显微注射法建立转bcl 产品

显微注射法建立转bcl 产品 经典 博硕论文 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 显微注射法建立转bcl-xlt1gt基因小鼠的研究 姓名:肖文伍 学位级别:硕士 专业:神经病学 指导教师:张苏明 2001.5.1 文 论 硕 博经典论文 博硕论文 硕士论文 中文摘要 显微注射法建立转,; ，,,(基因小鼠的研究 研究生:肖文伍 指导老师:张苏明教授 中文摘要 目的(建立转,;,—,,基因小鼠，继而传代建系，用于鲤鱼。堡脑血管疾病的研 究。 方法:采用显微注射法，将人,;,—,(基因注入昆明小白鼠受精卵获得子代鼠， 然后用,,,及,,,,,,,,(,,,,检测以获得阳性鼠。 结果,注射受精卵,,,,枚，移植卵数,,,,枚，受体鼠,,只，怀孕鼠, 文 论 只，子代鼠, ,只，整合数,只，植入受精卵的存活率,,,，受精卵的 硕 博 总存活率,(,,,，移植鼠的怀孕率,(,,，整合效率,,(,,，总有效率 为,(,,,。 结论:获得了转,;,(,,基因小鼠，但转基因的效率较低，要获得稳定的转,;,( ,，基因小鼠品系尚需解决许多困难。 关键词:转基因小鼠 ,;,(,。基因 显微注射经典论文 博硕论文 堡垒篁兰 ,, ,,,,,,,———————————————————』篓 ,,,,, ,,, 猓悖臁 ?,,,,,,,,,; ,,;, ,, ,,;,,,,,,;,,,, ;,,,,,,,, ,, ,,,,,,:,，,, ,,,,, ,,,,, :,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,;, ,,,,;,,,,:，, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,;, ,,,,,;, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,; ,,,,, ,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,;,,,,; ;,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,( ,,,,,,:,;,—,, ,,,, ,,, ,,,,,,,;,, ,,,, ,,;, ,, ,,;,,,,,,;,,,,(,,, ,,,,,,;, ,,,;,—,, ,,, ;,,,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,,,,,,,—,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,( ,,,,,,,:，, ,,, ,,,,,,,,,,,，,;,—,, ,,,, ,,, ,,,,;,,, ,,,, ,,,,,;,,,, ,, ,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,;,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,，, ,, ,,,;, ,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,, , , ,,,,,,,,,,(,,,,, ,,, ,,,,,,，, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,、,,,, ,,, ,;,—,, ,,,,(,,,,,,,，,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,(,,,)，,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,(,,,,,)，,,;,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,;, ,,,,(,(,,)，,,,,,,,,,,, ,,,,(,,(,,)，,,,,, ,,,,;,,,;, (,(,,,),,,, ,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,( ,,,;,,,,,,:,;,—,, ,,,,,,,,,; ,,;, ,,,, ,,,,,,,,，, ,, ,,,,,,，,,, ,,, 文 论 ,,,,,,,,,; ,,,,;,,,;, ,,, ,,,, ,,,(,,,,, ,,, ,,,,, , ,,, ,, ,,,,,;,,,,,, ,, 硕 博 ,;？,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,; ,,;, ,,,,,,,,( „ 〔,,, ,,,, , , ,,,,,,,,,; ,,,,, ,;,—,】,,,, ,,;,,,,,,;,,,, ,经典论文 博硕论文 硕士论文 论文正文 刚 蟊 随着对缺血性脑损害研究的深入，人们逐渐认识到脑缺血性损害后在 脑中心坏死区与健康正常脑组织间存在一个称之为缺血半暗带的区域。此 区域内细胞坏死，细胞凋亡，细胞,,,损伤相对集中的区域由中心向外周 分布开来，各区之间没有十分明确的分界…。 ,;,(,是一个与凋亡有着密切关系的大的基因家族，,;,(,(是其中的成员 之一，许多研究证明,;,—,(有抗凋亡的作用。此项研究的目的是考察过达 ,;,—,。基因在缺血性脑损伤后所发挥的作用，探索,;,—,(基因与,,,损伤及 细胞凋亡的内在关系，从而寻求在分子水平可能的脑保护措施。 自本世纪,,年代发展起来的转基因技术使得单个特定的基因能整合进 研究对象的基因组，从而能在生物个体水平来观察某一基因的生理、病理 作用，这是以前在细胞水平研究基因转染、转化及表达所不可能达到的， 也是真正从整体上、活体的、系统的来观察基因的行为，因而大大拓宽了 生物领域的研究范围。目前，转基因动物的研究内容非常广泛，从基础理 文 论到应用技术，从实验室到社会化生产均有了很大的发展。转基因的方法 论 硕 主要有”，:显微注射法、逆转录病毒载体法、胚胎干细胞介导法、电脉冲介 博 导法、磷酸钙介导法、精子载体法等。由于显微注射法相对较成熟，并被 大家广泛接受，因而最常被采用。我们这项研究采用的即是显微注射法。经典论文 博硕论文 硕士论文 论文正文 材料 ,(目的基因:目的基因,;,— ,。全长,,,,,(测序结果)， ,;,喝基因插在质粒表达载体 ,,,,(,,,〔,，的多克隆位点内，酶 切位点为,;,,，。质粒线性化的 位点为,,,,，位于,,,,—,,, 的上游。见(,,,(,, ,(材料:昆明小白鼠(购于 省医学科学院动物房)、孕马 血清促性腺激素(,,,,,,,, ,,,,。, ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,逗, ,,,,,,,(,,,,(,,,，,;,—,,) ,,,,)、人绒毛膜促性腺激素 文 (,,,,, ;,,,,,; ,,,,,,,,,,,, ,,,)、储备液、,,及,,,培养液(见附表 论 ,、,、,)、透明质酸酶(,,,,,,。,,,,,,)或玻璃酸酶、石蜡油(,,,,,,, ,,,)、毛细玻璃管、培迪氏培养皿、表面皿、多孔板、浅凹载玻片、小弯 硕 博 镊、眼科剪、钟表镊、持针器、止血钳、小圆针、倒置显微镜、显微注射 器、显微操作器、,，,系统、熔断仪、拉针仪、解剖显微镜等。 ,(基因检测 ?基因组,,,提取所需试剂:,,,,(,,, ,,、,,;, ,(,,、,,,, ,(，,、,,,,,,,, ,(,, ,，,,值,(,)、,,,,,,,,,, ,、酚、氯仿、异 戊醇、无水乙醇等。 ?,,,反应所需试剂:缓冲液、,,,,。、,,,,、,,？,,,酶、上游引物 (引物，)为:, ,一,,,,,,,;,,,;;,,,;;;,,,一, ,(目的基因,,—,,,)、 下游引物(引物，，)为:, ,一;,,,,,,,,;,,,,,;,,,,,,一,?(目的基因 ,,,—,,,)等。经典论文 博硕论文 硕士论文 论文正文 ?,,(,,,—,,,,试剂: ,,,、尼龙膜、预杂交液、洗液，、，，、漂 洗缓冲液、检测缓冲液、封阻液、显色液探针(自己制备)、,，, ,,,。 方法 ,(目的基因的制备:将,;,—,(基因质粒表达载体电转化大肠杆菌感受态 (,,。。)、涂板、挑菌、摇菌，用溶液，、，，、，，，及酚、氯仿、异戊醇抽 提质粒，并行,;,, ，酶切鉴定〔反 应体系:,,,,反应体积，,,,质粒， ,“,酶(,;,, ， ,,,,,“)，,“,缓冲液，,,,水〕。用,,, ，酶切质粒得线 性化片段〔,,,,反应体积，,,,质粒，,,, ,,, ，(,,“)，,?,缓冲液， ,,,水〕。经透析袋法回收、纯化此片段即为注射的基因。此片段大小约 ,(,,,，溶解缓冲液为,,,,咖,,,, ,,,,—,;,(,,值,(,—,(,)，,，卜 ,(,,,?,,,, ,,,,，目的片段稀释至约,,,,,,,，然后每,,,分装以备用。 ,(转基因程序,, 转基因总的操作程序如下图: 文 超排处理的雌鼠,种鼠 正常雌鼠 论 硕 , 博 采集受精卵 ×结扎公鼠 士 移植 受精卵的显微注射 ————————?假孕母鼠 上 产生子代 上鉴定 转基因鼠经典论文 博硕论文 硕士论文 论文正文 具体步骤分述如下: (,)雄鼠的结扎 结扎雄鼠的目的是为了使受体母鼠与之合笼后，其子宫处于假孕状 态，利于注射后的受精卵着床，在开始转基因实验前,个月左右作结扎雄 鼠，详细操作如下: ?从小鼠尾静脉注射,(,,,戊巴比妥钠,(,,—,(,,,，小鼠在,,秒之内 被麻醉。 ?将麻醉鼠仰面置于手术托盘中，减去腹部被毛，去毛处以碘酒、,,, 酒精消毒。 ?在小鼠的下腹部沿腹中线处做一切口，长约,;,。 ?左手镊夹住切口的肌肉层，右手镊伸入腹腔，沿腹璧向下夹住白色 脂肪垫向上拉出切口，睾丸、输精管等也随着被提出腹腔。 ?在睾丸上连有一白色、质硬的细管即为输精管，用眼科镊分离输精 管周围的结缔组织，然后用烧红的镊子夹断输精管，即完成一侧输 精管的结扎。 操作，结扎另一侧输精管。 结扎后，将睾丸、输精管等小心放回腹腔，重复此步 文 论 硕 ?在切口处放入少量的青、链酶素粉剂，缝合切口，再分别用碘酒、 博 ,,,酒精消毒伤口，将小鼠置于洁净、温暖的地方，待其苏醒。一个 月后将其与正常母鼠交配，不致母鼠怀孕者为可用于实验的结扎雄 鼠。 (,)供体鼠的制备及受精卵的采集，显微注射。 一般在第一天的下午,:,,一,:,,之间选取,只适宜小母鼠，尾静 脉注射,,,, ，,，,—,,,,，,,—,,,后，也就是第三天的下午,:,,,,:,,再 静脉注射,,, ,,，,一,,,,，然后将之与种鼠合笼，第四天早晨检查母鼠，有 精栓者即为供体鼠，无精栓者即淘汰。中午,,:,,—,,:,,用,，。作液滴， ,经典论文 博硕论文 硕士论文 论文正文 以备培养受精卵用。每个培迪氏培养皿中加入,,,个,:。液滴，每个液滴 ,,,,，其上覆盖石蜡油，置,,,培养箱中平衡(条件: ,,;,,、, ,, 。,)。当天下午,:,,颈椎脱臼处死供体鼠，腹部剪毛，酒精消毒后，迅 速取出输卵管置于,,,,, ,，培养液中，解剖镜下用眼科镊子撕开膨大的壶 腹部即看到包含受精卵的丘细胞(;,,,,,, ;,,,)团释放出来。将所有的 细胞团吸入多孔板上盛有,，培养液的孔洞中，加入卜,滴玻璃酸酶，见细 胞团基本松散，即将其移至另一盛有,，培养液的孔洞中，并反复吹吸，逐 渐清除颗粒细胞，依次转移到后面的孔洞并重复操作，直至受精卵单个独 立。然后将所有的受精卵移入平衡后的,。。液滴中，置培养箱中培养。选取 雌原核及雄原核清晰的受精卵，置于载玻片的浅凹一侧，每次,,枚左右， 同时将约,,,基因液体置于浅凹另一侧(注意不能让它们混在一起)，然 后覆以石蜡油。将载玻片放于倒置显微镜的载物台上，让注射针的针尖伸 入基因液体中，基因则借助虹吸作用进入针尖，然后用持卵管吸附住受精 卵，反复吹吸至雄原核位置适宜，调节雄原核与针尖至同一平面，迅速进 针，注入约,,,基因，迅速拔针，然后依次注射余下的受精卵，每 批受精 文 卵注射完后移入,,【，。液滴中继续培养。(见附图,、,) 论 硕 (,)受体鼠的准备 博 在准备供体鼠的同时，准备受体鼠。受体鼠与供体鼠一样都注射,,,, 和,,,，所不同的是，供体鼠与种鼠合笼，而受体鼠与结扎雄鼠合笼，第二 天早晨检察，有精栓者即为合格的受体鼠。实际操作中，我们每天注射, 只实验鼠，最后能获得卜,只受体鼠不等。 (,)受精卵的再植 我们采取的受精卵植入母体的方式为卜,细胞期胚胎的输卵管移植 (,,,,,;, ,,,,,,,)。其原理是:将卜细胞期或培养至,一细胞期的受精经典论文 博硕论文 硕士论文 论文正文 卵从假孕母体动物的伞部移入其壶腹部，受精卵可以在输卵管中边分裂边 向子宫移动，至子宫后着床，发育成个体。移植步骤: ?向受体鼠尾静脉注射,(,,,戊巴比妥钠,(,,,(,,,，,,秒内小鼠即被 麻醉。 ?捡取,，。液滴中尚正常存活的受精卵约,,一,,枚，于,，。中洗涤卜, 遍后，吸入移卵管中。 ?将麻醉后的小鼠俯卧或右侧卧在解剖显微镜下的载物台上，在最后 一根肋骨后的凹陷处去毛，,,,酒精消毒，距脊柱,;,作平行于脊柱 的横行切口，长约,(,;,，一手用镊子轻拉切口处，另一手用镊子从 切口伸入腹腔，沿腹壁将固着卵巢(,,,,,)的白色脂肪夹住提出， 即可看见卵巢，子宫和输卵管。 ?解剖镜下，将卵巢和输卵管置于适当的操作部位，在血管稀疏处用 钟表镊轻轻撕开卵巢和输卵管之间的囊膜，吸尽体液，充分暴露输 卵管伞端，左手钟表镊夹提脂肪垫或囊膜一侧，稍稍提起，将移卵 管插入伞端深约,(,;,，吹入受精卵，看到气泡进入壶腹部为移卵成 文 功。退出移卵管，将脂肪垫、输卵管、子宫重新送入腹腔，切口处 论 硕 放入少量青、链酶素粉剂，缝合切口，碘酒、酒精消毒。 博 ?将鼠标号，置于洁净的地方，待其苏醒，保证环境温度约,,。,。 (,)孕鼠的分娩及护理 在手术后,,—,,天，触摸受体鼠腹部，可分辨母鼠是否怀孕，捡出孕 鼠，单独饲养。一般在,,一,,天左右分娩。幼仔产出后，如果存活，即让 其与母鼠在一起，并密切观察，以防母鼠吃掉子鼠。如果子鼠死掉或部分 被吃掉，则尽快将组织保存于一,,。,下，以备检测。经典论文 博硕论文 ,(子代鼠的检测 (,)组织基因组,,,的提取 ?剪取鼠尾的尖端或冻存的死鼠的组织约,,,,，反复剪切，直至成沫 状。 ?每管加入,,,,, ,,,,，,,,, ,,,,,,,,,, ,(,,,,,,,)。 ?盖紧管盖，颠倒数次以混匀，瞬时离心后至摇床中，温度,,?，转 速,,一,,转,分。 ?消化至看不见组织块后，用等体积酚抽提,次，吸出上清后用等体 积氯仿,异戊醇抽提,次。在吸上清时，均剪掉,,,头尖端。 ?取最后一次的上清，加入,,,,体积,, ,,,;(,, ,(,)，,倍体积 的无水乙醇(一,,。,)使基因组,,,沉淀。 ?用枪头挑取絮状,,,放入已加好,,, ,,,酒精的离心管中，清洗 ,,,，离心，倒掉酒精后吸干液体，将,,,沉淀置,?冰箱中凉干。 ?每个组织,,,样以,,,, ,,溶解。 文 (,)聚合酶链式反应(,,,) 论 硕 ?将以前提取溶解的基因组,,,，每个样取,?,，,,,, ,,,稀释， 博 ,,, 取其中,,,作为。 ?引物是在目的基因片段测序后，通过与小鼠自身,;,—,,基因比较后 设计的。上游引物(引物，)为:, ,一,,,,,,,;,,,;;,,,;;;,,,一, ,(目 的基因,,—,,,);下游引物(引物，，)为:, ,一;,,,,,,,,;,,,,,;,,,,,,一 , ,(目的基因,,,—,,,) ?,,,反应的所有试剂 ,,,,,,缓冲液: , ,,,,,,，经典论文 博硕论文 硕士论文 论文正文 ,,， ,(,,,,,, ,,,,,,, ,(,,, ,,, ,,,,—,,, ,(,, ,,,， , , ,,,,,,, .