积雪草苷及其类似物的吸收和代谢性质研究（可编辑）

积雪草苷及其类似物的吸收和代谢性质研究（可编辑） 互 上 密 级 分类号 保密驯限 硕士学位论文 目 题 摆雪堇萱题墓差型物的哩蝗麴拭谢性厦研究 作者姓名 翁骏 指导教师??昌熬至?? 培养单位 至塞医堂整堂瞳越射当揎射医堂噩客匮一???? 专业名称 药理堂 一 论文提交日期 ?生 ?旦 ?目 学位授予单位 主垦厶&鲢亟芏至至医生垂堂瞳 中国人民解放军军事医学科学院制 军事医学科学院研究生学位论文独创性声明 秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风,本人声明所呈交的 学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成 果,除了文中特别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得芏圭匿堂盘鲎睦或其它 教育机构的学位或证书而使用过的。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签字日期: 论文作者签字: 鱼?垒 竺年?生月?三日 军事医学科学院研究生学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解芏主匡堂盘茔睦有关保留、使用学位 论文的。特授权芏主匡堂盘茎瞳可以将学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编以供查阕和借阅。同意将本学位论文的复印件和磁盘送 交国家有关部门和机构。 保密学位论文在解密后适用本授权书 论文作者签字: 签字日期: :釜?玺 垄:年?月二,日 签字日期: 丛《 指导教师签字:馥聋 月?日一 中文摘要 积雪草苷及其类似物的吸收和代谢性质研究 中文摘要 目的本实验室在活性筛选阶段发现积雪草苷具有新的药理活性,初步研究显示 其口服生物利用度很低。本研究采用体外、体内、在体和计算机预测等手段对积 雪草苷及其类似物的吸收、代谢性质进行研究,以期阐明积雪草苷生物利用度低 的原因,并指导进一步的开发。 方法.法检测积雪草苷的溶解度和值,软件预测积雪草苷的.值和 驴值。.法检测样品对一细胞和细胞的细胞毒性,法和法 检测样品对大鼠原代肝细胞的毒性。.运用在体单向灌流模型研究大鼠肠道对积 雪草苷和积雪草酸的吸收,求得有效渗透系数酊;使用细胞模型检测各化 合物转运的表观渗透系数。.制备大鼠原代肝细胞和大鼠肝脏微粒体,研究 肝脏中代谢酶对积雪草苷的作用;制备大鼠肠道细菌的分泌酶溶液,以法和 ?法检测体外实验代谢产物,法检测体内实验大鼠尿、血中的代谢产 物。 结果.积雪草苷在水溶液中极微溶解;各值下的如值在.至.之 间;软件预测各羟基值均在以上,值为.;仅油水分配系数没有 违反“五律”。.积雪草苷和羟基积雪草苷对一细胞、细胞和原代肝 细胞在测定浓度范围内无生长抑制作用,积雪草酸对和羟基积雪草酸在高浓 度时 对细胞生长有明显的抑制作用。.大鼠的各个肠段对积雪草苷的吸收均较低, 最 高只,。为.× /,吸收机制为被动转运,抑制糖蛋白不能使吸收明显 增加,苷元积雪草酸在结肠段吸收程度较高,最高只,,为.×一/;在 细胞模型中,积雪草苷最高只。,为.×一/,苷元积雪草酸最高为. ×一/。.积雪草苷在大鼠肝微粒体和肝细胞中的代谢稳定性很高;口服积 雪草苷%以上以苷元形式排出体外,积雪草苷可被大鼠肠内菌群代谢生成三 个代谢产物,原形物和代谢产物均为吸收入血成分。 结论积雪草苷在肠道吸收很少,主要原因在于其本身理化性质不良。积雪草 苷 不被细胞色素酶代谢,但可被肠道内细菌水解。本研究初步建立了药物开 发早期阶段吸收和代谢的研究方法。 关键词积雪草苷;吸收;代谢;肠道菌群 军事医学科学院硕士学位论文.. 英文摘要仃: . , . . :. 一 ,.如 . , .,. . ‘ ’. : .. ? 一 , ,. ., . , ? ., .血 .. : , . ,.. :,,, 军事医学科学院硕士学位论文引言 引言 药物的吸收、分布、代谢、排泄性质和霉副作用是候选药物能含通过临床试 验的关键。据估计,%的候选药物由于不理想的药效而导致开发失败,这可能 是由于可溶性、吸收率、代谢稳定性等因素所造成;而%的候选药物由于安全 性问题被淘汰【。在药物发现阶段进行药物代谢及其动力学研究卿和药物 的吸收、分布、代谢及毒性的研究/能显著提高先导化合物发现的 效率,改进候选药物质量,因此可以降低药物开发失败的风险并最终开发出性能 优良的药品。在药物发现阶段筛选出的活性化合物至先导化合物的优化过程, 需要研究化合物被吸收的程度、代谢稳定性、代谢产物、代谢途径和对代谢酶的 影响等问题,从而有助于总体上把握待开发化合物的性质。 体内肠道吸收的两个主要决定因素是溶解性和肠道通透性。因此,需要在药 物发现的早期阶段进行溶解性筛选,如采用比浊溶解性检测 。己开发依据结构的软件如或应用人工神经网 络发展而来的分子描述符来预测或估算化合物的溶解性、通透性和扩散性。化合 物一旦溶解,须穿过肠壁进入血液。一和细胞株被普遍用作通透性筛 选,易透过一单层细胞提示在体内吸收较好。利用高表达的 细胞筛选,可同时研究化合物在肠壁的代谢。应用高表达的一细胞株, 可以用于化合物的主动吸收研究。而单层小牛脑微血管内皮细胞可用于进入血脑 屏障的筛选。 早期代谢特性的研究包括代谢稳定性研究、代谢酶途径和相关酶研究、对代 谢酶的抑制或诱导研究、代谢产物的检测等。代谢稳定性影响药物的生物利用度 和半衰期,主要受细胞色素同工酶和葡萄糖醛酸基转移酶等影响。参与代 谢的同功酶确认,有助于确定化合物的代谢性质。抑制一种共同的代谢酶 是同时使用不同药物产生临床副作用的常见原因。目前主要被检测的代谢酶有 、、,采用的检测方法有荧光比色法和//技术平台。 对筛选的另一方面是区分抑制机制:直接抑制或基于代谢/机制的抑制。直 接抑制为可逆抑制,化合物与酶非共价结合。基于代谢的酶抑制是由于代谢产物 与酶更强的可逆结合。基于机制抑制是活性中间产物与酶共价结合。这些抑制类 军事医学科学院硕士学位论文. 引言 型易于通过筛选区分,因为直接抑制是恒定或随时间减弱,而基于代谢/机制的 抑制随时间增强。筛选结果分为:强抑制。。小于/、轻度抑制。 小于/和弱抑制。。大于./。诱导代谢酶的筛选,其 意义在于参与药物相互作用和诱导似与啮齿类致瘤试验中肝肿瘤形 成有关。此外,还有药代动力学的快速检测,利用少量动物,在短时间内检测单 个或多个化合物在体内的药代动力学参数,有助于选择优良的先导化合物。 药物发现过程中早期的药物代谢及其动力学研究的系统有微粒体、表 达酶、肝切片和肝细胞。利用孔板与/检测原形药的变化,可以高通量 筛选化合物的代谢稳定性。体内药物动力学筛选可多个化合物同时给药,这 在 研究中普遍使用,但应注意化合物之间相互影响。为解决体内外药代筛选 规模小及化合物相互影响,国外实验室开发出了快速药代筛选法,将采集样品的 周期缩短至给药后~,利用串联//,计算。.。。利用体外肝细胞 培养和串联/或/可识别代谢产物。今后高通量的筛选将更多 的采用基于芯片的模型。常用的早期考察化合物的药物样性质的依据是“”。通过对大量己知性质的化合物进行计分建立数据库,可以对新 化合物计分,再依药物样或非药物样性质的计分结果确定化合物的性质。 毒性己成为新药开发过程中淘汰率高的主要原因,在整个新药研究和开发淘 汰比例中占%~%。近十余年,国外进入期临床的候选药物由于安全性和 有效性的问题,仅有%能上市。由于进入临床试验前无法预测安全性和有效性, 导致研究和开发费用激增。对已上市药物而言,在过去年中有.%的上市药 物因严重不良反应而从市场中撤出,在年~年之间有.%上市药物 在销售期间要在标签上加黑框以示可能存在的不良反应,尽管所占的比例不大, 但对患者造成的损害和给新药研制者带来的经济损失巨大。在美国因药物不良反 应导致的死亡在总的死亡原因中占第位至第位。安全性已成为制药 工业提高产出与投入比的主要挑战。因此,各专利药物制造企业在新药发现和开 发过程中非常重视毒理学研究,采用各种新技术,试图尽早发现潜在的毒性,以 达到尽早淘汰有明显毒性的目标化合物,减少投资损失,同时也催生了发现毒理 学的诞生。发现毒理学不同于临床前毒理学研究,是指采用计算机辅助预测模型 初期使用、体外高通量毒性包括细胞毒、基因毒和胚胎细胞毒性检测技 军事医学科学院硕士学位论文术、高内涵筛选技术、活性代谢产物的检测技术、短期模式动物试验等, 对活性化合物或先导化合物进行毒性初步筛选,研究毒理机制和毒性与结构关 系,评估先导化合物毒性大小,选择先导化合物并指导新化合物的进一步合成。 本课题从积雪草苷的低生物利用度入手,采用实验手段和计算技术对积雪草 苷及其类似物的物理化学性质、吸收、代谢和毒性进行了研究。阐述积雪草苷的 吸收机制和体内变化过程,分析药物在体内的代谢过程和药效之间的联系,并对 进一步开发提出建议。同时,初步建立了药物开发早期阶段的吸收、代谢和毒性 评价方法。 军事医学科学院硕士学位论文 第一章 第一章积雪草苷的理化性质研究 第一节积雪草苷在不同水溶液和有机溶剂中近似溶解度的测定 .实验目的 考察积雪草苷在水、酸性溶液、碱性溶液、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、 乙醚和正丁醇中的溶解度,选择能将积雪草苷溶解或提取的有机溶剂。 .理论基础 参照《中国药典》版二部圆,药品的近似溶解度以下列名词表示: 极易溶解 系指溶质能在溶剂不到中溶解 易溶 系指溶质能在溶剂~不到中溶解 溶解 系指溶质皿能在溶剂~不到中溶解 略溶 系指溶质能在溶剂~不到中溶解 微溶 系指溶质?能在溶剂~不到中溶解 极微溶解 系指溶质能在溶剂~不到中溶解 几乎不溶或不溶系指溶质能在溶剂中不能完全溶解 .实验仪器与材料 药品试剂积雪草苷%,购自广西昌洲天然产物开发有限公司,下同 柠檬酸、碳酸钠、甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯均来自北京化工 厂,溶剂均为分析纯级。 主要仪器恒温水浴槽数显调节仪,北京市长风仪器仪表公司 .实验方法 参照《中国药典》版二部中溶解度测定方法:精密称取积雪草苷 置于玻璃试管中,根据不同近似溶解度的范围,分别按药物质量与溶液体 积:, :,:,:,:的比例分别加入不同的溶剂。加入水溶液包括 蒸馏水、./柠檬酸.、./ 。 .;有机溶液包 水浴,每 括甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醚和正丁醇,含样品试管置于 振荡,观察内的溶解情况。 .实验结果 如表所示,积雪草苷在蒸馏水中极微溶解。 军事医学科学院硕士学位论文第一章 表积雪草苷的近似溶解度测定结果 第二节?, 法测量积雪草苷在水、溶液和缓冲液中的平衡溶解度 .实验目的 药物分子必须溶于水才能透过生物膜,进入血液循环。如果溶解度太低,大 部分服用的药物就会被排出体外而不能进入血液循环系统。本实验测定积雪 草苷 在水、生理盐水和缓冲液中的平衡溶解度,为活性、吸收和代谢实验的加药 量提供依据。 .实验仪器与材料 药品试剂积雪草苷标准品,.%,积雪草苷%,乙腈 , 检测器,色谱柱 主要仪器 高效液相色谱仪, 。 ×., 色谱工作站,超纯水系统,?型磁力恒温搅拌器 上海县曹行无线电元件厂,电子分析天平, .实验方法 .积雪草苷线性关系考察 溶解后分散至溶液水、 称量.积雪草苷标准品,以 生理盐水、缓冲液中,得积雪草苷贮备液,浓度为/。将贮备液以 水稀释成一系列浓度的积雪草苷标准溶液,浓度分别为、、、、、 、/。分别取标准溶液进样,每个浓度进样三次,以峰面积对 浓度作图。检测方法如下: 色谱柱: . . 流速: 军事医学科学院硕士学位论文第一章 流动相 水 流动相 .%乙腈溶液,梯度分离 梯度条件 号曲线 水~ %~%,~ %~%,~ % 进样体积 . 样品浓度 ~/ ? 温度: 检测: .分析方法的确证 ..回收率试验 按照标准曲线的制备方法配成高、中、低三个浓度积雪草苷溶液,每个浓度 测定次,由标准曲线回归方程计算其测定值,测定值与真实值的比值为回收 率。 ..日内糟密度试验 取配制的低、中、高三个浓度的样品,同一天分别于早、中、晚各测定一次, 计算日内标准偏差。 ..日问精密度试验 取配制的低、中、高三个浓度的样品,连续天分别进样一次,计算日问标 准偏差。 ..检测限和定量限 取积雪草苷对照品适量,配制成药物浓度在标准曲线末段并逐渐降低的一系 列浓度,每个浓度测三次。测定各浓度样品每次测得的药物信号强度与噪音 强 度,然后求其平均值。当信号强度为噪音强度倍时的药物浓度,定为药物的 检测限;当信号强度为噪音强度倍时的药物浓度,定为药物的定量限。 .积雪草苷平衡溶解度的涓定 取过量的积雪草苷置于小烧杯中,加入溶液重蒸水、.% 溶液或.的缓冲液,恒温.?磁力搅拌后取,. 的微孔滤膜过滤,将滤液稀释至,取.进样测定。 .实验结果 军事医学科学院硕士学位论文一 第一章 .积雪草苷在重蒸水中线性关系考察 积雪草苷在~“/范围内线性关系良好。回归方程为: .。 .分析方法的确证 ..回收率试验 高、中、低三个浓度的方法回收率如表所示。 表积雪草苷的回收率 回收率% 理论浓度“/ 测量浓度肛/ .?. .?. .?. .?. .. .】. ..精密度试验 高、中、低三个浓度的日内和日问精密度如表所示。 表积雪草苷的精密度试验结果 ..检测限和定量限 积雪草苷在水中的检测限约为,定量限约为,最低检测浓度约为 .肛/。 屯积雪草苷的平衡溶解度 结果显示,积雪草苷在水中的平衡溶解度为.肛/。同法测定得其在 生理盐水和. 缓冲液中的平衡溶解度分别为.斗/和 .斗/。 第三节积雪草苷油水分配系数的嗣定 .实验目的 药物分子若透过生物膜,需同时具有合理的水溶性和透过生物膜所必须的疏 水性。妒可用来衡量化合物的亲水或亲脂能力。由“五律”可知,当化合物 的 军事医学科学院硕士学位论文一. 第一章 大于.时,可能不利于其在肠道内的吸收。本实验利用测定积雪草 苷在平衡前后水相中的药物浓度,计算分配系数公式为 ?/ 女/女,求得不同下的油水分配系数值。其 中。表示平衡前药物在水相中的浓度,女和分别表示平衡后药物在水相和油 相中的浓度。 .实验仪器与材料 药品试剂积雪草苷%, 正辛醇天津市化学试剂分厂六厂,淫羊 藿苷%,中国药品生物制品检定所 主要仪器 高效液相色谱仪, 检测器, ×.,色谱工作站, 超纯水系统, 等。 .实验方法 . 法测定积雪草苷的四值 ..配制不同值的缓冲液 一缓冲液 、、 一缓冲液 、 ?溶液 .~.邻苯二甲酸氢钾一 . ..? ?溶液 ..分配前溶液样品的制备 取份每份.积雪草苷分别溶于 ,各分散于不同 值的缓冲液中。取出用于测定分配前积雪草苷在缓冲液中的浓度。采用固相 萃取,分别用甲醇,水冲洗? 萃取小 柱,取.分配前积雪草苷溶液加入内标溶液淫羊藿苷.溶于甲 醇至后涡旋,上萃取小柱,水清洗,最后用甲醇洗脱。洗 脱液用氮气吹干,以山流动相流动相:流动相:复溶,取山 进样。检测方法如下: 色谱柱: ..× ./ 流速: 流动相:水 军事医学科学院硕士学位论文一 第一章 流动相:.%乙腈溶液,梯度分离 梯度条件:号曲线 水~ %一%,~ %一%,~ % 进样体积:. 样品浓度:~/./ 温度: 检测: ..分配实验和分配后溶液样品的制备 取分配前不同值积雪草苷缓冲液,经水饱和的正辛醇溶液,一 同加入到容量瓶,于。涡旋振荡,静置过夜后分出水层, 离心得分配后积雪草苷溶液。溶液中积雪草苷提取采用固相萃取,分别用 甲醇,水冲洗萃取小柱,取.分配后积雪草苷溶液加入内标溶液 后涡旋,上萃取小柱,水清洗,最后用甲醇洗脱。洗脱液用氮气吹 干,以流动相流动相:流动相:复溶,取进样。 检测方法同上。 .实验结果 的计算采用公式 自,女.《女/女? 水/,/,其中 表示测得的平衡前药物在水相 【 中的峰面积,为内标物峰面积, 为测得的平衡后药物在水相中的峰面积。 测定结果见表。 表 法测定不同条件下积雪草苷的值 第四节应用软件预涓积雪草苷的和值 .实验目的 大多数的化合物分子包含能在一定条件下给予或俘获质子的官能团,电离平 衡可由表述。.值对于药物的口服吸收具有重要意义,如对于弱酸性药物 军事医学科学院硕士学位论文第一章 .. ?/一,由值和胃肠道值可判断原形和解离药物的比例。 软件只计算化合物在中性形式的妒,若计算在不同值的表观, 可选用 ..的插件功能。 .实验仪器与材料 . 预测软件,.】.// .. . 预测软件 .实验方法 .预测值 使用提供的插件功能软件读取化合物二维结构式处理即 得。 .预测值 软件采用基于原子和分子片段的分析法计算值‘。将化合 物的二维结构式编写成计算机可读的线形式,即式,然后输入软件对话框即 可。 .实验结果 .预测& 图中各羟基旁的数字代表预测的。值。图中位嚣最高的曲线代表原形 化合物所占百分比,其它曲线代表不同电离形式化合物所占的百分比。 巷背毽霄 。 图积雪草苷各羟基的值 军事医学科学院硕士学位论文.. 第一章 图积雪草昔及其不同电离形式在不同值所占百分比 .软件法预涌 结果如图所示,软件预测结果为.,稍高于实测值。同法,可预测羟 基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸的值分别为一.、.和.。: : : ::. ???一??..?』,??.?....~?.....? ???..?......~..???????一一.』..?????? ? . . 矩?一 . . 她 ? . . ?. . 。 一. 一. ?一, 一. 一.? ,?. ?. ? . . .. ? . 【. ?一 。 . 【. . . . . . ? 铋 . : ?一?一?一一?一一一?一?一一?一一 . : .图 软件预测结果截屏图 军事医学科学院硕士学位论文第一章 小结 .积雪草苷在蒸馏水中极微溶解,即溶质能在溶剂~不到 中溶解,并以法证实。参考等【评价固体电解质水溶性方程: ./.。一,?表示油水分配系数,。表示化合物的熔点。 由实验测定积雪草苷的油水分配系数较低,可以判断其熔点应比较高。 .积雪草苷在氯仿、乙酸乙酯、乙醚和正丁醇中的溶解度很低或几乎不溶, 在从水溶液或尿液中提取时,采用有机相萃取的方式不可取,可考虑采用。。 的 固相萃取小柱。积雪草苷在可与水混溶的甲醇和乙醇中溶解度较好,甲醇优 于乙 醇,因此,当从粪便中提取化合物时可采用甲醇促进溶解。 .在酸眭 .和碱性溶液 .中的近似溶解度不变,参照图 .以下时均为原形,说明其应为难电离的弱酸性 的预测结果,积雪草苷在 化合物。预测所得积雪草苷的各个可能给出质子的羟基值均大于,由公式 ?/,那么在人体条件下,积雪草苷的存在形式几乎全为原 形。 .根据化合物的理化性质,结合“五律” ?,可以对化合物的 口服吸收好坏进行预测。“五律”的思想是由和他的同事在辉瑞公司提出 的】。所谓“五律”,即:相对分子质量×;氢键供体数个 ×;氢键受体数个×;或.×。当违 反上述任意两个或多个规则时,化合物出现口服生物利用度差或代谢分布差 的可 能性就很大大于%。此规则仅适用于被动转运的情况。而积雪草苷的分子量 为.,氢键供体数为,氢键受体数为,仅妒值没有违反“五律”。因 此,仅从理化性质上判断,积雪草苷在体内吸收可能较差。 军事医学科学院硕士学位论文第二章 第二章积雪草苷及其类似物的细胞毒性检测 .实验目的 考察积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸对原代肝细胞、 一细胞和细胞的细胞毒性。 .理论基础 参照等人的方法并作适当修改。毒性测试的原理为活细 胞中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的黄色一,一一一一,一 ,还原为难溶性的篮紫色结晶物甲 躜并沉淀在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶 解细胞中的甲躜,用酶联免疫检测仪在波长处测定其光吸收值,可间接反 映活细胞数量。 乳酸脱氢酶为体内能量代谢过程中一个重要的酶,存在于几乎所有组 织中,组织细胞死亡释放大量,上清液中水平代表培养细胞的损伤程度。 取上清液,用生化检测仪在波长处测值,计算含量。 .实验仪器与材料 药品试剂积雪草苷%,羟基积雪草苷%,积雪草酸, %,羟基积雪草酸%,培养基, ,谷氨酰 /培养基,胎牛血清 胺,,胰蛋白酶.%, 北京天象生物科技有限公司,胶原酶,乳酸脱氢 酶试剂盒中生北控生物科技股份有限公司 细胞和动物一细胞、细胞中国医学科学院基础医学细胞中心; 雄性大鼠,体重~军事医学科学院实验动物中心 主要仪器酶标仪 , ,洁净工作台 一,北京半导体设备一厂,。培养箱一,, 全自动血液生化仪 ,意大利,倒置显微镜?, 重庆光学仪器厂,恒温水浴蹦.电热式,北京长风 仪器仪表公司,冷冻离心机德国,德国 军事医学科学院硕士学位论文第二章 .实验方法 .细胞分离和培养 .. .细胞的培养 一细胞培养于、湿度约为%、含%的环境中,采用培 养基,培养基中添加%胎牛血清,%非必需氨基酸,%一谷氨酰胺,/ 青霉素,/链霉素。细胞在小培养瓶中培养,隔日更换培养液,~用 含的胰蛋白酶.%溶液消化后分散成细胞悬液,×个细胞 /浓度接种于孔板,/孑。 ..如伍细胞的培养 细胞培养于、湿度为%、含%的环境中,采用培养基, 培养基中添加%胎牛血清,%谷氨酰胺,/青霉素,./链霉素。 细胞在小培养瓶中培养,隔日更换培养液,培养用含的胰蛋白酶 .%溶液消化后分散成细胞悬液, 个细胞/皿浓度接种于孔板, /孑。 ..原代大鼠肝细胞的分离和培养 ...细胞分离与纯化 术前将己消毒的无钙灌流液 ., ., ., .和.%胶原酶灌流液 .,加水至, ., ., 。.。 ., ., .,胶原酶,加水至, .,灌流液用水浴,无血清/一培养液置于冰箱降温。 雄性大鼠,以%戊巴比妥钠麻醉后固定于手术台。用%酒精消毒腹部皮毛, 而后在下腹做形切口,暴露腹腔及门静脉。在门静脉近肝脏处穿丝线打一活 结, 以留置针穿刺门静脉,结扎丝线固定留置针,退出针芯。血液流出后,灌入 己调整流速的无钙灌流液以清除肝脏内血液,流速为~/。灌 注几秒钟后,肝脏迅速膨大,此时迅速剪断下下腔静脉放血。灌注约后肝 脏呈米黄色,换为.%的胶原酶灌流液,流速调整为/。灌注胶 原酶灌流液时为保证消化效果,可在灌流时,不时以止血钳夹住剪开的下下 腔静 脉,使胶原酶灌流液充满肝脏后消化一段时间,再将灌流液放出,反复多次。~ 后肝脏逐渐消化,肝脏尖缘变钝,摘下肝脏,置于已消毒的玻璃平皿中, 军事医学科学院硕士学位论文一. 第二章 转移至超净台。用冷/一培养液清洗肝脏,除去表面血迹,将肝脏浸入培 养液,撕开肝包膜,用剪刀撕扯肝组织至棉絮状使肝细胞流出。细胞悬液经 ,~ 目筛网过滤,滤得细胞装入离心管。以预冷无血清酬/一培养液在 /离心;倒出上清液,相同条件再洗涤两次,加入适量培养液制得 肝细胞悬液。 ...细胞培养 培养板胶原包被 取左右大白鼠一只,切下鼠尾,置%酒精浸泡;无菌条件下撕下 .%乙酸溶液,置。冰箱,不时 尾键,剪碎置于平皿。取.尾键浸入 摇动,后,移入灭菌离心管。以/离,吸取上清液,磅 高压灭菌,一冰箱保存。取/一培养液与胶原溶液:混合,滴加 溶液至溶液呈桃红色。立即以吸管吸取少许鼠尾胶原溶液涂于培养板,胶原 溶液不宜过多,浸润板底即可。将培养板放入培养箱,胶原溶液烘干即可。 肝细胞培养与细胞存活率检测 制得的肝细胞悬液以删/培养液含%胎牛血清、/青霉素、 谷氨酰胺、。/胰岛素、/地塞米松悬 /链霉素、./ 浮,吹打均匀。用质量分数.%台盼蓝等渗盐溶液与肝细胞悬液以:的比例 混合,轻摇分钟,在倒置显微镜下观察,计算未着色细胞数所占细胞总数的百 分率,即为肝细胞的成活率。肝细胞的成活率一般大于%可用于研究。调整 细胞密度为×个/?,接种于孔细胞培养板中,/孑,置 ,%。 条件下培养。待~细胞贴壁后换液,以除去死细胞,以后每进行换液。 .岍试验 加样 精密称取积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸。对于 细胞和细胞,加药浓度分别为、、、、.州,配制最高浓度药物 时以助溶,溶液中的终浓度?.%。每个浓度个重复孔,另加.% 和以及空白孔作为对照。进行原代大鼠肝细胞婀试验时,具体化合物未知, 加 药量采用质量浓度,分别为、、、、.岭,,配制最高浓度药物时以 助溶,溶液中的终浓度?.%。每个浓度个重复孔,另加.%并 军事医学科学院硕士学位论文一一 第二章 以及空白孔作为对照。 检测 细胞接种后培养,加入药液,置培养箱作用。后,每孔加入/ 的液,继续温孵,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。加入 溶解,以酶联仪在处测吸光度。 .测定 仅测定原代大鼠肝细胞的变化,加药量同“试验”项。药物作用 后,每孔吸取,使用全自动生化仪在处进行检测。 .结果处理 增殖抑制百分率%细胞对照。。值一加药组。值/细胞对照 。。值一空白。。值 %。以细胞抑制率对药物浓度用软件拟合, 若曲线形状为典型的型浓度一效应曲线,可得到抑制细胞生长%所需药物浓 度,即。。。对检测的统计学处理采用检验。 .实验结果 .试验结果 试验结果和相关文献表明当浓度.%时,对一、和原 代肝细胞无细胞毒作用。积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草 酸的 细胞毒作用见下列各表: 一细胞试验结果 如表和表所示,积雪草苷和羟基积雪草苷在给定浓度范围内对 细胞无毒性,积雪草酸和羟基积雪草酸在洲以上有明显细胞毒性。 表积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸对一细胞增殖 的影响 军事医学科学院硕士学位论文 第二章 表积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸对一细胞的。。 值 细胞试验结果 如表和表所示,积雪草苷和羟基积雪草苷转化为苷元后对细胞 的生长抑制作用明显增强。 表积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸对细胞增殖的 影响 表积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸对细胞的。。 值 原代大鼠肝细胞试验结果 如表和表所示,积雪草苷和羟基积雪草苷转化为苷元后对大鼠肝细胞 的生长抑制作用明显增强。 表积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸对原代大鼠肝细胞 增殖的影响 军事医学科学院硕士学位论文第二章 一 表积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸对原代大鼠肝细胞 的。。值 .试验结果 如表所示,积雪草酸和羟基积雪草酸在/与原代肝细胞共同温孵 后值明显升高。 表积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸作用原代大鼠肝细 胞后测定值,? ,与对照组相比,. 小结 .积雪草酸和羟基积雪草酸分别为积雪草苷和羟基积雪草苷的苷元。在 细胞和细胞培养体系中,积雪草苷和羟基积雪草苷浓度在~ 之间时几乎没有细胞毒作用。而其苷元积雪草酸和羟基积雪草酸则具有明显 的细 胞毒作用:积雪草酸对一和细胞的岛值分别为.叫和., 羟基积雪草酸对和细胞的。。值分别为.叫和.叫。 相比较而言,积雪草酸的毒性大于羟基积雪草苷,对此现象一个可能的解释 是两者的油水分配系数的差异。由软件预测,在.附近积雪草酸和羟基积 雪草酸的妒值分别为.和.,脂溶性都较高。脂溶性高的化合物,容 易进入细胞的脂质双层膜并蓄积于细胞中,因此更高的积雪草酸更易进入 细胞、更难被细胞排出,对细胞的毒性作用会更强。积雪草酸和羟基积雪草 酸对 细胞的毒性高于一细胞,一个可能的原因是细胞的一糖蛋白 含量高于细胞,一糖蛋白能将一部分进入细胞的化合物排出,从而减少了 军事医学科学院硕士学位论文第二章 .. 化学异物对细胞的伤害。 .对于原代大鼠肝细胞,加药浓度在~ /之间时,积雪草苷和羟 基积雪草苷几乎没有细胞毒作用,而其苷元积雪草酸和羟基积雪草酸则具有明显 的细胞毒作用:积雪草酸对原代大鼠肝细胞的。值为. /,羟基积雪 草酸对原代大鼠肝细胞的。值为../。由检测进一步证明高浓度的 积雪草酸和羟基积雪草酸可对肝实质细胞造成损伤。 军事医学科学院硕士学位论文第三章 第三章积雪草昔及其类似物的吸收特性研究 第一节运用在体单向灌流模型研究大鼠肠道对积雪草苷和积雪草酸的吸收 .实验目的 体外和动物药效学试验发现,积雪草苷口服有一定的药理活性,但是初步药 代动力学研究发现,积雪草苷口服生物利用度很低。本研究根据大鼠小肠的生理 状况与人相似的特点,采用大鼠在体单向灌流模型,考察积雪草苷及其苷元积雪 草酸的肠吸收情况,对积雪草苷的最佳吸收部位和吸收机制进行探讨,并欲阐明 吸收步骤是否为生物利用度低的原因。 .理论基础 如图所示,;为灌流药液进入肠道各段时的流速,为进入时的药物浓度, 为灌流液中标识物的初始浓度,。、。、。分别为灌流液流出肠道时的流 速、药物浓度和标识物浓度。肠道在吸收药物的过程中,也会吸收水分。, 或排出水份。,导致灌流药液体积变化,因此不能通过直接测定流出灌 流液的药物浓度计算剩余药量。通常在灌流液中加入不被肠道吸收的大分子 化 合物,如.、酚红【等,利用其浓度的变化可确定不同时刻灌流液的 体积,从而得到不同时刻的剩余药量。根据 等人【】的推导结果,最终 药物的渗透系数可由式表述: “’ :里粤坠鱼按 。八/。 肠道吸收水分的量可由式表述: 五 旷;陲一? 式中为肠段的长度,为周长,肠道半径取.。酚红的回收率。。。 可用公式计算: 。。。萨?呲/? 式中?眦和分别表示稳态时灌流液离开和进入肠腔酚红的累计量。 军事医学科学院硕士学位论文一 第三章 一般地,当药物在小肠的有效渗透系数。. /时可归为吸收较差 庐. 。/时为高度吸收‘。 而 “ 》 ‰ 图单向灌流示意图 .实验仪器与材料 药品试剂积雪草苷%,积雪草酸,%,盐酸普耐洛 尔,/%,盐酸维拉帕米,?%, ,苯酚红北京化工厂,雄性大鼠~军 事医学科学院实验动物中心,缓冲液每含 ., ., ., ., .,葡萄糖.本实验室配制 主要仪器 高效液相色谱仪, 检测器, 色谱工作站, 一紫外可见光监测器,色谱柱/ 岫 ., 岫. , 岫. ,超纯水系统,恒温水浴.卜电热 式,北京长风仪器仪表公司,恒流泵?,上海市沪西仪器 厂 .实验方法 . 在体灌流影响因素考察实验 军事医学科学院硕士学位论文第三章 ..测定仪器管路对积雪草苷和积雪草酸的结合量 取/的积雪草苷和./积雪草酸溶液各通过实验用管路回 流、,每时间点取,进样,测定峰面积。以时点作对照, 计算药物消失量。 ..测定积雪草苷和积雪草酸在空白肠灌流液中的稳定性 取一定量?缓冲液,按照大鼠肠灌流方法灌流得空白肠灌流 液,加入苯酚红和积雪草苷或积雪草酸使积雪草苷浓度为/、积雪草酸 浓度为/。过滤后取样 ,分别测定和的药物峰面积。以时点 作对照,计算药物消失量。 ..测定积雪草苷和积雪草酸在各肠段匀浆中的稳定性 生理盐水冲洗大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠各段,分别刮取肠壁内侧黏 膜,以缓冲液制备成%的匀浆。、离心,取上清 液,加入 灿的积雪草苷或 ?积雪草酸溶液,?温孵、。 过滤后取样 入测定峰面积。以时点作对照,计算药物消失量。积 雪草酸只测定在结肠段的稳定性。 .肠灌流液中酚红浓度的测定 配制/的酚红溶液,分别取、、、、加入 溶液,以液稀释至,得浓度为.、.、、、、./,于 波长处测定吸光度,制作标准曲线。在体灌流后所得溶液,以.微 孔滤膜过滤后,取加入 溶液,以液稀释至,测定结 果代入标准曲线测定浓度。 .肠灌流液中药物浓度的测定 以液配制积雪草苷药液、、、、、./,其中酚红 浓度均为/。取进样,制作标准曲线。在体灌流后所得溶液, 取以..微孔滤膜过滤后,取进,测定结果代入标准曲线测 定浓度。检测方法如下: 色谱柱:岫×. 流速: ./ 流动相:水 军事医学科学院硕士学位论文第三章 流动相:.%乙腈溶液,梯度分离 梯度条件:号曲线 水~ %一%,~ %一%,~ % 进样体积: 样品浓度:~/ 温度: 检测: 以?液配制积雪草酸药液、、、、、“咖,其中酚红浓度 均为斗/。取进样,制作标准曲线。在体灌流后所得溶液,取 以.微孔滤膜过滤后,取山进行检测,结果代入标准曲线测定浓 度。检测方法如下: 色谱柱: 蛐.× 流速: ./ 流动相:.%水溶液 流动相:.%乙腈溶液,等度分离 等度条件:流动相:流动相: 进样体积: 样品浓度:~/ 温度: 检测: 以液配制普耐洛尔药液.、、、、、蚓,其中酚红浓度均 为/。取.进样,制作标准曲线。在体灌流后所得溶液,取 以.微孔滤膜过滤后,取山进,测定结果代入标准曲线测定浓度。 检测方法如下: 色谱柱:/啪×. 流速: ./ 流动相:甲醇:水:. :: 进样体积: 军事医学科学院硕士学位论文第三章 样品浓度:.~ 温度: 检测: .大鼠各肠段单向灌流实验 选择体重约的大鼠,禁食过夜,麻醉后置于加热平板或手术灯下 维持体温。延腹中线切开腹部,取出长约待测定肠段。各肠段区间为:十 二指肠段自幽门处开始,空肠段离幽门开始,回肠段距离盲肠上行处 生理盐水冲 开始,结肠段从盲肠后段开始。肠段两端插管,扎紧,用 净肠内容物。将插管接上恒流泵,灌入恒温?.?的药液后开始计 时。灌流速度为./,持续,于、、、分钟开始收集药 液,收集容器置于冰块之上。对灌流前的药液和各时间段收集的药液中药物 浓度 和标识物浓度进行检测,利用式求得校正实验过程中药液水分的变化,选 择达到稳态的时间点,各数值代入式求算有效渗透系数即可。在机制研究 中需同时加入一糖蛋白抑制剂盐酸维拉帕米,浓度为.。 .实验结果 .在体灌流影响因素考察实验结果 ..仪器管路对积雪草苷和积雪草酸的结合量 如表所示,管路对药物的结合可以忽略。 表一仪器管路对积雪草苷和积雪草酸的结合 ..积雪草苷和积雪草酸在空白肠灌流液中的稳定性 如表所示,积雪草苷和积雪草酸在灌流液中保持稳定。 表积雪草苷和积雪草酸在空白肠灌流液中的稳定性 军事医学科学院硕士学位论文? 第三章 .积雪草苷和积雪草馥在各肠段匀浆中的稳定性 如表所示,积雪草酸和积雪草苷在各肠段匀浆液中保持稳定,说明药物 在通过肠道的过程中几乎无非特异性结合,肠壁细胞所含对药物无作用。 表积雪草苷和积雪草酸在各肠段匀浆中的稳定性 .灌流液中酚红浓度的测定 苯酚红在.~/范围内线性关系良好。回归方程为: .。平均加样回收率为.%。 .. .肠灌流液中药物浓度的测定 积雪草苷在~/范围内线性关系良好,回归方程为: . .。积雪草酸在~“/?范围内线性关系良好, 回归方程为: .。普耐洛尔在.~洲范围内线性关 .。 系良好,回归方程为: 大鼠各肠段单向灌流实验结果 各化合物只,,值统计 积雪草苷在十二指肠、空肠、回肠和结肠的有效渗透系数只。,积雪草 酸在结肠的只。,普耐洛尔在空肠的只。如表所示。 表积雪草苷、积雪草酸和普耐洛尔在各肠段的。,,值 机制研究 维拉帕米为一糖蛋白抑制剂,可阻止小肠上皮细胞对外源化学异物的外排作 军事医学科学院硕士学位论文第三章 用。使用含盐酸维拉帕米的积雪草苷灌流液对大鼠空肠进行灌流,在灌流 浓度为./时,只,,..ד/;在灌流浓度为./时 ,,.?.× /。 第二节利用岫呸细胞模型对积雪草苷及其类似物的体外吸收特性的研究 .实验目的 建立并验证单层细胞模型,测定积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸、 羟基积雪草酸的表观系数,预测此四种化合物在肠道的透过性。 .理论基础 ? 细胞系是一种小犬’肾细胞,其特点是细 胞融汇后表达分化的上皮细胞特性。由于肾吸收和肠吸收的相似性,单 层可以作为研究药物吸收的模型。模型的实验结果和一细胞模型相 关性较好,因此可替代一模型。模型与一相比,其突出的优点 就是细胞培养时间可缩短至,模型建立以及药物转运实验方法均可参考上 述.细胞模型。与一细胞模型相比,药物在细胞模型上的渗 透过膜能力更强,这可能与其细胞单层的微绒毛更密集粗壮,因而有更大渗 透面 积有关。 在细胞模型中,药物的转运过程为:药物分子从单细胞层的顶侧肠 腔俱侧跨过单细胞层或经由细胞间隙到达基底仞侧,然后从细胞中排 出。在细胞模型上,药物的跨膜通透性主要是通过表观渗透系数即户如 / ,/来评价。只。。求算式为/×/ /。, /为药物转运至接收池的速率,为接收池的体积,为单层细胞面积,。 为顶端小池加入药物的初始浓度。 用细胞系对药物吸收特性研究的方法如图所示,采用培养 板或插入式培养皿,其内含有两个小池,上层小池的底部有一层多孔渗 水的半透膜,细胞培养在半透膜上生长成单层汇合细胞。实验前,需确定 单细胞层的完整性,可通过测定跨细胞层电阻 口猿来衡量。实验时,将待测化合物加入上面的小池内,然后定时检测下面 小池内的药物浓度,计算得出表观渗透系数。由于细胞与细胞有相似 的膜屏障特性,并经实验证实两者‰的相关性较好,故参考透过性衡 军事医学科学院硕士学位论文第三章 量口服药物吸收程度的指标:小于ד/时,相当于人服药物吸收不良 %~%:~×’/时,相当于口服药物吸收中等%~%; 大于 。/时,相当于口服药物吸收良好%~%。 化 图药物经细胞单层渗透实验 .材料与试剂 药品试剂积雪草苷%,羟基积雪草苷%,积雪草酸, %,羟基积雪草酸%,盐酸普耐洛尔,?%, 胰蛋白酶.%,’平衡盐缓冲液 细胞系 中国医学科学院基础医学细胞中心 主要仪器跨膜电阻仪几.,几口, 高效 液相色谱仪, 检测器, .. ,超纯水系统,细胞培养插件?, ., .实验方法 . 细胞模型的建立 细胞适宜在,含%的环境中培养,采用高糖培养 基。培养基中含%胎牛血清、%谷氨酰胺和青霉素、链霉素双抗液。在 细胞培养瓶中培养,至约%融汇时用胰酶.%液在?条 件下消化。接种时细胞投放量为. /,细胞接种前多聚碳纤维膜 用稀释后的鼠尾胶原胶原:%乙醇:涂布?/细胞接种于置 于孔板、膜表面积为.的插件。 军事医学科学院硕士学位论文第三章 一 . 呸细胞模型的验证 测定值如图所示。细胞接种后~每日测定,同时测定同样培养 条件下聚碳酸酯膜的空白值,计算值时需扣除空白值。 图跨膜电阻仪及其使用 .测定:合物的渗透系数 ..各化合物标准曲线制备 积雪草苷和羟基积雪草苷:分别精密称取积雪草苷和羟基积雪草苷.、 溶解,将两溶液混合,以’液稀释至配得 .,各以 的混合工作液。将工作液以’液稀释成、、、、、、 .的标准曲线工作液。考察线性关系,求得各物质标准曲线方程。检 测方法如下: 色谱柱: .× ./ 流速: 流动相:水 流动相:.%乙腈溶液,梯度分离 梯度条件:号曲线 水~ %一%,~ %一%,~ % 军事医学科学院硕士学位论文一 第三章 进样体积: 样品浓度:.~ ? 温度: 检测: 积雪草酸和羟基积雪草酸:分别精密称取积雪草酸和羟基积雪草酸.、 溶解,将两溶液混合,以’液稀释至配得 .,各以 的混合工作液,使浓度为.%。将工作液以’液稀释成、 、、、、、.的标准曲线工作液。考察线性关系,求得各物质标准 曲线方程。检测方法如下: 色谱柱: .× ./ 流速: 流动相:.%水溶液 流动相:.%乙腈溶液,梯度分离 梯度条件:号曲线 % 水~ %%,~ %,~ %,~ % 进样体积: 样品浓度:.~ ? 温度: 检测: 溶解,以’液稀 普耐洛尔:精密称取普耐洛尔.以 释至配得的贮备液。取液以’液稀释至配得 的普耐洛尔工作液。考察线性关系,求得各物质标准曲线方程。 检测方法如下: 色谱柱: ..× 流速: . 流动相:甲醇 流动相: ,等度分离 等度条件:流动相:流动相: 军事医学科学院硕士学位论文.. 第三章 进样体积:. 样品浓度:.~. 温度: 检测: .各化合物通透系数的测定 ’ 细胞单层大于:时可用于实验叫。实验前,用 液清洗电极表面遍,在侧加入. ’液或混合工作液,在侧加入 混合工作液或或’液.,每个混合液用孔插件,其中孔用 于测定?方向只。,另孔用于测定?方向只。,。在加入药液后的、 、、、、分别从侧或侧取.样品,并立即补充相同 体积的’液。 .实验结果 .皿呸细胞模塑的验证 结果见表和图,当培养至时值稳定于?以上,可用 于实验。 表 细胞单层的变化天数 ? ? ? ? ? ? ? 军事医学科学院硕士学位论文第三章 ? ? 避备兽 ? 时间 图细胞单层的值变化 .各化合物标准曲线制各结果 积雪草苷在.~范围内线性关系良好,回归方程为: .. .。羟基积雪草苷在.~范围内线性关系良 好,回归方程为:. .。积雪草酸在.~埘范围内 线性关系良好,回归方程为: .。羟基积雪草酸在.~ .。普耐洛 范围内线性关系良好,回归方程为:. 尔在.~范围内线性关系良好,回归方程为:一. .。 各化合物通透系数的测定结果 积雪草苷转运实验 表所示为积雪草苷在个重复孔、两个方向转运的只。,值。 表积雪草苷透过单层细胞的只。值 军事医学科学院硕士学位论文第三章 羟基积雪草苷转运实验 表所示为羟基积雪草苷在个重复孔、两个方向转运的昂。值。 表羟基积雪草苷透过单层细胞的只。。值 积雪草酸转运实验 表所示为积雪草酸在个重复孔、两个方向转运的只,值。 表积雪草酸透过单层细胞的只。,值 羟基积雪草酸转运实验 表所示为羟基积雪草酸在个重复孔、两个方向转运的只,。值。 表羟基积雪草酸透过单层细胞的心。值 普耐洛尔转运实验 表所示为普耐洛尔在个重复孔、两个方向转运的忍。值。 军事医学科学院硕士学位论文第三章 表普耐洛尔透过单层细胞的。值 计算结果 各化合物的通透系数和转运率如表所示。 表各化合物透过细胞单层的只。,值和转运率 .?. .. .. .?. 积雪草苷 .. .. .. .. 羟基积雪草苷 .?. .. .. .. 积雪草酸 .. .. .?. .. 羟基积雪草酸 .. .. .. .. 普耐洛尔 小结 .在单向灌流实验中,积雪草苷和积雪草酸在肠匀浆中内保持稳定,且 仪器管路、灌流液均不影响其稳定性。化合物在各肠段的有效渗透系数如图所 示,数值在下方虚线之下表示吸收较差,在上方虚线之上表示高度吸收。由图可 见,普耐洛尔作为高度吸收的参考化合物,其在空肠皤远高于其它化合物,也 高于文献记载的酐值..×。/而积雪草苷属于吸收较 差的化合物,在十二指肠和结肠吸收极差,在空肠和回肠段吸收略有提高,但改 善程度有限。在.糖蛋白抑制剂维拉帕米存在时,积雪草苷的吸收没有明显改善, 说明一糖蛋白可能不参与转运过程见图。积雪草酸的吸收值超过上方虚线, 说明积雪草苷在大肠部分转化为苷元后吸收应会显著增加。无论积雪草苷或积雪 草酸在高浓度或低浓度的醣值差异不大,提示转运应不存在载体饱和现象,以 被动转运为主。 军事医学科学院硕士学位论文第三章 受妻一粤.?烬 ??积写早甘旧一 ///勿普耐洛尔洲 //勿积雪草酸.一 ??图积雪草酸 妻 蓁 亳羹 ?弱?巧?侣?一舟 蓁??一舟陀一 翼羹 空肠 回肠 结肠 十二指肠 图不同浓度化合物在大鼠各肠段的有效渗透系数砸 蛊 \× 七 世 图维拉帕米对积雪草苷在空肠的有效渗透系数缸的影响 军事医学科学院硕士学位论文一 第三章 .在跨细胞单层的转运实验中,各化合物的表观渗透系数如图 所示。高渗透参考化合物普耐洛尔对单层细胞的值与文献值接近 .×。/ 积雪草苷和羟基积雪草苷的值较低,而其苷元的 值显著提高。积雪草酸在在体灌流实验显示为高度吸收,而在细胞模型为中 等吸 收,原因可能为积雪草酸的脂溶性较大,影响了其从细胞转运出的速度。 图各化合物透过细胞单层的表观渗透系数只。。 .本部分实验采用单向在体灌流和细胞模型的方法对积雪草苷及其 类似化合物的吸收特性作综合评价。采用在体灌流的方法,检测化合物经过肠道 后量的变化;采用细胞模型,检测化合物在细胞单层另一端的出现的量。两种方 法互为补充,力求能更准确地解释化合物的吸收特性。在跨细胞膜实验中,由于 采用了梯度洗脱技术,可以在一次进样中检测多个化合物,故采用了盒式给药 的方法,即积雪草苷和羟基积雪草苷同时给药,积雪草酸