高效液相色谱法测定尿液中儿茶酚胺类物质

高效液相色谱法测定尿液中儿茶酚胺类物质 高效液相色谱法测定尿液中儿茶酚胺类物 质 ,,0 ~, 】 21 2 g 】 g2 NO 期 2J()URNAIFA—NAI瑟Lsc…IE.iNcEVo1. 21.J【)L【JFLYllA乙乙匕 2005年4月 Apr.2005 文章编号:1006—6144(2005)02—0219-02 高效液相色谱法测定尿液中儿茶酚胺类物质 乔坤云,高继玲 (1.新疆农科院分析测试中心,乌鲁木齐830000;2.新疆医学院第二附属医院) 摘要:本文报道用高效液相色谱法(HPLC)分离,荧光器检测儿茶酚胺含量的新 方法.该法可同时分离测定去甲肾上腺素(NE),肾上腺素(E)和多巴胺(DA)三种组 分,三种组分的浓度与其峰面积均呈良好的线性关系.方法灵敏度高,选择性好,测定 结果令人满意,可在临床推广应用. 关键词:儿茶酚胺;尿液;高效液相色谱法 中图分类号:o657.72文献标识码:A 去甲肾上腺素(NE),肾上腺素(E),多巴胺(DA)及多巴统称为儿茶酚胺类(CA)物质,作为神经递质 和激素与人们的健康与疾病有密切关系.较多的临床工作者越来越注重对儿茶酚胺的深人研究,而选择 可靠易行的分析方法是得出准确结果的前提.检测CA的分析方法报道很多,方法各有其特点,但因其 在灵敏度,选择性及分析速度等方面达不到样品分析要求,使其不能在临床推广应用.高效液相色谱 (HPLC)作为检测CA的重要手段之一,是目前研究最多的检测方法,能够满足痕量和超痕量CA的分 析,对临床诊断和基础研究具有重大意义. 本文采用HPLC分离,荧光检测器检测,不需衍生化,可同时分离测定NE,E和DA三种组分.方法 具有较高的灵敏度,稳定性好,前处理简单易行,回收率符合试验要求. 1实验部分 1.1仪器与试剂 美国Waters公司液相色谱仪,1525泵,2475荧光检测器,Breese软件系统. 去甲肾上腺素,肾上腺素品(中国药品生物制品检定所提供),多巴胺标准品(Sigma产品),乙酸 乙酯,硫酸,氢氧化钠等试剂均为分析纯.水为双重重蒸馏水并经0.45tLm膜过滤. 1.2色谱条件 色谱柱:PH—BDSC18(15O×4.6mmi.d.,4m);荧光检测器:激发波长:一285nm,发射波长: 一 340nm;流动相:0.02moi/L磷酸二氢钾:乙腈一98:2(V/V);流速:1.omL/min. 1.3混合标准溶液标准曲线的制作及检出限 称取一定量的标准品,用0.2mol/L乙酸溶液配制去甲'肾上腺素:0.16ug/mL,肾上腺素:0.125P.g/ mL,多巴胺:0.20ug/mL标准溶液.准确吸取一定量的上述混合标准溶液配制成一系列浓度(gg/mI) 溶液,进样量:20L. 分别以3种组分相应的浓度为横坐标(X),相对应的峰面积为纵坐标(y),得出回归方程,线性范围及 检出限见表1. 1.4样品前处理方法 取10mL尿液置于50mL烧杯中,用2mol/L硫酸调至pH一1.8并转移到分液漏斗中,加人30mI 乙酸乙酯振摇5min,静止分层,取下层尿液用3mol/L氢氧化钠调pH一8.3并立即倒人预先称好的lg 活化后的Alo.中振摇,使其充分吸附,静止分层,弃去上清液,用10mI左右的2mol/L乙酸钠溶液洗 收稿日期:2003—05—28通讯联系人:乔坤云 219 第2期乔坤云等:高效液相色谱法测定尿液中儿茶酚胺类物质第2l卷 涤,留下层,再用去离子水洗涤2次,弃去水层,加入的2mL0.2moL/L乙酸溶液,振摇使其充分解析,静 止后取上清液过0.45m膜后用于HPLC测定. Table1Linearranges.regressionequationsanddetectlimitsforNE?E?DA 1.5方法精密度和回收率试验 对同一份尿液样品重复进行5次测定,与样品同步按实验方法精确加入一定量的标准溶液,做加标回 收试验,用峰面积外标法定量.结果见表2. Table2Precisionandrecoveryofexperiments 2结果与讨论 (1)本实验方法稳定,重复性好,样品需要较少,前处理方法与其它方法相比较简单,快速,方法灵敏度 较高,能满足低含量或超微量CA.的检测,可在临床推广应用. (2)处理方法中"调碱"这一步是因为Al0.在pH一8.2,8.5条件下吸附CAs能力最强,而CAs在碱 性条件下却不稳定,两者产生矛盾,为此"调碱"过程一定要快,准,否则将会影响检测结果. (3)前处理方法中"震荡和静置"步骤较多,一定要予以足够的时间完成该步骤,否则会造成样品组分 分离不好,有可能丢失组分,降低回收率. (4)试验发现用乙酸乙酯萃取时一定要将尿液中杂质充分萃取干净,静置,分离完全,否则对肾上腺素 的分离有较大的影响. (5)从对几十份尿液检测结果来看,尿液中(无论是正常人或病人尿液)多巴胺的含量均比去甲肾上腺 素和肾上腺素含量高,尿液中去甲肾上腺素和肾上腺素及多巴胺的测定结果与文献报道基本一致. DeterminationofCatecholaminesinUrinebyHPLC QIAOKun—yun,GAOJi—ling (1.TheTestCentre,XingjiangAcademyofAgriculturalScience,Wulumuqi,Xingjiang8300 0; 2.SecondAffilatedHospitalofXingJiangMedicalUniversity) 220