小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组动态变化（可编辑）

小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组动态变化（可编辑） 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋 白质组动态变化 1 ?指导小组成员 康晓楠 崔杰峰 副教授 副教授2 ??3 ?目录 主要英文缩略词表 中文摘要? 英文摘要? 引言.: 第一部分小鼠胚胎干细胞的肝向分化和验证 摘要 前言??。 日吾??。 材料和 结果??.. 讨论??.. 第二部分小鼠胚胎干细胞肝向分化过程中转录组的动态变化 摘要??. 前言??. 日吾??. 材料和方法??。 结果??. 寸论??. 第三部分小鼠胚胎干细胞肝向分化过程中蛋白质组的动态变化 摘要??. 前言??. 月舌??.辱 材料和方法??. 结果??. 讨论??. 全文总结. 后续工作. 参考文献. 文献综述. 附件.4 致谢 ?? ? ?5 ? 博士 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 主要英文缩略语词表6 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 ?? ?7 ?? 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中 转录组和蛋白质组的动态变化 中文摘要 具有无限自我更新能力和 多向分化潜能的胚胎干细胞 ,,理论上可以分化形成机体的全部组织类型细胞。向肝系的定向分化, 无论对于可能的肝再生应用,还是研究肝脏早期的发育分化或肝相关疾病的发病 机理、新药的代谢及毒理学等都具有重要的价值。至今,尽管多项体内外研究都 已证实了的肝向分化,但均没有对具体机制进行阐释,分化的结果也不太 令人满意,仍然存在分化率低、细胞混杂等严重问题。弄清该过程的分子调节机 制,既有利于对胚胎肝脏发育机理的理解,又有助于进行更有效的定向分化。为 了探索分化为肝细胞的分子基础,本研究首先联合应用一些促肝生成因子 体外作用于小鼠诱导其发生肝向分化,再分别利用基因芯片和经典的二维 电泳结合质谱技术动态了该过程早期的转录组和蛋白质组的变化,发现了一 些可能与分化密切相关的候选分子,为下一步详细研究分子机制提供了依据。研 究分为以下三个部分: 第一部分小鼠胚胎干细胞的肝向分化和验证 本部分基于小鼠胚胎肝脏早期发育的分子机理,分阶段加入维甲酸 ,、成纤维细胞生长因子 ,、肝细胞生 长因子 ,、制瘤素 ,、地 塞米松,等促肝生成因子,诱导小鼠胚胎干细胞? 的肝向分化。对分化细胞形态学、基因、蛋白表达及功能的验证分析表明,分化 天时细胞表达、等内胚层标记,分化天时细胞开始表达白蛋白 ,、细胞角蛋白 ,等肝细胞标记,并 呈现肝样细胞形态,经促成熟诱导后,葡萄糖磷酸酶一, 等较成熟分化基因的表达逐渐增强,并形成毛细胆管等特征性超微结构, 也具有了一定的糖原合成能力;另外,在此分化过程中,甲胎蛋白 ,的表达呈先上升后下降的趋势,而的表达呈逐级上升的趋 势。这些结果证实 了小鼠.在分化天时出现了早期的肝向分化,而且此分 化过程在基因表达模式上可大致模拟体内早期的胚胎肝脏发育。8 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 该部分成功建立鼠定向分化为肝样细胞的体外诱导体系,为进一步 的分化机制研究提供了模型基础。 第二部分小鼠胚胎干细胞肝向分化过程中转录组的动态变化 为探索上述分化过程的分子基础,寻找可能起关键作用的生物学通路和分 子,我们首先采用基因芯片技术分析了瓜水平上的基因表达变化。 根据第一部分诱导分化的阶段性特点,本部分选取了未分化的小鼠. 以下简称为“”、食胀天缀瓶加、以简称为“”帮 分化天细胞彻、而陷处理岁歹瞩以万筋魏为“”/为研究对象,采用与 分化相关的小鼠干细胞芯片 ,温公司 比较分析了它们的转录组,观察在早期发生肝向分化时调节生长和维持其稳 定的信号通路及分子的变化。三组细胞两两比较共发现个基因差异表达大 于或等于倍,其中与相比纠万筋承考“/”夕有个,与 相比,纠万笱承考“/”/有个,与相比,纠万笱魏为“/”夕 有个,实时定量检测验证了数据的可靠性。差异体现在多个方面,反映了 肝向分化时复杂广泛的转录调节,进一步的生物信息学分析发现这些变化归类集 中在、、、通路及细胞外基质、细胞连接和粘附上,提示这 些信号可能与胚胎早期的肝向分化密切相关;另外,分化细胞在天和天呈现了 不同的基因表达变化模式,前天的变化集中在和通路上,而到天的 变化则集中在、和通路上,体现了这些信号在胚胎早期不同分化阶 段的重要作用。利用数据库分析与分化发育相关差异基因的相 互作用也 提示了、、、通路的核心作用,它们之间的网络联系给下一 步的详细机制研究提供了一定线索。 第三部分小鼠胚胎干细胞肝向分化过程中蛋白质组 的动态变化 为了更全面地观察上述分化过程早期的分子变化,寻找可能的分化相关蛋 白,我们又分析了蛋白质组的变化。 同样选取上述三组细胞为研究对象,运用经典的结合 ?/技术比较分析它们的蛋白质组,挖取了 个显著差异点大 ???9 ?? ??博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 于或等于倍进行质谱分析,经数据库搜索、去冗余后共鉴定出个差异蛋白, 代表个不同的蛋白质,其中/有个,/有个,/有个, 等的免疫印迹检测结果与胶图、质谱均保持一致。与基因表达类似,分化细 胞的蛋白表达在天和天也呈现不同的变化模式,前天以蛋白表达上调为主, 到天则以下调为主。生物信息学分析发现这些差异蛋白主要参与维持基因组稳 定、转录翻译调节/蛋白加工、能量代谢和分子伴侣等生物过程,暗示它们在胚 胎早期肝向分化中的重要作用。在这些差异蛋白中,约%/在小鼠 中丰富表达,有些已被报道可能与分化相关,如 、、。本文选 择了小鼠四个不同分化方向的具体研究作比对,发现有%个蛋白与 它们相同,包括、、、. 等,其中与拟胚体 ,相关研究的重叠较多,主要存在/ 组,而与神经分化相关研究的重叠较少,尤其是当较成熟晚期的多巴胺分化与 /组相比时。这些结果之间的比对可能有助于寻找分化过程中共同 的、细胞类型特异性的以及发育阶段特异性的调节蛋白。另外,通过与肝细胞癌 ,蛋白质组学研究结果比对,发现约%/ 的蛋白在中也显示差异表 达,如、、 、、、,提示它们在 肝分化相关生物过程中可能发挥重要作用。进一步对差异蛋白的相互作用网络分 析发现某些蛋白虽然没有被鉴定出,却与许多差异蛋白有着相互作用,成为网络 中的共同节点,如.. 、 ,为我们下一步 详细研究这些相互作用在分化过程中的调控提供了一定的线索。 结论 .小鼠在、等促肝因子分步诱导作用下在分化天时发生了早 期的肝向分化,而且此过程在基因表达模式上可大致模拟体内早期的胚胎肝 脏发育。 .此分化过程中的基因变化集中在、、、通路及细胞外基 质、细胞连接和粘附上,提示这些信号可能与胚胎早期的肝向分化密切相关。 .这些差异蛋白及它们主要参与的转录翻译调节/蛋白加工、能量代谢和分子 伴侣生物过程可能在胚胎早期肝向分化中发挥重要作用。 .分化天和天不同的基因、蛋白表达变化趋势反映了胚胎早期复杂精细的 分子调控机制,也提示动态分析的重要性。 10 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 .在胚胎发育早期可能存在着某些共同的调节机制,比对不同研究的结果可 能有助于寻找共同的、发育阶段或细胞类型特异性的分化调节蛋白。 .与研究结果的重叠,暗示它们在肝分化相关生物过程中的可能作用。 ?潜在应用价值 .为下一步研究分化为肝细胞的具体机制提供候选靶点,从而有助于对胚 胎肝脏发育机理的理解和指导胚胎干细胞进行更有效的肝向分化应用于肝 再生。 .为研究肝分化相关疾病的分子调节机制提供线索,如。 创新点 .以往研究多是以分化的终末细胞为分析对象,而忽略了过程中的调节信息, 本研究着眼于分化的更早期分子事件,并选取不同时间点动态分析了该过程 中转录组和蛋白质组的变化。 关键词:胚胎发育;胚胎干细胞;分化;肝细胞;转录组;基因芯片;蛋白质组; 质谱;肝细胞癌 中图分类号:;; ? ?博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化? 巧 . , , 嬲】【 . , . ? . , . , . 、析 ? . : / , 限,, , .? .,博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化. , , ? , ,?,一, . ,. ,, . . ? , ,. ? , “”, “”, “”. . ? , / , / / 、析 . . .,,,博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组 和蛋白质组的动态变化 , , 、?? ?, ., ,. , . , , ,,.. ? ,,./ . ? ,, /, / /.一. . , . ,,/ ,.. , ? . ?,% 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋 白质组的动态变化,,,, . , ? ?/, 诵 ,谢,/ .,? . , , . ,. ? , .、 ,. ,晰 , . ? . . , , 巧 . . , ,,, . ., ,/? . . 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的 动态变化 ? 巧 , . ? . , .,? ? . . 廿 .. , . .. , ? .、析 ... ; ;;; ;;; ; ;;博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 引 言 ? 肝脏是人体内最大的器官,执行着许多重要功能,包括合成血浆蛋白、分泌 胆汁、合成尿素、代谢营养物质、储存糖原、解毒等,肝功能的严重减退甚或衰 竭都会危及人类的生命。终末期肝病 ,就是指由 各种慢性肝脏损伤所导致的肝功能极度减退直至衰竭的一种病理状态,在我国乙 型病毒性肝炎是最常见的病因,欧美国家则以酗酒为主要原因,近年来又由于慢 性丙肝、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎及肝豆状核变性等疾病的不断增 加,使得的发病率呈上升趋势,成为危胁人类健康的重大疾病之一【】。目 前治疗和急性肝衰竭唯一有效的方法只有肝移植,它的广泛应用却受到了 供肝极度缺乏的限制。随着再生医学的发展,肝细胞移植、生物 人工肝以及组织 工程肝被普遍认为是肝移植可行的辅助替代疗法【.,可用于等待肝移植病人的 临时缓解,但是目前这些治疗手段也同样面临着细胞来源不足、存活期短、功能 迅速降低等问题,获取能大量扩增的、功能完整且安全的肝细胞是解决上述 ,, 困扰的关键。取自囊胚期内细胞团的胚胎干细胞 作为个体发育之初的原始干细胞,理论上具有分化为全部组织类型细胞的潜能, 而且在体外严格培养条件下能无限增殖,这些独特的性质使其可能成为一种新型 的、理想的肝细胞来源【.川。 至今,分化为肝细胞的能力已在体内外多项实验中得到了证实,诱导方 法多种多样,包括添加促肝细胞因子、化合物诱导、与非肝细胞共培养以及导入 肝富集转录因子等【 删,尽管付出了诸多努力,目前的分化还是不尽如人意,仍 , 然存在着分化率低、细胞混杂、不成熟等突出问题,阻碍了它的 临床应用【喇】。 在自然发育过程中,胎肝的早期分化涉及邻近心源中胚层、横膈间充质、造血细 胞、内皮细胞等多种信号的协同诱导‘‘,弄清其中的分子调节机制,综合模拟 这些信号可能有助于指导我们完成更有效的定向分化,从而生产出足量可供移植 用的肝细胞。研究胚胎发育机制,是最常用的经典模型,也已被用于多种细 胞类型的体外分化研究,包括神经细胞、造血细胞、心肌细胞等。在肝细胞方面, 尽管上述有些分化实验已经能很好模拟体内过程,但均没有阐明其中的详细机 制,究竟是什么分子和信号控制及如何协调控锖分化为肝细胞的,我们对此 还知之甚少。 早期围绕肝分化机制的研究多是集中在单个或几个基因及通路上,比如熟知 的、信号、家族、/家族等,对于复杂的调控网络及关键的分 ? 化分子仍没有定论【弱彤。近些年,随着高通量组学技术的不断发展,使得从整体 上分析特定生物过程中的分子变化成为可能。到目前为止,基因芯片技术已被广 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 泛用于干细胞生物学研究,给我们理解的自我维持及定向分化等生物过程提 供了丰富的数据。在肝分化方面,也有一些相关研究,但更多关注的是肝发育的 ? 较后期阶段,如肝干细胞的双相分化【鲍】,对于更早期的肝定型却很少了解。 除了转录组学,蛋白质组学策略近来也不断在干细胞研究中显示出它的价值。蛋 白质是细胞内各种生物学行为的最终执行者,对干细胞及其特定衍生物的蛋白质 组学分析,有助于确定细胞类型特异性标志物,以便用于后续的鉴定和分选。而 且,由于降解、选择性剪接、翻译后修饰等原因导致细胞内基因的表达在 水平跟蛋白水平不一定保持一致,等人在用磷酸化蛋白亲和柱结 合二维电泳、质谱技术分析小鼠分化时就发现,某些关键因子的改变发生在 翻译后修饰水平而并非转录水平嘟】,所以,蛋白质组学和转录组学分析相互补 充,有助于更全面了解的分化过程眇】。目前,在神经、骨、心肌、脂肪等分 化上都已有较多的蛋白质组学研究,在肝方面却缺乏报道,而且,多数研究偏重 ? 定向分化发生以后的变化,而忽略了更早期的分子事件【】。 本研究采用了一种较成熟有效的体外诱导小鼠定向分化为肝细胞, 然后分别应用基因芯片技术和经典的二维电泳结合质谱技术分析小鼠发生 肝向分化时早期的转录组和蛋白质组的动态变化,进而探讨这一过程中可能起关 键作用的基因和蛋白,为下一步详细研究肝分化的具体机制和胚胎早期的肝脏发 育提供线索。 ? ?小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 博士论文 第一部分小鼠胚胎干细胞的肝向分化和验证 ? 【摘要】 目的:建立小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞的体外诱导体系, 为进一步的分化 机制研究提供模型基础。 方法:研究选用小鼠.系,以小鼠胚胎成纤维细胞 ,为饲养层维持其体外生长。采用单层贴壁培养方式,分 ,、、、、等促肝生 阶段加入维甲酸 成因子,诱导小鼠的肝向分化。应用光镜和透射电镜分别观察分 化细 胞的形态学改变和超微结构特征;应用逆转录聚合酶链式反应 ,、实时定量.和免疫细胞化学,技术分别检测、 、等肝细胞特征性基因和蛋白的表达;利用过碘酸雪夫氏反应 ? .,检测分化细胞的糖原合成能力。 结果:光镜下,未分化的.呈克隆样生长,分化天时细胞体积明显 增大, 呈多角形,核大而圆,有时可见双核;分化天的细胞表达、 等内胚层标记,分化天的细胞表达、等肝细胞标记,经、 , 促成熟诱导后,、酪氨酸氨基转移酶 等较晚期分化标记物的表达逐渐增强,进一步的定量检测结果 显示甲胎蛋白 ,的表达从天开始呈先上升后下 降的趋势,而的表达从天开始呈逐渐上升趋势;用电镜观察分化 ? 天细胞的超微结构,胞浆内含较丰富的线粒体、粗面内质网等细胞器, 并可见肝细胞特征性的毛细胆管样结构,此时细胞的糖原染色也显示阳 性。 结论:小鼠.在、等分步诱导作用下于分化天发生了早期肝 向分化,而且此分化过程的基因表达模式可大致模拟体内早期的胚胎肝脏 发育,为下一步的分化机制研究成功建立了体外模型。 【关键词】胚胎发育;胚胎干细胞;分化;肝细胞 士 翮 舌 由于具有高度的自我更新能力和发育的全能性,使其可以用来治疗许多人类疾病,如肝病、糖尿病、血液病、帕金森病、心梗等,但是如果直接将未分 化的移植病人体内,则存在形成畸胎瘤的风险,还会大大影响分化细胞与 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 病理组织的整合、降低移植效率,所以,在临床应用前均需体外诱 导的定 向分化【’。向肝系的定向分化,无论对于可能的肝再生应用还是对研究 ? 肝脏早期的发育分化都具有很重要的意义,在这方面尽管人们已做出了诸多努 力,目前的分化结果还是不令人满意,距离真正的临床应用还存在很多障碍,肝 脏分化机制的明晰可能会有助于实施更好的定向分化。此外,向肝系分化模 型的建立,还可以为研究肝分化相关疾病如肝癌及遗传性肝病如肝豆状核 变性的分子机理、新药的肝毒理学等提供易于分析和操作的体外平台。本部分 研究基于小鼠胚胎肝脏的早期发育分子机理,采用一些常用的促肝因子体外诱导 小鼠定向分化为肝细胞,为后续的分化机制研究建立了模型基础。 材料与方法 一、 材料: .细胞系:小鼠.细胞由美国威斯康星大学的张素春博士惠赠。 .培养液:公司产品..,含有. /葡萄糖、,含谷氨酰胺,无丙酮酸钠,储存。 .特级胎牛血清:公司产品..,过夜充 分溶解后分装,.保存。 .非必需氨基酸:公司产品.. ,,储存。 .丙酮酸钠:公司产品..,,储存。 ,储 ..巯基乙醇:公司产品..,, ? 存。 /, .青霉素.链霉素抗生素:公司产品..,, 分装后.保存。 ..%胰蛋白酶/.%消化液:公司产品.., 分装,.保存。 .,含 .磷酸缓冲液:公司产品.., / ,. ,. .,储存。 / / .明胶:公司产品..,用?水或配制成.% 浓度,高压灭菌,储存。包被培养板或皿时,加入适量覆盖底部即 可,,吸弃多余液体,再放入烘干,临用时用和培养液各洗 一次。 ? .型胶原:公司产品.., /,用无菌水稀释 倍,分装,。储存。按 , /包被培养板或皿,。过夜大于小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞 过程中转录组和蛋白质组的动态变化 博士论文 吸弃多余液体,再放入烘干,临用时用和培养液各洗一次。 .丝裂霉素:公司产品,用无菌配制成. /的母液,充分 ? 溶解后分装、.冻存,配制和保存均需避光。 .:公司产品..,室温保存。 .白血病抑制因子:公司产品, /相当于 /,储存。 .维甲酸:公司产品..也,用的配制 成 ,分装,.冻存,配制和保存均需避光。 /即. .酸性成纤维细胞生长因子:公司产品...,用无 菌含.%配制为 /,分装,保存。 .碱性成纤维细胞生长因子:公司产品...,用 无菌含.%配制为 鲈,分装,.保存。 .肝细胞生长因子:公司产品...,用无菌 ? 含.%配制为 /,分装,保存。 .制瘤素:公司产品...,用无菌含.% 配制为 ./,分装,.保存。 .地塞米松、牛血清白蛋白、维生素:均为公司产品, 、. 用乙醇溶解,后两者用溶解,分别配制为‘ , /、 过滤除菌后分装、储存。 .胰岛素.转铁蛋白.亚硒酸钠,: 公司产品..,,含. 亚硒酸钠、 /丙酮酸 ? 钠、 /胰岛素、. /转铁蛋白,储存。 .戊二醛、四氧化锇、乙醇、丙酮等均为国产分析纯试剂。 .:公司产品..。,为公司生 产,购于上海生工生物工程公司。氯仿、异丙醇为国产分析纯试 剂。 .水的处理:在通风橱中,加 到 去离子水中,使终浓度 为.%,迅速盖上盖子,充分混匀摇床中中速摇荡至少 后高压灭 菌, 室温保存。 , 逆 .试剂:逆转录反应试剂盒. /此. ,×、 转录酶, 、以及 , 聚合酶 /, 均为 软件,由上海 公司产品,引物应用 ? 生工生物技术有限公司合成,用去离子水溶解,母液浓度均为 /., 和 取上下游引物等体积混合后用于反应。除 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的 动态变化 博士论文 储存,其余均.保存。 .. .:. ?加入 去离子水中,剧 ? 烈搅拌,用颗粒约 调节值至.。高压灭菌,室温保存。 . .: .,去离子水 嘶碱, 硼酸, 定容至 ,高压灭菌,室温保存,用时稀释倍或倍。 .琼脂糖:购自上海基因公司,制备琼脂糖胶时,用×或.溶解,浓 度为%~%,微波溶化后,稍冷却再加入溴化乙锭使其终浓度为 .弘/,左右浇灌至模具上。 ..,北 . 试剂盒: 京天根生物公司产品。 /, .山羊抗小鼠抗体:公司产品..., 保存。 .小鼠单克隆抗体:公司产品.., /, ? 保存。 .标记抗山羊、标记抗小鼠:均为公司产品,避 光,保存。 /母液, .:公司产品..,用配制为. 分装,.保存。 .多聚甲醛、过碘酸、试剂等均为国产分析纯。 .各型细胞培养板、培养瓶、培养皿、、离心管均为 公司产品;.、.离心管及管均为公司产品。 .恒温离心机和低温离心机:公司制造。 , 公司制造。 .仪: .细胞培养箱:公司制造,设置为。,%,饱和湿度条件。 .超净工作台:上海汇龙电子仪表有限公司。 .水浴箱:上海医疗器械七厂。 .倒置相差显微镜:公司制造。 .荧光显微镜:.,公司制造。 公司制造。 .紫外分光光度计: , .生物电泳图像分析系统:购自复日科技公司。 . 漩涡混合器:公司制造。 .仪: , 公司制造。 ? .实时定量仪: ,.公司制造。 .电泳系统:为 公司产品,包括灌胶模具、电泳槽和电源。博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 .超薄切片机:.,公司制造。 .透射电镜:.,公司制造。 ? 二、 方法 小鼠.的体外培养 .小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养:取孕...天的鼠,颈 椎脱臼法处死,碘酒消毒腹部皮毛,先后剪开皮肤、腹膜,取出胚胎放入 中,洗去血液,剥离羊膜和胎盘,将胚胎移入新的培皿,去四肢、头、内脏 红色、尾巴,洗几次,用弯头剪剪碎,直接往皿中加入胰酶,并吸 移至离心管中,手摇约.分钟时间需摸索后加培液终止,吹打,离心 ,弃上清,加入培液高糖型% , /?., 重悬,铺种于培养皿个胚胎/ %孵箱中贴壁天 后中间最好不换液,:传代,长至融合度%左右消化冻存。 ? , .饲养层的制备:取啦代,用“/丝裂霉素在孵箱处理. 洗遍,胰酶消化后以合适密度大约:铺种至.%明胶包被的培养 皿上,贴壁后即可用以的培养,放在孵箱中周内均有效。 . .的培养:先用培液高糖型%%非必需氨基酸/ /青/链霉素 洗一遍 %丙酮酸钠‰.巯基乙醇 饲养层,再往上种植细胞,每天换液,隔天:传代,用不含的培 液%冻存细胞。 小鼠.的体外肝向诱导分化 ? 取代以内.,通过反复几次传代到明胶板上的方法去除饲养层细 胞,每次铺种密度均为/,诱导基础培养基为不含的培 液。 / ,‘维甲酸,培养天; 第一阶段:.%明胶为基质,加入 , , 第二阶段:.%明胶为基质,加 / / / ,培养天; 第三阶段:先用免疫细胞化学方法检测第天细胞的表达,根据阳 性细 胞的分布特点,用细胞刮刮取其它培养皿中相应区的细胞,铺种 到包被型胶 和 / 处理天后,换 原“/咖的新培养皿上,用 / 成无血清培养基,加入? 、×、. 、 维 / 生素培养周。 ? 分化细胞的鉴定 .形态学观察 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋 白质组的动态变化 ..相差显微镜:.及分化细胞直接在相差显微镜下观察形态,并拍 照。 ..透射电镜:将细胞刮取、沉淀后,在冰箱内用.%戊二醛溶于. ? . ,经. 固定 漂洗过夜后,用%四氧化锇后固定 , 再用. 漂洗,依次脱水:梯度乙醇、%乙醇和%丙酮混合液、 %丙酮,最后用%丙酮室温脱水 ,重复次。经环氧树脂包埋 后,用超薄切片机切片,切片厚度 ,然后用枸橼酸铅和醋酸双氧铀染 色,透射电镜下观察并照相。 . 水平基因表达检测 .. .: ... 总抽提 将培养皿中的贴壁细胞,用漂洗两遍后,加入试剂/ , 加样枪反复吹打使细胞完全裂解; 后,吸移至. ? 室温静置 的离心管.,以下皆同中; 氯仿/ 加入. ,用手剧烈振荡 ,室温放置~ ; ; 离心,, , 溶液分两相,吸取上层无色水相置于新的. 离心管中,加入. 异 丙 醇/ 或等体积,颠倒混匀后,室温静置 亦可过夜; 离心,, 。离心后沉淀位于管低; , 弃上清,至少加入 %乙醇水配制/,旋涡重悬沉淀 后,离心, , 重复步骤; ? 弃上清,室温下半风干勿完全干燥,用适量一般~皿水 溶解对悄沉淀。 用紫外分光光度计测定浓度,根据/比值判断质量 ..为佳,分装后.保存备用。 ...逆转录反应 取管 加入如下试剂, ; .~ ./ 止 处理水 定容至弘 立即冰上冷却,瞬时离心,再依次加入以下试剂, 血; 皿 ?此 / 此 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋 白质组的动态变化 ? 基因 引物序列 退火温度 产物大小 登录号 :.’ 印 ? 舢 :’一.’ :’..’ 。 ‘ :.’ ? 仃 :’.’ 。‘ :’乇.’ :’从.’? :’..’ :’似不.’ :’?.’ :’?’ ? ? :’..’ :’’ 。 :’一’ :’下.’ ’ :’.’ :’.’‘ :’.’ :’? ?几’.’ ? :’.’ ? 反应体系:博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中 转录组和蛋白质组的动态变化 .皿 .止 ? .止 , 皿 /. 止 四酶蔓型吐 :吐 去离子水定容至此 滞增程序? 个循环 ?’ 。 ...琼脂糖电泳 产物经.%琼脂糖凝胶电泳分离,用电泳图像分析系统扫描分析。 .. . : ? ...总抽提同上 ...逆转录反应同上 ... 检测 引物序列见下表 基因 引物序列 登录号 ? 与 置试剂于室温平衡充分溶解,取此 博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋 白质组的动态变化 ; .×混合配成 取. 专用管,加入下列试剂: ? 【 皿 , /山 止。 曼堕乜堑曼曼垒坠 琏 去离子水定容至 混匀,瞬时离心,放入仪器中,设置程序: . ? 个循环一每隔.读数一次以绘制 融解曲线。 按?来分化细胁?分化细胞计算基因表达的变化倍数,其中?靶 基因. 内参。 .蛋白表达检测免疫细胞化学, 将灭菌的 盖玻片置于六孔板的培养孔中,将待检测细胞/ ? 铺种其中进行细胞爬片; 次日,吸弃培养液,用洗次 /孔; %甲醇,.固定 血: 洗涤 ,室温,摇床摇; %封闭 ,室温,摇床摇; 加入一抗或封闭液稀释:小鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠 抗体:,摇床过夜。空白对照以代替一抗; 重复步骤; 加入荧光标记的二抗或封闭液稀释:标记抗山羊:、 : 标记抗小:,室温孵育 重复步骤; 加入/室温孵育 ; 重复步骤; %甘油封片,于荧光显微镜下观察拍照。 .糖原合成能力检测染色 弃细胞上清,洗次,%多聚甲醛固定 ,洗次,%过碘酸氧 化 ,再洗次,然后用试剂反应 ,双蒸水冲洗,显微镜 拍照,反应均为室温。 结 果博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程巾转录组和蛋白质组的动态变化 ..分化前后的形态学改变 在倒置相差显微镜下,未分化的.呈克隆样生长,似“巢”状嵌在饲 养层细胞之间,克隆边界清晰但克隆内细胞界限不清图. ,分化天的 细胞,体积明显增大,约倍,呈多角形,有较高的核质比,核为圆形,有 时可见到双核现象图. ;电镜下见分化天的细胞类型基本单一,上皮 样,胞浆内线粒体、粗面内质网、糖原等细胞器含量较丰富,而且,在相邻细胞 膜之间己形成肝细胞特征性的毛细胆管样结构,管腔内可见微绒毛的横断面图 . 。 ?? 图. .分化为肝样细胞的形态学鉴定 图:未分化., 箭头示克隆;图:分化天细胞:图:分化天细胞,:胞 核,:线粒体,:粗面内质网,:脂滴,箭头示毛细胆管样结构; 图和为相差显微镜×照片;图为透射电镜照片,标尺为. ?博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和 蛋白质组的动态变化 .分化过程中肝相关基因的表达 重复三次以上分析可见分化天的细胞开始有内胚层基因、 ? 和关键转录因子基因的表达,分化天有的表达,币也呈弱表 达,分化天时这些基因表达均显示增强,并开始有肝特征性基因 和 的表达,分化天、天可见、和的逐渐增强表达图.;迸 一步的实时定量分析结果重复三次显示分化细胞天的、、 表达量分别为未分化.的..、..、..倍,分 化天时分别为..、..、..倍,分化天时分别为 . .、..、..倍;分化标记邱的表达呈先上升后下降的 趋势:在分化天时无明显表达,分化天时为未分化.的..倍, 分化天时明显增强为..倍,天时则下降为..倍; 的表达呈逐渐上升的趋势:在天和天均无明显表达,分化天时为 的 ? ..倍,天时又增加为..倍’ ,.,这些结 果图.与结果所反映的趋势基本一致。 ~ ~ ‰ 脚心 ? 啪 脚‰? 表示未分 、、、和 ?小鼠胚胎’细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的 动态变化 博士论文 ??口? ??? ‘ ? 一一一 ? 一二?一 二,..一 ? 石 毒 毫? 哆。 痧 彭多 是 ,?? ‖,’‘ ’ 删/ /』 甚淤; 皇耐 &、 姥 ?‖姒 ?】一 彩/ , 纱』 ??一 聃.?.?。?.曲 五 葛 ? , ? ? ? ? 广『 广 广 专 广 广厂一 。一 壬 曩圮 星 ? 守 鲥 / 公 耐 【 .窨 名 巴 壬 菩 主 . 一. 上 .加.而 。 恩 眦 图.实时定量验证肝相关基因的表达图:扩增曲线;图:融解 ? 曲线;图:与未分化相比,各基因在分化、、天细胞中的 相对表达,根据?未分化细胞??分化细胞计算,木.. .分化天细胞和抗原的表达 免疫细胞化学检测重复三次以上表明分化天细胞的胞浆内有和 的合成图,,而不加一抗的空白对照图和未分化的?图 均不表达这两种蛋白,阳性率约为..%,这些阳性细胞呈集落 样分布,多角形或椭圆形,核大而圆. ?博十论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 ? ? 以 ? ?博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 讨 论 ? 肝脏是人体中一个十分重要的器官,它的损伤往往会带来致命的后果,如肝 癌、肝硬化、急性肝衰竭等,面对这些肝病的晚期,目前的治疗主要依赖于肝移 植,但是供体肝的数目却不能满足日益增长的需求,近年来的研究发现,肝细胞 移植、生物人工肝及组织工程肝可作为肝移植的辅助治疗方式, 用于等待肝移植 病人的部分缓解,但这些手段同样也面临着细胞来源不足等问题,因此,寻找合 适的肝细胞来源受到科学家们越来越多的关注。 近些年来干细胞生物学的不断兴起给这种困境带来了新的希望,干细胞与众 不同的自我更新能力及分化潜能使其可能成为一种新型的肝细胞来源,主要包括 成体干细胞和胚胎干细胞两大类潜力资源。前者又可分为肝内和肝外两种,肝内 主要指的是肝干/祖细胞在啮齿类动物常被称作“卵圆细胞”,这类细胞在正常 成体肝脏内含量甚微,又由于缺乏确定的分选标记物,使得分离困难,一般方法 ? 分离如根据// ‘得到的往往是分化程度不一的异质群体,这 些细胞的增殖能力还会随年龄增长而降低【删;肝外的来源包括许多,如骨髓干 细胞、造血干细胞、胰腺细胞、神经干细胞,虽然这些细胞分化为肝细胞的能力 在体内和体外实验中都得到了证实,但关于它们“横向分化”的机制至今还存在着 争议,有研究者提出是细胞融合的结果,又有观点认为这些细胞本就是异质群体, 肝细胞是来源于潜在其中的多能成体祖细胞或组织定向干细胞 的分化【。与成体干细胞相比,应用于再生医学有几点优势, 一是高度的自我复制能力,即在严格的体外培养条件下能够无限增殖并维持未分 化状态;二是发育的全能性,即可以分化为完整个体的所有组织类型细胞,当然 也包括肝细胞;三是遗传的可操作性,对其进行遗传改造后,适当地定向诱导分 化为所需类型的细胞,可用于治疗遗传性疾病。这些特性使很可能成为 一种无限的、理想的肝细胞来源。 鉴于的自我分化能力,如果直接将其移植到体内,得到的往往是多种 分化产物,大大降低了移植率,而且还有形成畸胎瘤的危险,所以,在临床应用 前需先在体外进行有效的、严格控制的肝向分化。至今已有许多实验室致力于这 方面的研究,早期的方法多是先经拟胚体 ,培养几天,再 转移到明胶等粘附基质上,并添加生长因子或化合物进一步刺激,常用的促肝因 子有、、、、、、、二甲亚砜等,后来 又通过与肝细胞、肝窦内皮细胞、肺间充质细胞等共培养,或导入肝富集的转录 ? 因子如肝核因子 ,、间隙连接蛋白如连接子 等进行基因修饰,或采用混合基质支架,或血清限制如用胆汁淤博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 积血清选择富集肝样细胞等手段进一步促进的肝向分化【删,尽管如此, 分化结果还是不太令人满意,分化率低、分化细胞混杂且不成熟是突出问题。 ? 为了解决这些困扰,研究者们一直不断在努力找寻新的方法,后来人们发现,如 果诱导步骤能模拟早期胚胎肝脏发育的过程则有助于更高效的分化。自然发育过 程中,在原肠胚形成阶段,两胚层胚盘上层的特定区域形成原条,原条进一步发 育产生中胚层和定型内胚层,定形内胚层的前端腹侧与邻近的心源中胚层相互作 用形成肝芽,即出现肝母细胞,肝母细胞再接受周围造血干细胞、 内皮细胞等分 泌信号的刺激进一步分化成熟。本研究按照这个思路,参考研究组的 诱导方法【,模拟自然发育的阶段性,分步诱导.的肝向分化。以往研究 表明可以通过削弱/到之间的信号通路诱导出现类似 早期胚胎的分化【舛,于是,我们首先采用在存在条件下诱导.的 内胚层分化,又鉴于来自心源中胚层的信号对定形内胚层的肝定向具有早 期决定性作用,对早期胎肝细胞的生长有维持作用,和有促成熟 ? 作用,无血清条件有利于肝分化,我们在第二阶段加入了、和, 第三阶段加入、,并用无血清培养基筛选肝细胞。根据诱导因子的添加 顺序及小鼠胚胎发育的阶段性特点又参考研究组的结论,我们推测前 天为内胚层诱导阶段,到天为肝诱导阶段,天以后为促成熟和筛选阶段, 对分化标记物的进一步检测表明,第天表达内胚层基因和,第 天表达、等肝分化基因,天以后等较成熟基因表达逐渐增强, 证实了上述推断,而且在此过程中的表达呈现先增高后降低及显示逐渐 增强的模式,这些均表明该分化过程中的基因表达模式大致模拟了体内发育过 ? 程。组还对按此方法诱导所得的肝样细胞进行了基因组芯片分析,发现 它们的基因表达模式与成体肝脏很相似,补充证实了该方案的有效性【】。 类似的诱导模式近几年也陆续被其他研究者采用,如等人先用激活素 和丁酸钠诱导人的定形内胚层形成,接着用诱导其 肝分化,最后再用和促进成熟,发现与以前直接用诱导相比, 可大大提高分化率,而且分化的肝样细胞具有分泌血浆蛋白、表达有活性的细胞 色素酶等功能;另外,他们又尝试用和 先处理人, 诱导其由原条到定形内胚层的分化,再给以同上述的促肝分化刺激,发现可发生 均质的肝分化,形成有功能的肝样细胞,移植到体内可分泌白蛋兰,在这两 个诱导过程中,都可检测到原条、定形内胚层及肝特征性标记基因的陆续表达。 可见,模拟体内发育过程能帮助获取更高效、更均质、更成熟的分化。 ? 对诱导所得的肝样细胞,我们主要从形态学、基因表达及生化功能三方面进 行了鉴定,分化天的细胞呈多角形肝样细胞形态,但核大且圆,类似早期胎肝博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 细胞,而且此时细胞表达一些早期肝分化标记,其中是内胚层的一个分化标 记,同时也是胎肝的一个标记,其表达随肝的成熟而降低;是肝细胞合成的 ? 含量丰富的一个蛋白,早期胎肝就有表达,并随肝的成熟表达量增加。虽然它们 都是肝细胞分化的标记,但在胚外内胚层卵黄囊中也有弱表达,为了与之鉴别, 我们又检测了肝特异性标记,证实了肝分化郴】。对这些阳性细胞继 续给以、促成熟刺激后则开始表达、、较成熟分化基因, 并形成肝细胞特异性的毛细胆管样结构和具有一定的糖原合成能力,虽然上述多 数标记并不是肝细胞唯一表达的基因,但结合形态学及功能的分析,足以证实分 化天发生了肝向分化,而且是处在分化早期未成熟状态。 即使分化产物只含有微量未分化的原始,将之用于临床也有形成畸胎瘤 的危险,所以,提高分化效率和纯度仍是我们的目标。既然模拟体内过程有助于 的分化,明晰其中的详细分子机制肯定有助于指导我们制定出更有效的诱导 ? 方案。在这部分研究中,我们成功地将小鼠分化为了肝样细胞,并证实该 过程在基因表达模式上可大致模拟体内早期的胚胎肝脏发育,从而为下一步的分 化机制研究提供了一个很好的体外模型。 ?博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 第二部分小鼠胚胎干细胞肝向分化过程中转录组的动态变化 ? 【摘要】 目的:通过比较小鼠.定向分化为肝细胞过程中转录组的变化,寻找可能 起关键作用的生物学通路和分子,为下一步研究其中的具体机制、进而理 解胚胎早期肝脏发育的分子机理提供一些线索。 方法:抽提未分化的小鼠.、分化天细胞和分化天细 胞的总,采用与分化相关的小鼠干细胞芯片 ,公司两两比较这三组细胞基因表达谱的差异, 运用实时定量技术验证芯片的结果,并结合生物信息学分析对差 异 基因进行功能分类,同时探讨差异基因之间以及差异基因与其他 基因之间 可能的网络联系。 ? 结果:?、和三组细胞两两比较共发现了个基因差异表达大于 或等于倍,其中与相比/有个,与相 比/有个,与相比/有个,实时定 量检测、、、四个基因的表达趋势与芯片结果一 致。应用和 数据库对差异基因进行功能注释, 发现这些变化可归类为细胞骨架、信号通路、细胞外基质、细胞 连接、细 胞黏附、细胞周期调节、转录调节等多个方面,集中体现在、、 、通路及细胞外基质、细胞连接和粘附上;另外,分化细胞在 天和天呈现了不同的基因表达变化模式,前天的变化集中在和 通路上,而到天的变化则集中在、和通路上。利 用数据库分析与分化发育相关差异基因的相互作用也提示了 、御、、通路的核心作用。 结论:这些显著变化的、、、通路及细胞外基质、细胞连接 和粘附信号可能与胚胎早期的肝向分化密切相关,不同的变化模式反映了 它们在不同分化阶段的重要性。 【关键词】胚胎干细胞;分化;肝细胞;转录组;基因芯片 .‘?‘ 日盯 雷 在第一部分我们成功建立了小鼠定向分化为肝细胞的体外诱导体系, 证实分化天发生了早期的肝向分化,而且此分化过程在基因表达模式上可大致 模拟体内早期的胚胎肝脏发育,从而为本部分探讨分子机制奠定了良好的基础。博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 与传统的、等基因表达检测技术相比,高通量的基因芯片技术 能同时分析成千上万个基因的表达,被广泛应用于基因研究、寻找生物标记物、 ? 疾病分级及发育和疾病相关的基因调节研究。因为分化从基因组角度可以看作是 系列基因程序性表达的结果,所以干细胞及其衍生物非常适用于 基因芯片分析。 在研究中,基因芯片早期的应用主要是定义特异性标志物,通过交叉 比较不同株及不同种系的基因表达谱,发现了一些与维持自我更 新和多能性密切相关的分子特征,如、等【。随着再生医学的发展, 人们开始关注的定向分化能力,基因芯片技术被广泛用于神经、骨、心肌 等的分化研究,给我们理解这些特定的生物过程提供了丰富的数据【,但是在 肝分化方面的应用却相对较少,而且主要集中在发育较晚期的肝干细胞分化上, 对早期内胚层的肝定型很少了解【,,。 本研究采用的小鼠干细胞芯片是一种功能分类基因芯片,这类芯片将微阵列 ? 技术与特定生物学通路有机结合,剔除了表达谱芯片上对研究毫无意义的冗余信 息,有助于我们更好理解复杂的生物学过程。另外,生物信息学作为一门新兴的 交叉学科,综合运用数学、计算机科学和生物学的各种工具来阐明和理解大量数 据所包含的生物学意义,常被用于对高通量技术分析所得数据的 进一步分析【。 本部分先采用基因芯片分析上述体外诱导过程中早期的转录组变化,再结合 、 及数据库对差异基因进行了进一步的生物 信息学分析,试图寻找可能起关键作用的生物学通路或分子,为下一步的详细机 制研究提供线索。 材料与方法 一、 材料 ..的培养及诱导分化相关试剂见第一部分。 .抽提相关试剂见第一部分。 .小鼠干细胞功能芯片 为美 公司产品,包含个与干细胞维持和分化相关基因,另外还点制了、 、、、、六个看家基因,设置了阳 性对照,阴性对照、、、、、、 。 .缓冲液、链亲和素偶联的碱性磷酸酶:公司产品。 . 电泳缓冲液: 中含有. .、. 乙酸钠和. 。博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白质组的动态变化 ..线性扩增试剂盒:含有弓物、 酶抑制剂、合成酶混合液、合成缓冲液 ? 、除酶的、.扩增缓冲液和扩增酶类混合液。 ..:公司产品...。 。 .纯化试剂盒:公司产品... , .杂交液:为公司产品。 .配制:称取. 去离子 拘和. 的二水柠檬酸钠溶于 。 水中,用的调节至.,定容至 .%配制:称取 去离子水中。 十二烷基磺酸钠溶于 .化学发光检测试剂盒...、封闭液、×缓冲液、缓冲液 和.化学发光底物为公司产品。 .实时定量渐用耗材、试剂及仪器均与第一部分相同。 ? 二、 方法 ..的肝向诱导分化见第一部分。 .细胞总抽提具体步骤见第一部分 使用试剂从未分化.通过反复几次传代到明胶板的方法去除饲 养层细胞、分化天细胞和分化天的肝样细胞对照免疫细胞化学结 果, 用细胞刮刮取其它培养皿中阳性对应区细胞中提取总。 . 质量检测 ..紫外吸收测定法,即使用.贝定浓度和纯度。 ? ...滴加 水至测量基座的表面调零。 ...将样品滴至测量基座表面,液滴会自动在上下基座之间形成 液柱并自 动完成测定,浓度及质量的各种参数将在电脑中自动生成文件。 ...一次测定完成后,用擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液,再 进行下一个 样品的测量。 ...以/的比值..最佳来判定纯度。 ..变性琼脂糖凝胶电泳测定纯度和完整性 ...制备%变性琼脂糖凝胶:将 .%水中,加热溶 琼脂糖溶于 解后冷却至,加入 的×电泳缓冲液和 的%甲醛溶 液。然后在胶槽中灌制凝胶,插好梳子,水平放置待凝固后使用。 ...加样:取样品烬,加入倍体积的甲醛上样染液,同时加入使终 浓度为 使样品变性,冰上速冷。加 /,混匀,加热至孵育 入此的上样缓冲液混匀,取适量加样于凝胶点样孔内。同时点标 准博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中转录组和蛋白 质组的动态变化 样品。 。 ...电泳: /电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少. ? ...紫外透射光下观察并拍照。 . 标记与合成 ..合成 ...配制退火混合液 总 .嵋 至篮坐曼坠曼物?:加去 至总体积此 ...按下表配制合成混合液 合成混合液 每张芯片 去的 ? 合成缓冲液 . 酶抑制剂四 此 合成酶混合液 此 总体积 此 混合均匀,瞬时离心,置于冰上备用。 ...合成反应 每“退火混合液中加入肛的合成混合液。混合均匀,瞬时 离心。水浴 。瞬时离心。.保存备用。 ..合成、纯化 ? 。 ...合成好的 水浴 ...配制扩增混合液 试剂盒中所有试剂溶解后离心,如果管中含有沉淀,水浴溶解并 吹打均匀,所有试剂均置于冰中备用。按下表在离心管中依次加 入: 扩增混合液: 每张芯片 .×心『扩增缓冲液悼 ? 扩增酶类混合液 “ 总体积 “ 混合均匀,瞬时离心。? ...合成反应 每个样品各取 ,分别加入肛扩增混合液,混合均匀并离心。 水浴 以上。博士论文 小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞过程中 转录组和蛋白质组的动态变化 ...纯化 ....每个反应液中加入 无酶的水至总体积?。将 ? .的离心管中,冰中保存; 反应液移至. ....每管加入 裂解结合缓冲液,混合均匀; ....加入?室温保存的级无水乙醇,混合均匀。 ....将上述准备好的样品加入纯化柱,然后将纯化柱放入收集管, 离 ?,弃流出液。 ....洗纯化柱,每个纯化柱中加入此工作液:无水乙醇:,体 ,弃流出液;将纯化柱再次放入收集管,加入 积比, 离一 。 , 工作液, 离心 ....洗脱 将纯化柱转入新的洗脱管 ,每个纯化柱中加入 ? 水。室温放置 , ,得到的溶液即为纯化的。 离心 ..的质量控制 、 和 紫外分光光度法测定在 的光吸收值,计算 浓度:稀释倍数样品浓度