白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与其毒力的关系

白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与其毒力的关系 白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷 脂酶活性与其毒力的关系 第33卷第3期 2007年5月 吉林大学(医学版) JournalofJilinUniversity(MedicineEdition) Vo1.33NO.3 May2007483 [文章编号]1671—587X(2007)03—0483—05 白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外 磷脂酶活性与其毒力的关系 曹岩,张巨,沙春蕊.,郑永晨,刘永红 (1.吉林大学第二医院中心实验室,吉林长春130041;2.吉林大学中日联谊医院手外科,吉林长春130033; 3.吉林大学第---N院麻醉科,吉林长春130041;4.吉林省肿瘤医院电诊室,吉林长春130012) [摘要]目的:探讨临床白色念珠菌感染者不同标本中分离的白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶 活性与其毒力的关系.方法:分别采用牛奶平板和卵黄培养基法检测白色念珠菌感染者不同标本(痰,血液,鹅 口疮,伤口,阴道分泌物)中分离的190株白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶的活力,分别将产酶 株的菌丝相和孢子相菌悬液(5×10.CFU?mL)注射小鼠尾静脉,1个月内观察小鼠死亡率及平均存活时间, 以平均存活时间评价菌株毒力.结果:190株白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶阳性检出率分别为 83.68%和85.26%.动物实验结果明,菌丝相白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细 胞外磷脂酶的活力均显着高 于孢子相(P<O.01,P<O.05);注射菌丝相白色念珠菌的小鼠死亡率高于注射孢 子相的小鼠(P<O.05),且 平均存活期短于注射孢子相的小鼠(P<O.01).结论:分泌型酸性蛋白酶和细胞外 磷脂酶是白色念珠菌重要毒 力因子,酶活力可直接地反映其毒力和致病性. [关键词]念珠菌,白色;分泌型酸性蛋白酶;细胞外磷脂酶;毒力 [中图分类号]R379.4[文献标识码]A Relationshipbetweenactivityandvirulenceofsecretoryacidproteinase andextracellularphosphlipaseofCandidaalbicans CAOYan,ZHANGJu,SHAChun-rui.,ZHENGYong—chen,LIUYong-hong (1.CentralLaboratory,SecondHospital,JilinUniversity,Changchun130041,China; 2.DepartmentofHandSurgery,China— JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China; 3.DepartmentofAnesthesiology,SecondHospital,JilinUniversity,Changchun130041,China~ 4.DepartmentofElectrodiagnosis,TumorHospitalofJilinProvince,Changchun130012,China) Abstract:ObjectiveTostudytherelationshipbetweenactivityandvirulenceofsecretoryacidproteinaseand extracellularphosphlipaseofdifferentCandidaalbicansisolatedfromvariousspecimens.Methods190strainsof Candidaalbicanswereisolatedfromvariousspecimens(sputum,blood,thrush,wound,secretionofvaginitis)of patientswithCandidaalbicansinfectioninhospita1.Milk-platemediumandegg-yolkmediumwereusedrespectively totesttheactivitiesofsecretoryacidproteinaseandextracellularphosphlipaseofCandidaalbicans.Thesuspension oftwoformsofCandidaalbicans(5×10.CFU?mL 一)wereinjectedtOveinoftailinmicerespectivelyinvirulence test.Themortalityandmeansurvivaltimeofmicewereobservedin1month.Thevirulencewasappreciatedwith themeansurvivaltimeofmice.ResultsA1lof190strains,thepositivedetectableratesofsecretoryacid proteinaseandextracellularphosphlipasewere83.68and85.26%,respectively.Animalexperimentalresults showedtheactivitiesofsecretoryacidproteinaseandextracellularphospolipaseinhyphalformsweresignificantly higherthanthatinsporeform(P<O.O1,P<O.05).Themortalityofmiceinjectedwithhyphalformswashigher [收稿日期] [基金项目] [作者简介] [通讯作者] 2006-08—18 吉林省科技厅资助课题(97O565—3) 曹岩(1956一),女,吉林省长春市人,副主任技师,医学硕士,主要从事细胞培养及分 子生物学研究. 郑永晨(Tel:0431—88796577,E—mail:jlzyc@yahoo.corn.cn) 484吉林大学(医学版)第33卷第3期2007年5月 thanthatofmiceinjectedwithsporeforms(P<0.05)andthemeansurvivaltimeofmiceinjectedwithhyphal formswasshorterthanthatofmiceinjectedwithsporeforms(P<0.01).ConclusionSecretoryacidproteinase andextracellularphosphlipaseareimportantvirulencefactorsofCandidaalbicans.Theactivitiesofsecretoryacid proteinaseandextracellularphosphlipasecanbeusedasdirectparametersforvirulenceofCandidaalbicans. Keywords:Candidaalbicans;secretoryacidproteinase;extracellularphospholipase;virule nce 白色念珠菌(Candidaalbicans,CA)是临床 上重要的条件致病性真菌.它可引起皮肤,黏膜及 内脏的念珠菌病,是免疫力低下宿主感染的重要致 病真菌之一,可导致浅表或深部的白色念珠菌病. 尽管目前有许多抗真菌药物,但真菌菌血症的病死 率仍很高.特别是念珠菌菌血症的病死率高达 40.0,80.09/6.有文献报道,深部白色念珠菌感 染的病死率为68.909/6].目前认为,分泌型酸性 蛋白酶和细胞外磷脂酶是潜在的毒力因素,在白色 念珠菌引起的疾病中具有较强的致病作用].因 此,研究其酶毒力与致病性的关系一直受到国内外 学者广泛关注.随着广谱抗生素,免疫抑制剂,细 胞毒药物广泛应用于器官移植,导管植入,恶性肿 瘤,糖尿病,艾滋病(AIDS)等疾病的治疗,导 致人体免疫力低下疾病不断增多,深部真菌感染发 病率明显增加],其发病因素中白色念珠菌占比例 最高,约为53.2l4].目前有关白色念珠菌分泌 型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与毒力关系方面 的研究报道甚少.为此,本实验对白色念珠菌分泌 型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与小鼠致病的毒 力关系进行了探讨,从而对深入了解白色念珠菌的 致病性与疾病防治提供了可靠的实验依据. 1与方法 1.1菌种来源 按卫生部颁发的院内感染诊断标准],临床分 离白色念珠菌感染者不同标本中白色念珠菌(CA) 190株(CA1,190号),其中痰标本36株,血液 标本中32株,口腔黏膜感染(鹅口疮)标本中 29株,伤口感染标本中34株,阴道炎患者分泌物 标本中28株和正常带菌者标本中31株,分别接种 于沙堡弱培养基中,37.C培养48h.对培养得到 的菌落分别进行形态学观察,芽管生成,厚膜孢子 形成实验.所有念珠菌均经革兰氏染色,VITEK 微生物自动检测系统和API20CAUX酵母鉴定系 统鉴定,每一株在含氯霉素的沙堡弱葡萄糖琼脂 (Sabourand'Sdextroseagar,SDA)斜面上接种 不超过3代,以确保菌活力不改变,将确认的白色 念珠菌菌种保存于一70.C备用. 1.2主要试剂及仪器 RPMI1640培养基(Gibco公司产品);吗啡 啉丙磺酸(MOPS),蛋白胨,四甲基偶氮唑蓝 (MTT)均为(Sigma公司产品);小牛血清(北 京鼎国生物技术有限责任公司产品);胰蛋白酶 (Difco公司产品);酵母粉(Oxfoid公司产品).超 净工作台(江苏净化设备厂);比浊仪(法国酶里 埃公司);酶标仪(LabsystemsMK3芬兰);COz 培养箱(Heraeus德国);倒置显微镜(37X-BZ 上海). 1.3实验动物 清洁级昆明种小白鼠40只,雌雄各半,体重 18,20g,由本校实验动物中心提供. 1.4培养基制备 产酶培养基(100mL):葡萄糖2.0g,酵母 粉0.5g,KHzPO0.5g,蛋白胨2.0g(pH 4.5);YGM-牛奶培养基(100mL):葡萄糖 2.0g,酵母粉0.2g,KH2PO1.0g,琼脂2.0g (pH4.5),高压灭菌后冷却到50.C加入灭菌脱脂 奶粉(V/V为1.09/6);SDA培养基即改良沙堡葡 萄糖琼脂(100mL):葡萄糖2.0g,蛋白胨 1.0g,琼脂2.0g,高压灭菌后加氯霉素 0.05g?L_.;卵黄培养基:在SDA含1mol?I NaC1,0.005mol?I_.CaC1,经高压灭菌,待温 度下降到50?左右后,按每100mL培养基加29/6 无菌蛋黄,充分混匀,然后倒入无菌平皿;完全培 养基(RPMI1640培养基):10.4g?L(含谷氨 酰胺,不含碳酸氢钠),吗啡啉丙磺酸 34.53g?L,以1mol?L的NaOH调节pH 7.0,过滤灭菌,置4.C冰箱备用. 1.5血管内皮细胞 无菌取剖宫产胎龄7个月以上胎儿或新生儿脐 带,用注射器抽取无菌生理盐水冲洗脐静脉,再用 0.25胰蛋白酶(含0.1的EDTA)10,15mL 注入脐静脉,置于37?孵箱中15min以消化管腔 内皮细胞,终止消化后将消化液用含109/6(V/V) 小牛血清和109/6(V/V)生长因子的DME/FIZ培 曹岩,等.白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与其毒力的关系485 养液中进行原代培养,将传至2,3代的血管内皮 细胞消化后,制成细胞悬浮,调整细胞浓度为1X 1O?mL_.,按100L?孔接种于96孔培养板, 置37?,5CO.培养箱中,待细胞生长至单层后 用于实验.同时台盼蓝染色计数,活细胞数>959/6 备用. 1.6菌体的活化及菌液的制备 1.6.1菌株恢复活性用产酶培养基37.C增菌24 h,转种于沙堡弱平板37?培养24h,恢复白色 念珠菌的产酶等生物学活性,保存于4.C冰箱备 用. 1.6.2菌液的制备从沙堡弱试管斜面培养基上 分别取白色念珠菌一接种环,转种于预热(35?) 的沙堡弱培养液中,放于37.C恒温振荡培养箱, 转速为140r?min_.,振荡培养48h,形成孢子 相;将该菌转种于预热(35.C)的RPMI1640培 养基(pH7.5,含1O小牛血清)中,放于恒温 培养箱,37.C连续静置培养7d,共转种1O次,每 次转种前将培养混悬液摇匀后静置10min,取上层 液体转种于新鲜培养液中继续培养,形成菌丝相. 将孢子相和菌丝相分别接种于10mLSDA培养液 中,放37?恒温振荡培养箱中,转速为 140r?min,振荡培养72h.分别以 10000r?rain离心2rain,用生理盐水洗涤 3次,制成混悬液,再用血球计数板计数,调整至 所需浓度菌液供实验用(菌液浓度为5X 10CFU?mL一). 1.6.3检测指标?白色念珠菌细胞毒力测定L4]: 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验将传代血 管内皮细胞用胰蛋白酶消化,制成1X10?mL 的细胞悬液,将分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶 活力高(CA92和CA3),中(CA118和CA56), 低(CA45和CA172))的6株白色念珠菌分别配 成5X10CFU?mL的菌悬液.将细胞悬液和菌 悬液各加100L?孔于96孔培养板进行平行测 定,使血管内皮细胞数与白色念珠菌数之比为1: 50;同时做血管内皮细胞及白色念珠菌对照.各设 3复孔,置37.C,5CO.培养箱中培养24h后, 每孔加入MTT(5.0g?L)20L,继续培养 4h终止培养.再每孔加入200"L酸化异丙醇, 轻轻混匀,5rain后酶标仪于492nm处测定吸光 度(A)值,即细胞毒力一(1一实验组A../g~照 组A..)×100.取3复孔平均值绘制生长曲线, 观察分析白色念株菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷 脂酶与细胞毒力之间的关系.?白色念珠菌分泌型 酸性蛋白酶活力的测定L5]:将试验菌株点种于含 YGM一牛奶培养基平板上,每份标本滴2个点,同 时做分泌型酸性蛋白酶活力阳性和阴性对照,37.C 培养72h,经氨基黑染色后洗涤,分泌型酸性蛋 白酶阳性菌株的菌落周围会产生一透明圈,用游标 卡尺分别测量菌落及周围透明环的直径.以PA值 表示分泌型酸性蛋白酶活力,PA=菌落直径/总直 径(菌落直径+透明圈).PA值愈低,菌株分泌 型酸性蛋白酶活力愈强,当PA一1.0时,说明分 泌型酸性蛋白酶活力阴性.?白色念珠菌细胞外 磷脂酶活力的测定:取已配好的白色念珠菌悬液 2O"L,滴于卵黄培养基平皿表面,每株菌测定 2份,同时做磷脂酶活力阳性和阴性菌株对照,以 避免不同批号试剂对结果的影响,37?培养72h. 磷脂酶阳性菌珠的菌落周围会产生一透明圈,测量 菌落直径及透明圈直径.以磷脂酶沉淀圈直径PZ 表示磷脂酶活力,PZ=菌落直径/总直径(菌落+ 沉淀圈).PZ值愈低,菌株磷脂酶活力愈强, PZ>0.95,可认为磷脂酶活力阴性.?白色念珠菌 小鼠毒力实验:取小鼠4O只,随机分为实验组与 对照组,每组2O只,从1.6.2中取相应的菌悬液 (孢子相和菌丝相),经4000r?rain离心 10rain,弃上清,用无菌生理盐水洗涤3次,再用 生理盐水稀释成5X10CFU?mL菌悬液,实验 组小鼠经尾静脉注射此菌悬液200L,对照组小鼠单 纯注射无菌生理盐水200"L,观察30d内小鼠死亡数 及存活天数,计算小鼠死亡率及平均存活期,以小鼠 平均生存天数及小鼠死亡曲线评价菌株的毒力. 1.7统计学处理 应用SPSS10.0统计分析软件包进行统计学 分析,结果用均数?标准差(z土s)表示,分泌型 酸性蛋白酶及细胞外磷脂酶阳性检出率的比较均采 用y.检验. 2结果 2.1白色念珠菌感染者不同标本中190株白色念 珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活力测定 白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶 阳性率分别为83.68和85.26.其中痰,血 液,鹅口疮,伤口和阴道炎分泌物标本中菌株分泌 型酸性蛋白酶阳性检出率分别为100,93.75, 82.769/6,83.35和82.14,均高于正常带菌者 (58.06),与正常带菌者比较差异均有显着性 486吉林大学(医学版)第33卷第3期2007年5月 (P<O.01);此外,痰,血液,鹅口疮,伤口和阴 道炎分泌物标本中菌株细胞外磷脂酶阳性检出率分 别是91.67,9O.62,86.21,79.41和 96.43%,也均高于正常带菌者(67.74%),与正常带 菌者比较差异均有显着性(P<O.01),见表1. Tab.1Theactivitiesofsecretoryacidproteinase(PA)andextracellarphosphlipase(PZ)from 190strainsofCandida albicansfromdifferentspecimensofthepatientsinfactedinthehospital(?5) P<O.Olcomparedwithcarriers 2.2白色念珠茵细胞毒力测定结果 将白色念珠菌分泌酶活力按高,中,低随机选 择6株,实验结果可见白色念珠菌的酶活力愈高, 吸光度(A)值也愈大PA值和PZ值愈低,毒 性愈高,致病性愈强,见表2. Tab.2ResultofthevirulenceofCandidaalbicans (一3,z?5,/) P<O.O1comparedwithCA45andCA172 2.3白色念珠茵分泌型酸性蛋白酶与细胞外磷脂 酶的活力测定及小鼠毒力实验 菌丝相白色念珠菌分泌型酸性蛋白 酶(0.562?0.034)及细胞外磷脂酶(0.817? 0.068)的活力均高于孢子相(0.465?0.052, 0.652--4-0.05)(P<0.01或P<0.05)注射菌丝 相白色念珠菌的小鼠死亡率(60)显着高于注射 孢子相的小鼠(25)(P<O.05),且注射菌丝相 白色念珠菌的小鼠平均存活期[(11.55? 1.024)d3显着低于注射孢子相的小鼠[(17.30-1- 0.741)d3(P<0.01).结果表明,因酶作用形成 的透明圈直径大的菌株,分泌酶的活力就愈高,对小 鼠的毒力就愈强. 3讨论 近年来,由于临床对癌症,器官移植患者大量 使用化疗药物,广谱抗生素和免疫抑制剂以及 AIDS的流行,使深部真菌感染的发病率在免疫低 下患者群体中急剧升高.深部真菌感染已日益成为 一 种常见病,多发病,并逐渐成为患者死亡的主要 原因之一.深部真菌感染中最常见的菌属为念珠菌 属(Candidaspecies),其中以CA为最常见菌种, 该菌广泛寄居于人体的皮肤,呼吸道及泌尿生殖道 表面.在正常情况下,与人体皮肤黏膜表面的其他 正常菌群相互抑制,相互制约,可不致病.但在人 体免疫力下降或菌群失调时,白色念珠菌可在局部 大量繁殖,引起皮肤黏膜感染,甚至引起全身播散 性白色念珠菌病,严重威胁着患者的生命安全.到 目前为止,白色念珠菌感染致病的确切因素还不十 分明确.临床上在抗白色念珠菌治疗中也缺乏足够 的理论依据,有时即使暂时控制了感染,也很容易 复发.针对上述情况,本室开展了有关白色念珠菌 细胞毒力的实验研究.该研究采用血管内皮细胞作 为实验对象,以活细胞还原MTT的能力(吸光度 A值)来判断白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞 外磷脂酶活力与毒力的关系.本实验检测痰,血 液,鹅口疮,伤口和阴道炎分泌物标本中白色念珠 菌的分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶的阳性率均 曹岩,等.白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与其毒力的关系487 明显高于正常带菌者.为了进一步探讨两酶活力与 毒力关系,本研究依据分泌酶活力高,中,低随机 各选择2株菌株进行了小鼠毒力试验,证明了分泌 酶活力愈高,毒力愈大,致病性愈强.本实验结 果:白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶 活力值愈小其细胞毒力值愈大;且菌丝相和孢子相 白色念珠菌比较差异有显着性(P<0.01),与文献 报道的小鼠毒力实验结果一致].表明白色念珠菌 分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活力与上皮细胞 损伤有关.因为分离自血液,鹅口疮及念珠菌性阴 道炎的菌株大多数应考虑具有致病性,故其阳性株 PA值明显低于正常带菌者].由此可见,这两种 酶在白色念珠菌的细胞毒性中起着关键性的作用. 白色念珠菌能产生多种毒力因子,其中分泌型酸性 蛋白酶和细胞外磷脂酶是两种重要的毒力因子.其 致病性还包括CAP,黏附性,芽管生成,疏水性 等,亦有文献报道白色念珠菌有荚膜].菌体表面 的疏水性使疏水性白色念珠菌较亲水性白色念株菌 产生芽管的速度快,其黏附组织,塑料,导管和人 工瓣膜的能力强].目前认为,白色念珠菌的侵袭 性与其产生的分泌型酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶活 力有关,含此酶的菌株可分解白蛋白,免疫球蛋白 及皮肤蛋白,缺乏此酶的菌株对小鼠的侵袭力明显 降低,外阴阴道念珠菌病患者细胞外磷脂酶的检出 率及酶活力均高于正常携带者].本实验还发现, 菌丝相白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶与细胞外磷脂 酶的活力均强于孢子相;且小鼠毒力实验中发现, 注射菌丝相白色念珠菌的小鼠死亡率高于注射孢子 相的小鼠,平均存活期低于注射孢子相的小鼠.此 结果表明,菌丝相白色念珠菌的毒力强于孢子相. 实验进一步证明了白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和 细胞外磷脂酶在白色念珠菌致病过程中所起的重要 作用.目前认为,白色念珠菌的侵袭性与菌珠的磷 脂酶活力有关.还有研究报道l8在临床标本中分离 得到的白色念珠菌感染小鼠的实验中发现,白色念 珠菌细胞外磷脂酶的活力与菌珠的毒力有显着性差 异(P<0.01).细胞外磷脂酶是近年来倍受人注 目的破坏宿主细胞的毒力因子l9],同时细胞外磷脂 酶活力高的菌株能侵犯胃黏膜,并经此人血,而细 胞外磷脂酶活力低的菌株无侵犯性.磷脂酶作为磷 脂分解代谢过程中的重要酶类,也是炎症反应的重 要介质.白色念珠菌广泛地存在于人体口腔,上呼 吸道,肠道及阴道黏膜等部位,单纯培养阳性并不 代表其有致病性,这给临床早期诊断系统性念珠菌 病带来一定困难.从本实验结果看,当存在引起条 件性真菌感染危险性时,体内新鲜分离的白色念珠 菌的分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活力代表了 菌珠的侵袭性.因此,实验室测定这两种酶有助于 预测菌珠毒力,具有早期预测念珠菌感染的意义. 对临床标本中白色念珠菌致病因子的分析结果表 明,临床标本中真菌分离的重要性,因此在临床标 本中分离到真菌(尤其是白色念珠菌)应该引起高 度重视.有文献报道[7测定白色念珠菌临床分离株 的细胞外磷脂酶活力时发现,细胞外磷脂酶活力与 白色念珠菌的致病性明显相关,细胞外磷脂酶活力 高的菌株对小鼠具有致病性.本实验研究表明,细 胞外磷脂酶活力,芽管生成,厚膜孢子形成等多种 毒力因子与小鼠死亡率的相关性中比较,细胞外磷 脂酶活力与小鼠死亡率具有更明显的相关性.由此 可见,白色念珠菌细胞外磷脂酶是白色念珠菌的重 要毒力因子.该研究为系统性诊治白色念珠菌病提 供了可靠的靶酶,并为开发白色念珠菌分泌型酸性 蛋白酶和细胞外磷脂酶特异性抗体的早期诊断提供 了理论基础,也为疫苗的研制和抑制白色念珠菌分 泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶产生和释放的药物 的生产提供了可靠的实验依据. 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