洗涤, ,,,,,次;滴加通用型，,,抗体(,,,段),,,,脑立体定位仪上，颅顶皮肤常规消毒，剪去头皮，充分 多聚体，,,?恒温水浴箱孵育,, ,,,,，,,,洗涤, ,,,,显露颅骨，参照,,,,,,等〔,〕的《大鼠脑立体定位图 ×,次;,,,溶液显色:使用,,,显色试剂盒，取, ,,谱》，于前囟后(,),(, ，,,,，中线右侧(,)旁开,(, ,,,,’, 蒸馏水，加试剂盒中,、,、,试剂各,滴，混匀后加至切处用直径, ,,的颅骨钻钻一小孔，垂直插入自行设计 片;室温显色，镜下控制反应时间，一般,,,, ,,,;蒸的十字形管，牙科水泥固定。通过十字形管用微量注 馏水洗涤;苏木精轻度复染;脱水，透明，封片。射器进行海马,,,区微量注射(深度,(, ,,,)，模型 ,(,显微镜观察组、异丙酚组大鼠均经纵管缓慢注射,(, ,,,,,,的 采用,,,;,摄像显微镜观察并照像。,,,,免疫,, ,(,“,，, ,,,,注射完毕，留针,, ,,,,。每隔, ,按 组织化学阳性细胞在光镜下可见胞质和突起呈棕黄色同样方法剂量注射,次，共,次。对照组用同样方法注 或棕色。计数每张切片,个随机高倍视野中阳性细胞入等体积的对照液,,,,,,,。术后大鼠肌注青霉素 数后取平均值作为计数结果，随机,,张切片 计数结果,,万单位预防感染，连续, ,。 取平均值作为最后结果。 异丙酚预处理组大鼠于拟,,模型制作前,, ,,,,， ,(,统计学处理腹腔注射异丙酚,,, ,,,,,，对照组、拟,,模型组用 应用,,,,,,(,统计分析软件包，数据以互?,表同样方法腹腔注射含,,,,,,的生理盐水。 示，先进行单因素方差分析，多组之间差异两两比较采,(,大鼠行为学检测 用,,,检验。 大鼠行,,,,,,水迷宫定向航行实验(,,,;, ,,,,,,— ,结果,,,, ,,,,)和空间探索实验(,,,,,,, ,,,,, ,,,,)，,,,,,,水迷宫由周围水池和自动录像、记录系统两部分组成。 ,(,大鼠行为学检测,,,,,,水迷宫水池直径,,, ;,，深,, ;,，摄像镜头安 各组大鼠在,,,,,,水迷宫中定向航行实验结果放于水池中心上方, ，,高度。将各象限水池壁中点标 (表,)。对照组及异丙酚预处理组的平均逃避潜伏期为入水点，标记,个象限。站台直径,, ,,，高,, ;,， 均渐缩短，从第,日开始，模型组与对照组比较，平均固定于第,象限，水池中水面高出站台平面, ;,。具 逃避潜伏期均明显延长(,,,(,,);异丙酚预处理组体行为学检测方法参考文献〔,〕。 与模型组比较，平均逃避潜伏期明显缩短(,,,(,,)。,(,灌注取材 撤去站台后，以在原站台象限(第,象限)的活动时间 水迷宫试验结束后，将各组大鼠经,,,水合氯醛 和穿越站台次数为指标，模型组与对照组比较，第,象(,,, ,,,,,，腹腔注射)深麻后，开胸暴露心，左心室插入 限活动时间明显缩短(,,,(,,)，穿越站台次数明显灌注针头，快速灌人生理盐水,,, ,,，然后改用,,,中 减少(,,,(,,);异丙酚预处理组与模型组比较，第,性缓冲甲醛(,?),,, ,,灌注，断头取脑，置,,,中性缓 象限活动时间明显延长(,,,(,,)，穿越站台次数明冲甲醛中浸泡固定, ,。取海马注射点前后约, ,,,，,厚 显增多(,,,(,,)(表,)。在第,日撤去平台之后， (,——,,,((—— 万 方数据各组大鼠空间搜索过程的典型游泳轨迹(图,)，对照 泳为主，有少量绕平台游泳。结果表明，与对照组相比组、异丙酚预处理组大鼠以绕平台游泳和穿梭游泳方 较，模型组大鼠行为模式发生了改变，异丙酚预处理组式为主，有少量环池游泳;模型组以穿梭游泳和环池游 的行为模式更接近于对照组。 图,大鼠游泳轨迹圈 ,,, , ,,,,,,,, ,,,;, ,, ,,,, ,:,,,,,, ;,,,,,,;,:,,,,, ;,,,,,,;,:,,,,,,,, 表,各实验组大鼠定向航行实验中每日平均逃避潜伏期(,?剑保埃浚螅?,,, , ,,,,,,, ,,;,,, ,,,,,;, ,, ,,,;, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,, ,, ,,;, ,,,,,(,,,,,，覃士,) ，,,,(,,, ,,,,,, ;,,,,,,,?,,,(,,协,,,,, ;,,,,,, 表,各实验组大鼠空间探索实验第,象限 胞明显增多，表现为胞体变大，突起变粗，染色深(图 活动时间和穿站台次数(,,,,，,?,，‖,) ,,)，与正常对照组相比有显著性差异(,,,(,,);异 ,,, , ,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,;,,, ？,,,,,,, ,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,, 丙酚预处理组表达减少，与模型组相比有统计学意义 ,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,, ,,;, ,,,,,(,,,,,。,士,。,,,) (,,,(,,)(表,，图,,)。 表,各 实验组大鼠海马,,，区,,,,的表达(,,,,,,,，罩士,) ,,, , ,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,, ,嗽,,, ,,,,,,,, ,嘲,, ,,,,,;,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,;, ,,,,,(,,,,,,,(,,，,,) 。,,,(,,, ,,,,,, ;,,,,,,;,,,,(,,,,,,,， ;,,,,,,,(, 海马,,,区,,,表达 ’,,,(,,, ,,,,,, ;,,,,,,;?,,,(,, ,,,,,,,,;,,,,,, 对照组大鼠海马,,,区神经细胞未见明显改变(图,,);拟,,模型组大鼠海马,,,区锥体细胞层细 ,讨论胞神经原纤维增粗、粗细不等、排列紊乱，有的密集成团块状，呈编织状遍布细胞质并深入到细胞突起，形成 本研究模型组大鼠在注射,,结束后的水迷宫行,,,(图,,)。,,,神经元计数(个,视野):模型组 为学实验从第,日起就出现学习记忆能力下降现象。(,,(,?,(,,)与对照组(,(,,?,(,,)比较，,,,明显 模型组海马,,,区,,,,免疫阳性星形胶质细胞显增多(,,,(,,);异丙酚预处理组(,(,,?,(,,)同模 著增多，银染结果显示模型组海马,,,区出现较多的型组比较，,,,明显减少(,,,，,,)(图,,)。 ,,,，这与,,病的主要病理变化相吻合。,(,海马,,,区,,,,的表达 星形胶质细胞是脑内数量最多的胶质细胞，有许 正常对照组大鼠海马,,,区星形胶质细胞表达 多突起从中央核区呈放射状伸出，在细胞的胞体和突,,,,较少，表现为细胞胞体小，突起细，染色淡(图 起内充满了,,,,构成的中间丝蛋白。中枢神经系统,,);模型组大鼠海马,,,区,,,,阳性星形胶质细 的各种类型损伤如外伤性脑损伤、细菌引起的脑炎等均 一,,】一 万 方数据 图,大鼠海马,,，区,,,表达，,,,,,;,,,,,,染色，,,,, ?, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,, ,,,,,;,,叫,,， ,,,, ,, ,,,，,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,，,,,, ,:,, ,,, ,, ;,,,,,, ,,,,, ,,,, ,:,,,, ,,,,(十),, ,,,,, ,,,,, ,,,,;,:,,, ,,;,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,, 图,大鼠海马,,,区,,,,表达(,,，,,,,) ?, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,,;,,，,,， ,,, ,,,,,, ,, ,,,(,,，,,,,) ,:,,,, ,,,, ,, ;,,,,,, ,,,,, ,,,,,,:,,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,,,;,:,,,, ,,;,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,可引起星形胶质细胞的反应〔,,引，表现为细胞的增生和 成分,,,,的高强度表达，是构成胶质疤痕的主要成肥大，以,,,,的增高为其特征性标志，而且目前已被 分。我们通过改进的,,,,,;,,,,,,染色显示，,,可公认为是脑损伤的早期指标〔, ,,。最近的研究结果表 导致大鼠海马和皮质神经元内产生大量的,,,。异丙明，,,,,的,,种可溶亚型大部分都在,,脑和老龄 酚预处理组海马内,,,数量减少，与拟,,模型组比脑中表达〔,,，。本研究的,,,,免疫组织化学显示海 较差异显著(,,,(,,)。,,,是导致神经元纤维退化马,, ,区出现了大量胞体肿胀和突起?执笈ㄈ镜男?.