【doc】人alc型干扰素等位基因在部分中国人基因组中占有优势

【doc】人alc型干扰素等位基因在部分中国人基因组中占有优势 人alc型干扰素等位基因在部分中国人基因 组中占有优势 {t) 中华微生物学和免疫学杂志1993年第13卷第l期 人mc型干扰素等位基因 在部分中国人基因组中占有优势 黎黄侯 .,.-——,一一,^,,'.' 采用PCR方法了27名正常中国人基因组中型干扰素等位基因的分布,结果表明.迄今所报道的3种 IFN—d等位基因可以分为两类,两者在氮基酸水平上表现在第158位的差异.一类为"L"类(158Leu),它包括IFN --ala和IFN一b;另一类为V"~O58VaD,它包括lFN—lc,占所浏样品的5g.3,提示至少在部分中国正常人 基因组中.v'l类N—al等位基因占有优势.车文的工作为进一步研究IFN—a的家族性和开发应用IFN—a1c提 供了依据. 关键调:干扰索}等位基因}聚合酶链式反应cR檀酸杂交 早在八十年代中期,人们就已开始注意到 人IFN—的复杂的家族性.'人IFN一家族 相当庞大,家族成员之间的关系也很复杂.它除 了包括近20个亚型成员外,某些亚型中还存在 等位基因的变异.IFN—a的这一特点在IFN— a1和IFN一两种主要亚型中表现得尤为突 出.倒如,IFN一02包括IFN—o2a,IFN—o2b 和IFN--o2c三种等位基因产物.相似的情况亦 存在于IFN--al当中.Nagata等1980年从人 胎肝染色体基因文库中克隆了IFN—a】基 因.,而后Goeddel等又于198]年从经病毒诱 生的人髓母样细胞系(KG一1系)cDNA文库 中分离了IFN—aD基因,两者的桉苷酸和氨基 酸序列均只有一个位点差异.本研究组曾报 道从汉族人胎肝细胞DNA中分离并表达了 IFN--al/158V基因.,,后者在一级结构上与 IFN--al及IFN—aD相差一个或二个残基,因 而建议将迄今已发现的IFN—aD,IFN--al和 IFN一~d/lssv基因分别命名为IFN—ala, IFN--alb和IFN—alc基因.它们在人体基因 组中的分布情况尚不清楚.本文采用聚合酶链 式反应(PCR)和异羟基洋地黄毒甙标记的桉酸 杂交技术,对IFN--al等位基因进行了研究, 结果表明alc类型在IFN--al等位基因中占有 优势. 材料和方法 1.实验材料:(1)人血细胞:取自北京医科大学第 一 医院经肝素抗凝处理的健康人全血样品,共27份,按 0l一27编号.全部样品的血常规,生化指标正常,未发 现病原体. (2)化学试剂和酶类;限制性内切酶.异羟基洋地黄 毒甙DNA标记与检测试剂盒(DIGKIT)嗡自巷国 BoehringerMannheim公司,×dNTP,蛋白酶Kaq DNA聚合酶及其l0×反应缓冲演嗡自中国华美生物 工程公司. 2.正常^血绷瞄染色体DNA的摄取:从每份 0.5ml全血中,采用Tritonx,100,NP40裂解和蛋白 酶K水解法提取血细胞染色体DNA,最后重溶于去 离子灭菌水中,进行电诛检滑,并用美国Beckman公司 产DU--70型分光光度计定量. 1.寡棱苷酸的合成与纯化:采用固相亚磷酰胺法 在美国ABI公司产381A塑DNA合成仅上合成三段寡 核苷酸,随后在瑞典Pharmacia公司产快建演相层析仪 (FPLC)上用MonoQ阴离子交换柱进行纯化. 1.PCR?作PCR系统中舍:血细胞染色体DNA (模板DNA)g,上下游引物各50pmol/L,4XdNTP (各100nmo1),10×反应缓冲液1,TaqDNA聚合酶 本课题得到国家863生物技术额域发展计划资助 l_中国蔼防医学科学院病毒学研究所府毒基因工程国家 重点实验室北京?现在地址卫生部科技司北京 2一北京医抖大学第一医院内抖 中华微生物学和免挺学采志1993年第l3卷第1期 2.5U,井加击离子灭菌水至反应总体积501.循环周 期:首次变性条件100C5分钟,以后均为53?退火3O 秒,72?延伸50秒,93"C变性30秒,进行25十循环的 扩增反应.PCR在美国Eri~omp公司产自动温度循环 仪中进行. ;.DNA探针标记,杂交殛检测:采用随机引物法在 大眄扦菌DNA聚合酶1(Klcnow)片段催化下合成带 DIG标记的双链DNA探针;标记反应的试剂和标记方 法由标记试剂盒提供打点杂交按文献[7]进行.双链 DNA探针的杂交温度为68C,洗膜在0.1×SSC溶液 中于68"C进行两次,每次15分钟. I.基因?作的其他技术与方法:质粒DNA的提 取,DNA琼脂糖凝腔电泳,限制性内切酶消化及基因克 隆等照文献[7]进行. 实验结果 1.模板DNA及寡接苷酸:提取人血细胞 染色体DNA后进行0.5琼脂糖凝胶电泳,显 示大于50kb的均一条带,以此为PCR模板. PCR上游引物序列位于IFN—nl基因编 码区5'端.PCR下游引物为寡核苷酸A和C 两段,它们的3,端第一个核苷酸分别与[FN— da/1FN—alb基因或1FN—cdc基因第54l位 核苷酸互补,分别为A和C(图I). 2.PCR扩增产物电泳与杂交鉴定;PCR实 验共包括58个反应(见附表),反应后各取20pl 进行电泳检测,结果见附表和66页图2.在上 游引物参与下,由下游引物A扩增出 0.5kbDNA条带的样品包括阳性对照1FN— ala基因和l0个染色体DNA样品;由引物C 扩增出0.5kbDNA条带的样品包括阳性对照 1FN--alc基因和I6个染色体DNA样品. 以克隆的IFN--ala基因的PvuI/DdeI 片段为探针(不包括引物序列.),对所有PCR 扩增反应(3pJ)进行非同位素杂交检测,结果证 明扩增产物均呈阳性(如67页图3所示). UpstrcamprimerOligonudeolideA CT00CCT0T0ATCTCCCTGAGACCAACGTTCTTTCT 6482541552 IFN一~la/1FN—alb:cT000cTGT0ATcTcccTGAGAcc...…TTGcAAGAAA0A IFN一?lc(158v):CTGGGCTGTGATCTCCCT0A0ACC......GTGCAAGAAA0A CACGTTCTTTCT or嵋onucteotkleC 圈l寡棱昔酸序列殛其在攘扳上的对应序列. Fl?s叫n0esofd上i|onIIcIcot哪andtheir~orr~pondinssequencesonthetemplate 附袁PCR和打点杂交法捡潮人染色俸DNA中mN一尊位基因实验结果 TablePCRdetectionanddothybridization~lalysisofhumane~romosomatIFN—dlalleles SamplePCRAPCRCDIGADIGCSamplet~3RAt~3RCD1GAD1GC 0l一+一+16+'一+一 02——上——-1-17+一-I-一一 03-1-——上—-一l8+一+一 04一-1-一-1-I9+一一一 05——上一——2O+一+一 06+一+一2l一+一+ 07-1-——-1-——22一上一一 08一+一+23一+一+ 09-1-——-1-——24+一+一 10————--25一+一+ I1一-1-一-1-26——-1-一-L I2一+一一27一-1-一+ 13一+一+1a+一X× l?一+一+lc一+×× l5一一一一 1.ALLabbrebialionsusedhavethes?meaninglolb?einFig1103 2.-1-:口.snivehybridization,一:negativehybtglization,×:undone 讨论 在本研究中,作者设计了两段寡核苷酸,两 者3r端第一个核苷酸分别与IFN—nla/N— alb或IFN—czle基因第541位核苷酸互补,而 其余序列完全相同,故可借此检出人染色体 D/qA中IFN--(tl基因座位上该位点的变异情 况,引物A的扩增产物可代表IF/q一(tla或 IF/q—czlb类型,而引物C的扩增产物可代表 IF/qm(tl~类型.附表显示,在被检的27份血细 胞染色体D/qA中,有l0份含IF/qm(tla或IFN 一 (tlb基因,占37;有16份含IFN—ale基 因,占59.3.另外,有一个样品(编号15)尚不 能确定其等位基因形态,因为在本文的所有检 测项目中它都呈现阴性反应.对此至少有两种 解释,一是实验系统本身的不足,如样品D/qA 纯度不够等等{二是该样品中IFN--(tl基因第 541位为除T,G外的另一种核苷酸.关于这一 情况,尚有待进一步的实验加以辨别.总的结果 . 表明,迄今所报道的3种IF/q—等位基因中 可以分为两类,在氨基酸水平上表现在第158 位的差异,一类为L"类(158Leu),它包括IF/q -- c~la和IF/q—Mb}另一类为.v"类(15Brad, 它包括IFN—Me.同时,至少在部分中国正常 人基因组中.v类IF/q一(tl等位基因占有优 势.至于这是否取决于种族差异则有待进一步 研究. 在PCR实验中,由于变异位置对应于引物 的3I末端,引物与模板在该位置上的错配将阻 断PCR扩增反应,因此可利用这两段引物 分辨第541位上的T或G.事实上,在全部反应 中无一出现同时被引物A和引物c扩增的情 况,表明这一实验策略是成功的.同时,本文又 采用切除了引物序列的IF/q--(tl基因片段为 探针验证了PCR的特异性.应当指出,用于打 点杂交的样品仅含80rig染色体D/qA,在DIG 杂交法的敏感度下不可能检测出染色体D/qA 的IF/q—a基因.如67页图3所示,染色体对照 和 实验显示阴性反应,表明PCR扩增产物的确是 a基因. IFN— 可以肯定,IFN—a基因和蛋白家族的复杂 性是IFN长期进化演变的结果.对于不同亚型 的IF/q—a,已有实验证明它们的生理功能确有 差异;同一IFN亚型中不同的IFN—a变种在 生理功能,药理作用和遗传关系等方面的差别 亦是值得注意的问题.例如,三种IFN一 两两间仅相差l一2个残基,但有人发现IFN— e2a在体内诱导产生抗体的倾向性高于IFN一 b,因而对临床上后者的使用提出质疑等等. IF/q--(tl是另一主要的IF/q亚型,关于其等位 基因的比较研究国内外尚未见报道,因此,本文 的工作为进一步研究IF/q—a的家族性和开发 应用IF/qm(tle提供了依据. 参考文献 l1toK?etal-Struet~alrela~nsh啦0fhmnnintcdef onthagene~皿dpseudqI船eB-JMoJlliol-1985,185} 挖7. 2-NagataS,科aloThestl"ll~llrcof叫??of姆litofmofcd? tinct~hrm~malgeII嚣forh?iI.t盯fer口?sen~s- N丑t1980.287;401. 3.Goddnv,na1.Tllelitruclturl~ofehtdtiI.ndo?酣 hum衄I巴咄c如teffef呻elias.N~ure,1981,290; 2O. 4.蔡孟帆,等.一种a1塑干扰蠹基因新变种的发现和鉴定, 中国科学B辑,1991.'4);397. 5.蔡孟,等.一种a1型干扰素基因新变种的发现,鉴定 表达厦表达产物的纯化.自然科学进晨,1g92,2;175. 6.IttpehiR?Prep蠢哪i曲蛐p蛔南rPCR.h:PCRTech一 ?d-qE,.Ed?EtltchH.StocktonPe强_1989,936. sambf?tJ,n丑l?Molecul~clon_mB,AL曲or丑t时yM删一 矗l_2l-d.Ed.CoklSOringH舡tLahofatotyP阍,19?, 1.?一1?.14. ~mmerR,et?MIm丑lhomoI曜y"q哪-啪蛆t|forPeR 口rim盯Nud^cR塌,198g,17;67?9. g.F'山I茁NB,etlLWhyethere墨.?蛐y?hlyp嚣of~lpha i.terfe~?JlienRES1991,spe由lI~lue;1目5. 1O.按云巷.千抗素的不同亚型与临床应用.中华实验和临 床病毒学杂春,1991,5;535. '收稿;lg92一O7—11) 中华微生物学和免疫学杂志1993年第13卷第1期 INTERFERON--elcGENEISTHED0MINANTINTERFERON--elALLELE AMONGTHEPARTIALP0PUL枷0N0FCHINESE BiZhi—gang,etai (Natural口舶4rVb'oloF~aidGFmee~M0,』It_Virotog~?B~e,g) ThedistributionofWN—allelesingenomesof27norn3alChinesewasanalyzedbymethedsofPCR?Itw堪 shownthatthethreeallelesofWN—a1reportedtodatecov]dbedividedintotwogroupsdependingontheaminoacidat position158.onewaggroup.L(158Lee)inclwdingWNma]aandWN--alb,theother,group. V(158Va1)including WN--cz]c,whichis59.3ofsamplesdetected.Itindicatedthatgroup"V"IFN—alcgonew嚣 thedominantIFN—al alleleingenomcofatleastthepart~.1populatinnofChinese?TheresultswouMfavorthefurth erstudyof?N—aramily anddevelopmentofWNma]Cproduct— Keywords:Int时 ,eron(1FN)_Allele;Polymerasechainreaction(PCR)}N~cleicacidhyb132fiz~ion 亲和层析技术纯化G—csF 郭小清王爱霞郭振泉 粒细胞集落朝辩固子(G—csF)是一种塘蛋白单 体.正常人血中含量裉低,在机体受到细菌,内毒紊刺激 后血清中的G--CSF浓度较正常人高出1000倍,此时 不仅血清中G--CSP浓度?200ns/m](正常人血清中G — csF浓度在200pB/ml以下),而且台有很多各种各 样的成分以及杂蛋白,因而采用常规方法难以分离.既 使是基因工程表达的rhG—CSF要纯化G--CSF也比 较困难.车实验室1989年成功地建立了三株杂交I茸细 胞,所分泌的单抗与rhG--CSF能专一性,选择性结合. 根据这一优势,我们采用亲和层析技术纯化G--CSF. 方法如下: 0环氧氯丙烷在碱性条件下活化载俸Sopharose 4B.@配基抗rhG—CSFMc.Ab儡联到活化好的载俸 上.@处理好的Sopharo~蛆抽气装柱,调好瘴速2, 4ml/l0分钟,并用平衡液PBs平衡.?上样,细菌性盛 染病人的血清,鞠腔脓液和小鼠静脉注射内毒紊6小时 后的血清.调整泷速2滴/分钟.?洗脱.用平衡液洗 杂蛋白,然后用pH2.4,0.1m~/LsIy—HCI缓冲液解 析.流速5ml/12分钟,收集1峰.(洗脱曲线见图)@用 ELISA法检测收集产品的生物活性.用sDs—PAGE 测收集产品的纯度. 检测结果(见表).收集液中G--CSF活性的检测全 部为阳性.说明分离到的是G--CSF.杂蛋白峰的活性 全部是阴性. 寰 圈.紊和层折洗脱曲线 峰I是杂蛋白峰}峰I为0一csF峰 ??性对且用tho—c口t啊性耐?用1聃 由于收集液的稀释,G—c卵的含量根低,可荐经 浓缩即为机体自然合成的人G—csF和鼠G--CSF,为 以后有关G--CSF的研究及临床应用提供了条件,为我 国基因工程中rhG--CSF的纯化提供了一条避径. 1.北京协和医院2.北京大学 (收稿:1992—06—10营回:1992—10--26)