_盐酸苯环壬酯及其异构体抗NMDA神经毒性保护作用的比较

_盐酸苯环壬酯及其异构体抗NMDA神经毒性保护作用的比较 _盐酸苯环壬酯及其异构体抗NMDA神经毒性保护作用的比 较 毒理学杂志2007年8月第21卷第4期 JToxicolAugust2007Vol.21 No.4?251?中图分类号:R994 文献标识码:A 文章编号:1002-3127(2007)04-0251-04?论著? 盐酸苯环壬酯及其异构体抗NMDA神经毒性 保护作用的比较 任振宇,彭双清,仲伯华,刘河,刘克良 (军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850) 【摘要】 目的 观察并比较盐酸苯环壬酯消旋体(phencynonatehydrochloride,PCH)及其不同旋光异构体———R(-)-PCH和S(+)-PCH对NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)神经毒性的保护作用。方法 通过建立NMDA小鼠致死模型及PC12细胞损伤模型,测定PCH不同旋光异构体对小鼠存活率、细胞存活率及乳酸脱氢酶 (lactatedehydrogenase,LDH)漏出的影响。结果 PCH不同旋光异构体在体内体外均能对抗NMDA的神经毒性作用。R(-)-PCH在6mg kg时发挥最大保护效应,使小鼠存活率提高到55.6%,保护效应优于S(+)-PCH;PCH消旋体的最佳保护效应与R(-)-PCH相当,但所需剂量高于R(-)-PCH。3mmol LNMDA作用24h使细胞存活率降至对照组的63.5%,LDH漏出增加到对照组的2倍,5μmol LR(-)-PCH作用使细胞存活率提高到对照组的80.5%(P<0.05,与对照组相比)并有效抑制————————————————————————————————————————————————————— NMDA所致的细胞LDH漏出;S(+)-PCH对细胞存活率无明显影响,但可 以有效抑制LDH的漏出;PCH消旋体的作用介于二者之间,也发挥出显 著性保护作用。结论 PCH不同旋光异构体均可对抗NMDA神经毒 性,R(-)-PCH的保护效应优于S(-)-PCH,是优性异构体,PCH消旋体的作用 介于2个异构体之间。 【关键词】 NMDA;神经毒性;神经保护作用;旋光异构体 Comparativeprotectiveeffectsofphencynonatehydrochloride anditsopticalisomersonNMDA-inducedneurotoxicity RENZhen-yu,PENGShuang-qing,ZHONGBo-hua,LIUHe,LIUKe-liang (InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China) 【Abstract】 Objective Tocomparetheneuroprotectiveeffectsofphencynonatehydrochloride(PCH)anditsopticalisomersonN-methy-D-aspirate(NMDA)inducedneurotoxicity.Methods AmodelofNMDA-inducedlethalityinmiceandanothermodelofNMDA-inducedtoxicityinPC12cellsweredeveloped,andtheprotectiveeffectsofPCHracemateanditsisomersweredetected.Results PCHracemateanditsisomersareeffectiveinattenuatingNMDA-inducedtoxicitybothinvivoandinvitro.Pretreatmentmicewith6mg kgR(-)-PCHpromotedthesurvivalrateupto55.6%,morepotentthan22.2%ofS—————————————————————————————————————————————————— ——— (+)-PCHpretreatmentgroupatthesamedose.5μmol LR(-)-PCHeffectivelyincreasedPC12cellviabilityandattenuatedLactatedehydrogenase(LDH)release,whileS(+)-PCHwaslesseffective.PCHracematedemonstratedamodestprotectionbetweenitstwoisomers.Conclusion PCHracemateanditsisomersallprovideprotectionagainstNMDA-inducedtoxicity,andtheprotectiveeffectsR(-)-PCHaremorepotentthanthatofS(+)-PCHbothinvivoandinvitro. 【Keywords】 N-methy-D-aspirate;Neurotoxicity;Neuroprotectiveeffects;Opticalisomer 盐酸苯环壬酯(phencynonatehydrochloride,PCH)是 我所自主研发的国家一类新药,商品名为“飞赛乐”,早 期用于晕动病的治疗。研究发现PCH可能具有抗 NMDA作用。由于分子结构中含一个手性碳原子, PCH存在2种旋光异构体———R(-)-PCH和S(+)-PCH。N-甲基-D- 天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)作为中枢兴奋性神经递质谷氨 酸的受体激动剂,参与中枢兴奋性突触传递,其介导的信号转导,构成 记忆和认知的基础,与突触可塑性,神经元生长与存活,长时程增强等 重要生理过程有关[1]。然而NMDA基金项目:国家自然基金重大课 资助项目(203900508) 作者简介:任振宇,硕士研究生,研究方向:药物安全性评价。 通讯作者:彭双清,研究员,博士生导师,研究方向:药物安全性评价。 受体在过度激活时会导致神经元的死亡,这也是急性损伤诸如癫痫 —————————————————————————————————————————————————— ——— (epilepsy),中风之后神经细胞死亡的重要原因[2]。此外,NMDA受体活性过高与许多慢性神经退行性病变,如阿尔茨海默病 (alzheimer'sdisease, ?252?毒理学杂志2007年8月第21卷第4期 JToxicolAugust2007Vol.21 No.4 AD),帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症等的发病及病程发展相关联 [3] 处理。 1.3.3 细胞存活率:吸弃培养液,换为含不同浓度NMDA的新鲜培养基。检测保护作用时,细胞先用PCH消旋体、R(-)-PCH或S(+)-PCH预处理10min,之后与损伤剂量的NMDA共同孵育24h。吸弃培养 液,加入含MTT(0.5mg ml)的无血清培养液,37?孵育4h后,小心吸弃培养液,每孔加入150ml二甲亚砜(DMSO)避光震荡15min,用酶标仪(WellscansMK3)检测其570nm处A值。细胞活力(%)=样品的吸光度值 对照组的吸光度值×100% 1.3.4 PCH不同旋光异构体对NMDA所致PC12细胞LDH漏出增加的影响:细胞给药过程同1.3.3。取培养液上清离心(2000r min,5min), 按照中生公司LDH试剂盒说明,日立7020型全自动生化仪测定,结果用U L示。 1.4 统计学方法 采用SAS软件包进行分析,动物实验结果采用Fisher精确检验进行统计;细胞实验结果用 x?s表示,采用t检验和————————————————————————————————————————————————————— ANOVA方差分析。2 结果2.1 NMDA致死模型的建立 小鼠给予不同剂量NMDA(0、150、155、160和170mg kg,ip)后5min左右,小鼠出现过度激惹、前抓样运动、翘尾及惊厥发作等中毒症状;之后数分钟不等,动物因惊厥发作导致全身抽搐及呼吸抑制而死亡,且死亡率随着中毒剂量的增高而相应增加,由此确定NMDA的最小致死剂量为155mg kg。2.2 PCH不同旋光异构体对小鼠存活率的影响 PCH消旋体及不同旋光异构体对NMDA的致死效应有对抗作用,在一定范围内呈剂量依赖的提高小鼠对NMDA的耐受性。结果如表1所示,PCH不同旋光异构体均能在一定程度上提高小鼠对NMDA的耐受性。6mg kgR(-)-PCH预处理使小鼠存活率提高到55.6%(与对照组比较,P<0.05,),远高于同剂量S(+)-PCH预处理组的22.2%。PCH消旋体在12mg kg时显示出最大保护作用(55.6%)。由表1看出,PCH消旋体需要更高的剂量才能发挥与R(-)-PCH同等的保护作用。而且随着剂量的增加,PCH不同旋光异构体的抗NMDA致死效应均有下降趋势。 2.3 PCH不同旋光异构体对NMDA所致PC12细胞存活率下降的影响 如图1所示,NMDA呈剂量依赖地降低细胞存活率,10mmol LNMDA作用24h,细胞存3作为 。迄今 尚无研究对R(-)-PCH、S(+)-PCH、PCH消旋体的抗NMDA神经毒性保护作用进行比较研究。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜镉细胞瘤细胞,在神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)作用下细胞表达功能性的NMDA受 ————————————————————————————————————————————————————— 体,分化为神经性的PC12细胞。分化的神经性PC12细胞株现已广泛用于细胞膜信号传导与细胞内信使、兴奋性神经毒性和神经保护机制的研究 [4] 。本研究建 立NMDA神经损伤模型,观察并比较PCH不同旋光异构体的神经保护作用,旨在找到保护效应强的优性异构体,为其进一步的合理开发利用提供研究参考,进而为NMDA相关疾病的治疗提供新的药物选择。1 与方法1.1 主要试剂和设备 PCH消旋体、R(-)-PCH和S(+)-PCH由军事医学科学院毒物药物所合成,纯度>98%。NMDA、NGF、多聚赖氨酸(MW>300000)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购于美国Sigma公司。达尔伯克(氏)改良伊格尔 (dulbecco'smodifiedeagle'smedium,DMEM)培养基、马血清、胎牛血清购于美国Gibco公司等。 1.2 动物 昆明小鼠,?,(20?2)g,由军事医学科学院动物中心提供,每天12h 12h光照、黑暗交替,自由饮水摄食。 1.3 实验方法1.3.1 分组及NMDA致死模型的建立:昆明小鼠随机分组,每组6只。小鼠腹腔注射不同剂量的NMDA(0、150、155、160和170mg kg,ip.),确定NMDA的致死剂量。昆明小鼠随机分为13组:对照组、PCH消旋体组、R(-)-PCH和S(+)-PCH组,各处理组均设3、6、12和24mg kg4个剂量组,每组9只。小鼠腹腔注射不同剂量的PCH消旋体或其异构体,30min后动物全部均给予致死剂量的NMDA(ip.),————————————————————————————————————————————————————— 观察小鼠2h内存活状况。结果采用Fisher精确检验。 1.3.2 PC12细胞的培养和诱导分化:PC12细胞培养于体积分数为5%的胎牛血清(FBS)和体积分数为10%马血清(HS)的DMEM培养基中,每5,7天传代一次。用于存活率检测的PC12细胞以2×10cells ml接种于多聚赖氨酸处理过的96孔板或35mm培养皿中,培养基中6%的FBS、6%的HS和50ng ml的NGF诱导分化,隔日换液一次。7d后,超过95%的细胞分化4 毒理学杂志2007年8月第21卷第4期 JToxicolAugust2007Vol.21 No.4?253? 表1 PCH不同旋光异构体对NMDA所致小鼠死亡 的保护作用(%) 组别对照组PCH 剂量(mg kg,ip) 0361224 R(-)-PCH 361224 S(+)-PCH 361224 与对照组比较, , 24h导致PC12细胞LDH漏出增加到对照的2倍,如图4所示,5μmol LPCH消旋体、R(-)-PCH和S(+)-PCH均可以显著抑制NMDA所致的————————————————————————————————————————————————————— LDH漏出增加(P<0.05,与对照组相比)。其中,R(-)-PCH的保护效应最 强,明显优于S(+)-PCH,PCH消旋体的作用居于二者之间。 小鼠存活率0(0 9)11.1(1 9)33.3(3 9)55.6,(5 9)33.3(3 9)11.1(1 9)55.6,(5 9)22.2(2 9)11.1(1 9)33.3(3 9)22.2(2 9)33.3(3 9)0(0 9) 与对照组比较, # P<0.05;与NMDA损伤组比较, , P<0.05, ,, P<0.01。PCH:盐酸苯环壬酯;R , P<0.05,,P<0.01 (-)-PCH:左旋盐酸苯环壬酯;S(+)-PCH:右旋盐酸苯环壬酯 。 图2 PCH不同旋光异构体对NMDA所致PC12细胞 存活率下降的保护作用 与对照组比较, , , P<0.05,,P<0.01 图1 NMDA对PC12细胞存活率的影响与对照组比较, ————————————————————————————————————————————————————— , , P<0.05,,P<0.01 NMDA的损伤剂量。如图2所示,3mmol LNMDA作用 24h使细胞存活率降至对照组的63.5%,R(-)-PCH显示出比S(+)-PCH更强大的保护作用:5μmol LR(-)-PCH可以使细胞存活率提高到对照组的80.5%(P<0.05),而S(+)-PCH虽然一定程度上可以提高细胞存活率,但无统计学意义。5μmol LPCH消旋体也可显著性提高细胞存活率,但保护作用略低于R(-)-PCH。由于PCH消旋体和R(-)-PCH均在5μmol L浓度时显示出最大保护效应,在之后的实验中,我们采用5μmol L浓度水平来比较PCH不同旋光异构体的保护效应。2.4 PCH不同旋光异构体对NMDA所致PC12细胞LDH漏出的影响 如图3所示,NMDA浓度依赖性地 3图3 NMDA对PC12细胞LDH漏出的影响 与对照组比较, # P<0.05;与NMDA损伤组比较, , , P<0.05,,P<0.01 图4 PCH不同旋光异构体对NMDA所致PC12细胞 LDH漏出的保护作用 ————————————————————————————————————————————————————— ?254?毒理学杂志2007年8月第21卷第4期 JToxicolAugust2007Vol.21 No.4 3 讨论 以往的报道表明PCH具有抗NMDA神经毒性的作用 [5] PCH对NMDA神经毒性的保护作用机制尚不完全明了。众所周知,NMDA受体过度兴奋介导的神经细胞迟发性损伤,参与许多神经退行性疾病的发病,并以持续的Ca内流为特征。后者含量的异常增高导致细 胞结构和功能代谢的不可逆损伤,引起线粒体功能不可逆损伤和自由基的大量生成,并触发其他依赖钙离子的蛋白-蛋白反应,最终导致细胞死亡。PCH的保护作用机制是否和胞内钙离子稳态、线粒体功能状态等相关,这也将是我们下一步研究需要解决的问题。 综上所述,R(-)-PCH作为盐酸苯环壬酯中的优性异构体,在体内体外均具有比S(+)-PCH更强的神经保护作用。而且鉴于盐酸苯环壬酯作为国家一类新药已应用于临床治疗20多年,不良反应少的特点,R(-)-PCH具有极大的潜能开发成为抗NMDA兼抗胆碱能的新药,为治疗与NMDA受体活性过高的神经系统相关疾病提供新药物。参考文献: [1] Perez-OtanoI,EhlersMD.LearningfromNMDAreceptor 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(收稿日期:2007-03-01) [7] 2+ ,但尚无研究对PCH、R(-)-PCH和S(+)-PCH 的抗NMDA神经毒性的保护作用进行比较,我们通过 对其作用进行比较,发现PCH、R(-)-PCH和S(+)-PCH在体内体外均具有拮抗NMDA的神经保护作用,且R(-)-PCH的保护作用显著强于S(+)-PCH,作为优性异构体而存在,消旋体的作用介于二者之间。 NMDA作为中枢兴奋性神经递质谷氨酸的受体激动剂,参与中枢兴奋性突触传递,其介导的信号转导,构成记忆和认知的基础,与突触可塑性,神经元生长与存活,长时程增强等重要生理过程有关。但是当包括NMDA受体在内的谷氨酸受体过度持续活化时会导致神经元的死亡过程即兴奋性神经毒性。兴奋性氨基酸受体过度激活,使此类受体在正常生理刺激下引起的第二信使效应得以扩大,突触后神经元过度兴奋并最终死亡。NMDA所致的动物惊厥模型并不能特异性考察药物是否具有抗NMDA的作用特征,因为GABA能系统药物等在此模型上同样有效,经研究后发现NMDA所致的惊厥致死模型是唯一特异性检测药物是否具有拮抗NMDA作用的模型,在该死亡模型上,只有具有NMDA受体拮抗特性的药物才能阻断该致死效应,显示保护作用。因而该模型也被称之为检测药物具有抗NMDA作用特性的药理终结点,且具有直观和重复性好的特点。因此,本实验采用NMDA致死模型,在————————————————————————————————————————————————————— 此模型上考察PCH及其旋光异构体的保护作用,结果显示PCH不同异构体均能在一定程度上提高小鼠对NMDA的耐受性。同剂量组相比,R(-)-PCH的保护作用远高于S(+)-PCH,可以显著提高小鼠的存活率;PCH消旋体需要更高的剂量才能发挥与R(-)-PCH同等的保护作用。说明R(-)-PCH作为优性异构体而存在,S(+)-PCH可能通过对R(-)-PCH的调节而使消旋体的保护效应折衷,介于2个异构体之间。 我们对PCH不同旋光异构体的体外保护效应也进行了比较,为进一步对其作用机制的探讨奠定基础。体外实验结果与体内实验结果显示出良好的一致性。R(-)-PCH预处理可以显著提高NMDA损伤作用后的细胞存活率,并有效抑制NMDA所致的细胞LDH漏出增加;S(+)-PCH对NMDA损伤后的细胞存活率无明显影响,但可以有效抑制NMDA所致的细胞LDH漏出增加;PCH消旋体的保护作用介于二者之间。目前 [6] —————————————————————————————————————————————————————