输卵管积水患者窗口期子宫内膜glycodelin及galectin--3的表达及意义（可编辑）

输卵管积水患者窗口期子宫内膜glycodelin及galectin--3的表达及意义（可编辑） 输卵管积水患者窗口期子宫内膜glycodelin及 galectin--3的表达及意义 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师 或指导小组 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所 有。 否则，承担相应法律责任。 研究生签名彬导师签章:锄弘二级学院领导盖章: , 加，-年占月』日 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写， 文责自负。 研究生签名:凉;如如 中文摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((1 英文摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„:„„„„„。4 的表达及意义 ―1上(―jo ’ 刖 吞„„„„„„((-(„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??7 材料与方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((7 结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(12 附 图„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((13 附 表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(15 讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(16 结 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(18 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„((((„„„„„„„„„„(18 综述一Galectill(3对人类生殖的影响„„„„„„„„„„„„。„。22 致 谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(31 个人简 历„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„32 中文摘要 输卵管积水患者窗口期子宫内膜 glycodelin及galectin一3的表达及意义 摘 要 目的:不孕症患者逐年增多，女性不孕患者中约有l,2为输卵管疾患 所致，而输卵管积水所致不孕又占输卵管疾患的10,(30,。IVF(ET技术 可以解决输卵管不通患者的受孕问题。在IVF(ET治疗中发现，与其它原 因所致不孕的妇女相比，输卵管积水妇女胚胎种植率及妊娠率均下降50,， 自然流产率增加2倍【l】。而有研究发现腹腔镜下输卵管切除术或根部离断 后再行IVF(ET治疗，可明显提高妊娠率和活产率【2】。目前关于输卵管积 水导致低妊娠率的可能机制有3种:机械冲刷理论、胚胎或配子毒性理论 以及影响子宫内膜容受性理论【3】。近年来子宫内膜容受性已 成为生殖领域 subt叫ive 观察2组 及无输卵管积水组 对照组 窗口期子宫内膜的表达，评价 影响子宫内膜容受性的机制，为可疑输卵管积水患者是否需要在IVF(ET 前行输卵管切除术提供依据。 方法:从子宫内膜容受性相关的差异表达基因文库中筛选出的与子宫 年1月,2010年10月在河北医科大学第四医院生殖医学科就诊的女性不 孕患者40例，年龄22(36岁，平均不孕年限3(2a。月经周期规则 25(32 d ，基础内分泌检查正常，无其他内分泌、免疫及代谢性疾病。 不孕原因 为输卵管因素、宫颈病变、男性精子异常。25例经欧乃派克输卵管造影 或经腹腔镜检查证实为输卵管积水 观察1组 ，其中23例接受腹腔镜输 卵管根部离断术 观察2组 ;另15例经欧乃派克输卵管造影证实无输卵 管积水 对照组 。在预计排卵前3(4d，连续阴道超声监测患者卵泡发育 至18(20 llull并排出，卵泡排出日为排卵第1日，排卵第6(8日为着床窗 中文‘摘要 口期。取观察l组经腹腔镜离断输卵管前及观察2组术后1个 月窗口期子 宫内膜及对照组窗口期子宫内膜。所取内膜部分液氮冻存用于111】心A测 定，部分4,甲醛固定用于免疫组化检测蛋白表达。应用RT(PCR检测技 术，分别取观察l组、观察2组及对照组子宫内膜各约50 Ing加入Rezol lml置匀浆器内充分匀浆，提取总鼢怆，取出0(5山，进行反转录得c研妊， TCAAGATCA 继而进行PCR扩增。glycodelin的上游引物序列为:5’(AGT ACTATA CAGCAAGTACCATAG CGG(3’下游引物序歹0为:5’(GTC G (3’，扩增片段长度为215 TGATGT bp。galectin(3上游引物序列为: 5’(GAA CTTCCA TGGTGAGGTCTATGT C(3’，下游引物序列为:5’(CAC CAAATCGTGCGT 游引物序列为:5，-CGG GAC(3’，下游引物序列为:5，- TGGAAGGTGGACAGCGAG G(3’，扩增片段长度为434 bp。25山的 PCR反应体系包括上、下游引物 10 pm01,山 各1山，cDNA2山，PCR循 环条件为:94?5 s，30个循 min，1个循环;94?40s，60?40s，72?50 环;72?10mm，1个循环。产物经1(5,琼脂糖凝胶电泳后，用VDS图像 分析系统进行照相和图像分析。IOD值经内参照校正，将校正值进行统计 学分析。应用免疫组化检测:将子宫内膜用4,甲醛固定后石蜡包埋，制备 4岬厚连续组织切片。分别进行髓和ABC免疫组化染色。脱蜡-消化、 素复染、脱水后透明、中性树胶封片。用PBS代替一抗做阴性对照。显 微镜观察并拍照。阳性判断:每张染色片随机选取5个视野，以背景 清晰、细胞质着色呈棕黄色为阳性，分为4个等级:细胞均无任何阳性染 色为“一";25,以下细胞阳性染色为“+’’;25,(50,细胞阳性染色为“+ +";50,以上细胞阳性染色“+++"。 所有数据采用sPSS 11(5统计软件进行统计分析。计量资料采用i士s 表示，组间差异采用t检验，以瑚(05为检验标准，当P O(05时差异有 显著性。 mRNA表达水平分别为 2组及对照组窗口期子宫内膜glycodelin 中文摘要 子宫内膜表达极低，几乎呈阴性一。但在输卵管离断后表达明显上调，呈 中等强度阳性++。 IIl】烈A表达 各组窗口期子宫内膜galectn3 观察1组、观察2组及 期子宫内膜表达明显低于对照组，呈弱阳性+。但在输卵管离断 后表达明 显上调，呈中等强度阳性++。 gale如n(3的低表达可能是造成输卵管积水患者子宫内膜容受 性低的原因 之一。 英文摘要 of and inthe ExpressionglycodeIingalectin一3 f(romwomenwith the window hydrosalpinxduring phase ABSTRACT iIlCrease l,2oftlle objectiVe:The洫f-ertilepatientS yearbyyear(About womeninf(吼ile areduet0劬a1 lO一 30,oftllose patients faCtor，and patients call slove也e谊 fertileofnletubal w弛hydrosalpinx(?F―ET problem c嬲es(Controlwitllotllermfertile rate and patien:ts，meemb巧 oimplantation rateofme witll are the 50, reduced，龇1d pregnancy patientshydrosalpiIlx abonionra:ceare2times inc陀弱edI?(Butt11e rateoft110se p聪弘a11Cy patients whohad t0 cutoffmeoViduCtare acceptedl印arosc叩eoperation incre嬲ed吲(At廿le are3mechamsmaboutme10w moment，mere pregnanCy ratecaused recent becomea byhydrosalpmxIjl(hyear'erldometrialrecep咖 ity hotresearch su?tive topic(Usingsuppression sub仃actiVe hybridi础ion，SSH 舶gme鹏ofdi能 rentiallyexpressed genes were establishmemofendometrial witll sequenced，me rec印tiVi 锣嬲socia:ted 也e screenedassociated、?imendometri甜 library di虢r枷allyexp舱ssedgene andsoon(Inour me receptiVi够genes，suCh终glycodelin，galectin-3s(tudM abommRNAand a11d evaluatet11e analysis prote访of哲ycodelingaleCtin一 3，to b酿7l，een andendometrial t0 relationshipglycodelin，galectill-3receptiVi锄and t量le mechamsmof iI?estigateef|c-ect甜1d hydrosalpinxon既nb巧o implar枷on( tlle t0 related Methods:Receptiv埘舶mdi虢re枇iallyexpressedg鲫 es witllme ofendometrial nle 1ibra巧w嬲screenedgenes rec印tiv时iIl 40womenmfIertile glycodel洫alldgaleCtin一3studyoptions(Choicing patients whotakemedical骶at】[Ilentat也eF0urcll ofHebeiMedical Hospital t0 22to 2010一12010一10(111ese 36 old， UniVers时舶m pati曲 agedyears 3(2 of chose25infertile ave硝e yearsinfertil埘(Wre p撕e鹏w池 1，23oft11e25c2useswhohad hydrosalpill 【嬲咖dy舯Iup aCcepted t0cut01jFt11e 觚d15 op洲ion 0viduCt嬲咖dy laparosc叩e gr01叩2， 4 英文摘要 iIlfIertile collectnle patiems eIldometri啪6-8aRer storethemiIl days o?lation，a11d liqVidm仃oge玛p矾of 也etisSuefixed a11d wi血4,fomaldehyde(ImPCR usedt0deteCtme SP mRNAand of me?lod were proteine? ression and ofR工PCRdeteCtion glycodelin galectin-3(Application 50 ofmeendometriumt0 R?zol1 ml seton Ing joiIl homogeIliZermlly was homogenized，e traCtedRNA，remove(me O(5山， t11e 434 oftlle cDNA，t量1enPC心bo吐lbp觚lplified舶gmentlen是m p-aCtin弱 intemalreference(PCR cyclil培cond“io璐were:94?5min， lcycle;94? 40 were s，50?40s，72?50s，30 cycles;72?10min，1 Cycle(ProduCts 1(5,agarosegel wimVDSc锄era elec仃ophoresis，iIIlageanalysissystem and Valuestlle referellce co玎ection image锄alysis(IOD co鹏 ction，也e by Valuesf(or ImmuIlohistochemical statistical甜mlysis( endometriumfixedwitjIl enlbeddedin 4 4,f;砌aldehyde para搦n， pr(epalIed thjCkconsecutiVe tissuesections( aIldABC 岬 陋， respectively， ilImlunohistochemical ant逗en mlution1:1 mouseanti-h_uInan dilution glycodelin oo，monoclonal galeCtill―3 1:1 OO ， secondaryantibody'DAB iIl廿leof wittlPBS弱 触lsparent， g啪weremouI】【ted(Antibodyw嬲replaCed and PositiVes1 m,Iard:Each negaltiVeoon缸(01(1mcroscope photo聊hed( stainedslicewere seleCtedf沁eVisiontoclear colorw嬲 r觚domly bac蜒舢d brown were four into cells cytopl嬲mpositiVe，diVided leVels: positiVestailling not did have 50,of cells cells"+";25, to any?一?;25,positiVestaining cells than w嬲?++?;more stailliIlgpositiVe 50, positiVestaining?十H?( 舢ldata袱鹏usedsPSS 11(5s(眦istic2Llson: waret0s1(atistical amlysis( data Measurement between were士s，di丘(erenCes test;cou呲 groupsusiI玛t data leVelof渤tistical atP r印。咖dpositivc僦e(The w部set si印ificaIlce O(05 R鹤ults: mRNA iIl tlle GlycodeliIl expression nmee伊’oups: 0(19士O(03 group l‖-25 、O(52士O(07 group 5 关文摘要 ― -―――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――一一? group，Il-1 5 ，P O(05(Glycodelin tllethree protemexpression:h1 groups: in cells glycodelin were proteiIl 91a11dular印itllelial expressed，meexpression t’0r也econtrol group、张s卅，tIle was(，me grouplexpressed group2 expressed++( GaleCt证-3n最NA iIlme expression 1，n_25 、O(41士o(07 鲈哪 2，n-23 、O(54士O(13 con 加l galeCtill-3 iIl也e prote证expression iIl mree粤’oups: galeCtill(3proteill a11ds仃omal cellswere 91aIldular印imelial for恤 expressed，戗 leexpression corl仃ol group、瑚卅，me w勰+，nle grouplexpressed group2 expressed++( Conclusion: are Glycodelm锄d relatedt0 galeCt证(3 endometrial showed廿latendome仃ial receptiV时genes(The咖dy receptiv埘ofpati吣 thelower w池hydrosalpill 【is of p00r，and expression of galectill??3逾endometriumwomenwi?l h舔aclose hydrosalpill 【may wi吐lmebadder relationship endome仃ial receptivi戗 words: Key endome仃 ial GlycodeliIl;GaleCtill-3; rec印tiv时; llydrosalpiIlx 6 --_I_?_―-?-_――-_―――__?―-――--??-―――-_I_―-―-___?_―____―_――--?―一一一 研究‘论文 输卵管积水患者窗口期子宫内膜glycodelin 及galectin一3的表达及意义 ―*?鱼 莉 声 不孕症患者逐年增多，女性不孕患者中约有l,2为输卵管疾患所致， 决输卵管不通患者的受孕问题。1978年7月25日世界上第一例试管婴儿 Louis 111 Brown在英国诞生。试管婴儿即?F-ETr Vi仃 0Feftilizationand 中，子宫是最为重要的，外源性胚胎需要在特定的时期 着床窗口期，即 正常月经的第20(24d 才能种植在子宫内膜上。在IVF(ET治疗中发现， 与其它原因所致不孕的妇女相比，，输卵管积水妇女胚胎种植率及妊娠率均 下降50,，自然流产率增加2倍。目前关于输卵管积水导致低妊娠率的可 能机制有3种:机械冲刷理论、胚胎或配子毒性理论以及影响子宫内膜容 受性理论。近年来子宫内膜容受性已成为生殖领域学者们研究的热点。 sub昀ctive ，杜国平等使用抑制性消减杂交技术 suppression 容受性相关的差异表达基因文库，筛选出与子宫内膜容受性相关基因，如 宫内膜中的表达，探讨子宫内膜容受性的分子基础，为提高输卵管积水患 者IVF妊娠率提供依据，为可疑输卵管积水患者是否需要在IVF(ET前行 输卵管切除术提供依据。 材料与方法 l临床材料 ‘ a。月经 科就诊的女性不孕患者40例，年龄22(36岁，平均不孕年限3(2 研究论文 周期规则 25(32 d ，基础内分泌检查正常，无其他内分泌、免疫及代谢 性疾病。不孕原因为输卵管因素、宫颈病变、男性精子异常。25例经欧 乃派克输卵管造影或经腹腔镜检查证实为输卵管积水 观察1组 ，其中23 例后来接受腹腔镜输卵管根部离断术 观察2组 ;另15例经欧乃派克输 卵管造影证实无输卵管积水 对照组 。 2主要仪器及试剂 台式离心机 德国Heraeus公司 超净工作台 全自动高压蒸汽消毒器 日本三洋公司 电子分析天平 JA5003 上海精科天平厂 制冰机 日本S舢吖O公司 低温高速离心机 SCR20B型 日本?TACm公司 (80?超低温冰箱 日本三洋公司 恒温水浴箱 哈尔滨东联公司 PCR仪 ABl5700型 美国ABI公司 凝胶成像系统 FOToD?怔型 美国Image公司 稳压稳流电泳仪 DWIIl6B型 北京六一仪器厂 酶标仪 Hr2型 奥地利加曲os公司 (152?超低温冰柜 日本SANYo公司 数显电热恒温干燥箱 202(2A 上海沪南科学仪器联营厂 BW―II型病理组织包埋机 安徽电子科学研究所 砌汜135型切片机 德国LEICA公司 CS一?型摊片烤片机 孝感宏业医用仪器有限公司 303―4A数显电热保温箱 上海阳光实验仪器有限公司 ‘ BX41显微镜 日本。盼m僻US公司 Qc蛳图像采集系统 加拿大QIMAG】[NG公司 微量核酸蛋白检测仪 美国The锄。公司 各种型号塑料离心管和冻存管 德国皿P公司 小型液氮罐 YDS(3 河南豫新机械厂 二甲基亚砜 DMSO 北京 北化精细化学品公司 氯仿 北京化学试剂厂 研究论文 乙 醇 ( 北京化学 试剂厂 琼脂糖 美国Promega公司 异丙醇 北京化学试剂厂 Rezol 北京赛百盛公司 RT_PCR二步法试剂盒 北京赛百盛公司 博亚生 物技术公司 glyCodelin、galec曲一3、p―aC曲引物 91yCodelin、galeCtiIl-3、p―aCtin引物上海生工生物 技术公司合成 glycodelin兔单克隆抗体IgG杭州宜康生物技术有限公司 galectin一3鼠单克隆抗体IgGl CWBIo公司产品 二抗试剂盒 美国Z啪D公司 3方法 ( 3(1子宫内膜采集 在预计排卵前3-4 8(20 d，连续阴道超声监测各组患者卵泡发育至1 频率为5?z。卵泡排出日为排卵第1日，排卵第6(8日为着床窗口期。 取观察1组经腹腔镜离断输卵管前及观察2组术后1个月窗口期子宫内膜 及对照组窗口期子宫内膜。所取内膜部分液氮冻存用于mRNA测定，部 分4,甲醛固定用于免疫组化检测蛋白表达。 3(2子宫内膜I汀(PCR检测技术 3(2(1设计的PCR引物 TCAAGATCAACTATACGG(3， glyCodelin的上游引物序列为:5，(AGT CAGCAAGTACCATAG glyCodelin的下游引物序列为:5，(GTC G(3’， 扩增片段长度为215 bp。 扩增产物大小为278 bp 同时以扩增片段长度为 540 ’ bp的p(actiIl作为内参照。 CAAATCGTGCGTGAC(3， p(aCt洫的上游引物序列为:5，-CGG AAGGTGGACAGC G-3， p(actill的下游引物序列为:5，一TGG GAG 扩增片段长度为434 bp。 3(2(2总对妣提取 。 研究论文 按照Trizol试剂盒 赛百盛公司 操作手册进行 3(2(2(1子宫内膜各约50 浆，然后转移至新的离心管中。将匀浆液于室温静置5min使其 充分裂解。 3(2(2(2加入200ul氯仿，用微量吸头打匀，室温静置3IIlin 3(2(2(3 5min 4?12000印m离心l 体积的异丙醇，充分混匀后静置lOmin。 3(2(2(5 3(2(2(6加1m175,乙醇，漂洗2次(3次RNA沉淀 3(2(2(7 菌工作台中干燥砌妊沉淀10min。 3(2(2(9对妊浓度和纯度测定。用无菌去离子水将鉴定合格 的对怆稀释适 对妊浓度 陷,m1 40×oD260×稀释倍数。 3(2(3cDNA的克隆 3(2(3(1 Kit完成 cDNA的合成。 按照赛百盛公司nv0(St印RT(PCR 将提取的砒蛆O(5ul与 d?9lul充分混合，70?静置5min。 迅速在冰上加以下组分 5xM(N匝，VBu毹r 4ul 111M 1u1 姗s 10each 砌NasiIl ( O(2ul 100mM 2ul I沁verse O(5u1 M枷V n孤scripatase ‘ DEPC(订eatedwater lO(8ul 37?温育60IIlin; 94?5111in终止反应 3(2(3(2PCR扩增产物 在20ul的反应总体积中加入下列物质 lO 研究论文 cDNA 3ul Buff打 2ul lO×PcR Fo删pmer lul ReVellse豳er 1ul 帅s 1Ond汀each 0(5ul U-Taq?qAP01ymerase O(3ul ddH20 12(2ul 在ABl5700型PCR扩增仪上完成PCIt扩增，条件如下:94? 5nlin，1个循 环;94?40s，50?40s，72?50 s，30个循环;72?10mill，1个循 环。 3(2(3(3目的基因的鉴定 软件进行扫描观察结果，在相应位置上可见清晰的特异性DNA条带，并 记录实验结果。 3(3免疫组化检测 ( 3(3(1石蜡标本常规4岬连续切片，平铺于涂有APES的载玻片上，放 于60?烤箱4小时。 3(3(2浸入二甲苯I、II脱蜡各10分钟。 3(3(3 钟。 3(3(4 3,H202及甲醇中室温孵育15,20分钟，以消除内源性过氧化物 酶的活性。蒸馏水3分钟×3次，O(01MPBS5分钟。 3(3(5抗原修复采用PBS缓冲液高压锅加热2分钟进行抗原修复。室温 冷却，放入PBS内5分钟×2次。 3(3(6吸去组织周围多余液体，正常山羊血清封闭，37?湿盒内孵育45 分钟。 稀释，单克隆小鼠抗人galectm一3一抗，浓度按l:100稀释，4?过夜。 3(3(8O(01M PBS冲洗，5分钟×3次。 3(3(9滴加第二代生物素标记的二抗工作液，37?湿盒内孵育30分钟。 n 研究(论文 3(3(10O(01M PBS冲洗，5分钟×3次。 3(3(11滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37?湿盒内孵育25分钟。 3(3(12O(01M PBS冲洗，5分钟×3次。 3(3(13DAB液显 色。 ， 3(3(14苏木素复染，常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 用PBS代替一抗做阴性对照。显微镜观察并拍照。阳性判断标准: 每张染色片随机选取5个视野，以背景清晰、细胞质着色呈棕黄色为阳性， 分为4个等级:细胞均无任何阳性染色为“一’’;25,以下细胞阳性染色为 3(5统计学方法所有数据采用SPSS11(5软件进行统计分析。计量资料以 i士s表示，组间比较采用t检验。以P 0(05为有统计学差异。 结 果 1Glycodelin及galeCtin(3删险IA的表达 m砌蚣表达 观察1组、观察2组及对照组窗口期子宫内膜91ycodelin mRNA表达 观察1组、观察2组及对照组窗口期子宫内膜galectin-3 2各组窗口期子宫内膜glyCodelin及galectm(3蛋白表达 极低，几乎呈阴性一 F嘻lB 。但在输卵管离断后表达明显上调，呈中 等强度阳性++ Fig(1C ( galec恤(3蛋白在对照组窗口期子宫内膜的腔上皮、腺上皮和间质细 窗口期子宫内膜表达明显低于对照组，呈弱阳性十 Fig(2B 。 但在输卵 管离断后表达明显上调，呈中等强度阳性++ Fig(2C 研究论文 附 图 图1A 图1B 图1C Immunohistochemicallocalizationof iIlmewindow Fig(1 glycodeliIl phase hum锄endoem仃ium iIl廿le她e舯ups × 400 爹己弋t!: 霹露 谚。0? l。?痧??瓢’’一?‘0 '。1‘ 一蛳t(o 黼?'避 图2B 图2C Immunohistochemicallocalizationof int量lewin 10w Fig(2 galeCtin??3 phase iIl hum锄endoemtriumthemree groups ×400 13 ， 研究论文 B―aclin gIyCOdelin marker对照组观察1组 观察2组 A Detectionof mRNA Fig(3 leVeli11mewindowhunall glycodelin phase endoe删uIIlinme慨e groupsby 1(5,ag啪 segelimageel咖horesis( B―actin IeCtin一3 ga marker对照组观察1组 观察2组 BDetectionof i11?le windowhum觚 Fig(3 galectiIl一3四level ph懿e endoen耐啪iIl t11e龇e groups by1(5,agarosegelilIlage eleC呐resis( 14 f――( ( 堑壅垒查 附 表( TIablelQuantificationnlI龇,levelinme of百ycodelin windowhumall phase endoe删矗啪illt11etI玳e 孑士s groups( ――――:?―――――――― ――― ?――――――――――――――――――一coll仃ol Before Groups group nle s嘤e 叮A不i五夏五丙 c嬲es n 15 25 23 n焖妣 O(75士O(03 O(19士O(03? O(52士O(07 glycodelin ――――――――――――――――。―――――― ―――‘――――――――一 wim C0n们l Note:。conlpare P o(05;?compare、衍nl心 erP 0(05 s?唱e巧印up TIable2 of Qu锄ification inthe window galeCtin一3删level hum 锄 phase endoemtri啪inthe也ree i士s groups( ――――― ―――――――――― ―――― ?―――――――――――――――――――――(一( Groupscontrol Beforetlle group su玛e叫Afber?le s鸣苫歹 15 25 23 cases n 0(54士O(13 O(07士O(02? 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