熊果酸免疫调节作用的初步研究

熊果酸免疫调节作用的初步研究 第27卷第6期 2006年12月 西安交通大学(医学版) JournalofXi’anJiaotongUniversity(MedicalSciences) V01.27NO.6 Dec.2006 熊果酸免疫调节作用的初步研究 冯英杰,任会勋,袁育康,申斐,范桂香 (西安交通大学:1.医学院免疫学与病原生物学系;2.继续教育学院,陕西西安710061) 摘要:目的观察熊果酸(uA)对正常小鼠及免疫抑制小鼠的免疫调节作用.方法用MTT染色法检测淋巴细胞转 化功能,用溶血分光光度法检测抗体形成细胞功能,用巨噬细胞吞噬实验检测非特异免疫功能,用ELISA方法检测小 鼠血清中Th型细胞因子白介素一2(IL-2)和Th.型细胞因子白介素一6(IL-6)质量浓度的变化.结果uA对于正常 小鼠的细胞免疫功能为小剂量促进,大剂量抑制,对体液免疫功能现出剂量依赖性抑制作用.对于免疫抑制的小 鼠,uA可以全面改善免疫功能,各个剂量组与对照组相比均有显着性 差异(P<0.05),其中以中剂量组效果最为显 着.结论UA具有免疫调节作用,对于正常的机体表现出使免疫功能 向Th漂移的特点.uA能够显着增强环磷酰 胺致免疫低下小鼠的免疫功能. 关键词:熊果酸;免疫调节;Th平衡I,J,鼠 中图分类号:R967文献码:A文章编 号:1671-8259(2006)06—0541-03 Primarystudyonimmunomodulatoryeffectofursolicacidinmice FengYingjie,RenHuixun,YuanYukang,ShenFei,FanGuixiang (1.DepartmentofImmunologyandPathogenicMicrobiology,MedicalSchoolofXi’anJiaotong University;2.SchoolofContinuingEducationofXi’anJiaotongUniversity,Xian710061,China) ABSTRACT:ObjectiveToconfirmtheimmun0m0dulat0ryeffectofursolicacidOilnormaland immunosuppressivemicecausedbycyclophosphamide.MethodsWeassayedthefunctionofTlymphocyte transformationwithMTTtest,examinedthefunctionofBlymphocytewithhemolysisspectr0ph0t0graphy, determinedthefunctionofnon-specificimmunitywithphagocytosisofmacrophages,andmeasuredthecontent changesofTh,cytokineIL-2andTh2cytokineIL-6inserumwithELISA.Res ultsUrsolicacidhadasuppressant effectonthefunctionofhumoralimmunityandenhancedcel1.mediatedimmuneresponseatthelOWdosagebut presentedoppositeeffectatthehighdosageinnormalmice.UrsolicacidsignificantlyimprovedimmunefunctionOil immunosuppressivemicecausedbycyclophosphamide(P(O.05).Whenthedrugwasadministeratadosageof50 mg/kg,theeffectwasmoreremarkablethantheothertwodosages.ConclusionUrsolicacidhasall immunomodulatoryeffectandisinclinabletoTh,shiftOilnormalmice.Ursolicacidsignificantlyimprovesimmune functiononimmunosuppressivemicecausedbycyclophosphamide. KEYWORDS:ursolicacid;immun0regulati0n;Thbalance;mice 熊果酸(ursolicacid,UA)分子式为C30H48O3, 相对分子质量456,是一种五环三萜类化合物,广泛 分布于自然界[1].uA作为一种植物提取的天然药 物,安全,不良反应小,其药理活性十分广泛,引起了 国内外学者的普遍关注.uA的抗肿瘤,抗炎,肝保 护,抗高血压,降血糖,抗氧化,保护心脑血管等药理 作用已经被广泛证实[2].uA表现出的药理活性许 多与免疫相关,但它在免疫学方面的研究报道较少, 本研究通过观察UA对正常以及免疫功能低下小鼠 的免疫功能的影响来证实UA的免疫调节作用. 收稿日期:2005—1卜21修回日期:2006—03—26 通讯作者:范桂香,教授.E—mail:gxfan@mail.xitu.edu.erl 作者简介:冯英杰(1981一),女(汉族),在读硕士.研究方向:分子免疫 学.E-mail:kingkingfen8l@sohu.eom 1材料与方法 1.1材料 1.1.1主要试剂UA(含量>98)购自陕西慧科 植物有限公司,四氮唑嗅盐(MTT),刀豆蛋白A (ConA),二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司, RPMI一1640细胞培养基购自Gibco公司,小牛血清 购自兰州民海生物有限公司,淋巴细胞分离液购自上 海华精生物高科技有限公司,环磷酰胺注射液(Cy) 购自上海华联制药有限公司,小鼠IL一2,IL一6ELISA 试剂盒购自晶美生物工程公司. 1.1.2实验动物BALB/c小鼠,雄性,体重(20? 2)g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供(合格 542西安交通大学(医学版)第27卷 证号:医动证字08—004号). 1.2方法 1.2.1动物分组与给药将80只BALB/c小鼠分 为正常和免疫功能低下(于灌服UA第4天一次性腹 腔注射Cy100mg/kg,0.2mL[)两组,每组分别设 对照组,UA低剂量组(25mg/kg),UA中剂量组 (50mg/kg),UA高剂量组(100mg/kg)4个小组. 将UA粉末用5g/L羧甲基纤维素钠配成混悬液,每 日清晨灌胃,连续10d,正常对照组灌服同体积5g/L 羧甲基纤维素钠. 1.2.2动物的免疫与标本采集于给药后第6天, 用20(体积分数)的绵羊红细胞(SRBC),腹腔注射 免疫小鼠(0.25mL/只).于末次给药后次日,各组 小鼠拔眼球取血,分离血清,用于细胞因子的检测. 脱颈处死小鼠,无菌取脾,分离淋巴细胞. 1.2.3检测指标及方法?淋巴细胞转化试验:参 照文献[7—8],结果用刺激指数(sI)一实验孑LA值/对 照孔A值表示;?抗体形成细胞(PFC)功能检测(溶 血分光光度法):参照文献[9]进行;?血清溶血素测 定:参照文献[10]进行;?巨噬细胞吞噬功能测定:参 照文献[11]有改进.实验前72h,小鼠腹腔注射 20g/L无菌可溶性淀粉溶液1mL,实验前3h重复注 射,以诱使更多的巨噬细胞.实验前2h腹腔注射 2.5(体积分数)鸡红细胞悬液1mL.小鼠脱颈处 表1UA对正常小鼠免疫功能的影响 死后取腹腔液涂片,甲醇液固定,Geimsa’S染色,油 镜下观察100个巨噬细胞.以吞噬率(phagocytic rate)和吞噬指数(phagocyticindex)作为检测指 标;?IL一2的体外诱生:参照文献[12]进行;?血清 中IL一2,IL一6检测:采用双抗体夹心法,实验步骤严 格按试剂盒说明书进行. 1.2.4数据处理实验结果以均数?标准差(戈?s)表 示,用SPSS11.0统计软件进行单因素方差(One-Way ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1UA对正常小鼠免疫功能的影响研究显示 uA对正常小鼠的体液免疫指标抗体形成细胞的功 能,血清溶血素水平,以及血清中细胞因子IL-6(Thz 型细胞因子)的质量浓度,低剂量(25mg/kg)表现为 抑制作用,并且随着剂量的加大,抑制作用加深.而 对于细胞免疫功能,低剂量(25mg/kg)UA显着地增 加血清中IL-2(Th型细胞因子)的水平,中剂量的促 进作用没有低剂量组强,二者有显着性差异,大剂量 组表现为抑制作用.对于T淋巴细胞的转化功能, UA在低剂量时促进转化增殖,表现为刺激指数明显 升高,中,高剂量组表现出抑制作用.中剂量uA能 显着提高巨噬细胞吞噬率及吞噬指数,大剂量时则抑 制吞噬功能(表1). Table1Theimmunomodulatoryeffectofursolicacidinnormalmice(?,n一 10) ‘P<O.05,??P<O.olV5.control 2.2UA对免疫抑制小鼠免疫功能的影响小鼠腹 腔注射环磷酰胺后,免疫系统各检测指标数值均降 低,与对照组相比具有显着性差异,表明免疫功能处 于低下状态(表2).不同剂量UA对免疫功能低下 小鼠都能显着改善由环磷酰胺所造成的抗体形成功 能低下,提高血清溶血素水平,增加血清IL一6的水 表2UA对免疫抑制小鼠免疫功能的影响 平,其中以中剂量组效果最为显着;同时增强T淋巴 细胞增殖转化功能,刺激指数显着升高.低剂量UA 显着促进淋巴细胞培养上清中的IL-2水平,而中,高 剂量组与对照组相比并无显着性差异.各剂量组的 uA均能增强吞噬指数,对吞噬率的影响无显着性差 异(表2). Table2Theimmunomodulatoryeffectofursolicacidinimmunosuppression mice(?,n一10) GroupSIIL-2(pg/mL)IL-6(pg/mL)PhagocyticratePhagocyticindexHemo lysinP]1)一 Control1.199士0.06615. 940士5.163$813.124士410.8770.398士0.0331.081士0.106392.083 士20.0690.944士0.032 Cy100mg/kg0.795士O.050?21.5705:8.425073.4675:36.39O?0.2925:0.O44?0.5445:0. 072?132. 3085:11.323?0.4295:0.O32? CylO0mg/kg0.9905:0.054??58.882士11.O620??140.091士77.929A0.3145:0.0340.7155:0.096AA245.9645:28. 195AA0. 5735:0.043~,A +UA25rag/kg 蜘加I_蓍 圣 , .m.. 一 6期冯英杰,任会勋,袁育康,等.熊果酸免疫调节作用的初步研究543 3讨论 本研究结果显示UA对正常小鼠细胞免疫和体 液免疫功能的影响有很大的不同,并且UA的免疫 调节作用与剂量相关.在较低剂量时UA增强细胞 免疫,抑制体液免疫,使免疫功能向Th漂移,但在 高剂量时UA表现出对免疫功能的整体抑制.国外 学者研究发现UA在很低的浓度时(1.25/,g/mL)能 强烈地刺激人外周血单个核细胞(PBMC)分泌干扰 素一”/(INF一7)[1引,董兴高等[1最近的研究证实UA 在较高浓度(20/~mol/L)时能够抑制PBMC分泌 INF一7和IL一2.这些结果与本研究从不同层次验证 了UA的免疫调节作用,不同浓度的UA可以发挥 不同程度甚至相反的作用.我们认为UA在较低剂 量时可能是通过下调IL一6的水平来抑制体液免疫功 能,IL一6在体内可抑制Th细胞的分化,它通过活化 sTAT3致使sOC1基因的表达,从而抑制IFN一丫 的信号途径,使Th细胞分化受阻[1,uA下调IL一6 的水平,上调IL-2的水平从而使免疫功能向Th漂 移.另外UA在中剂量时仍可增加IL-2的分泌但T淋 巴细胞的转化功能已经被抑制,这提示还有其他因素参 与了调节,抑制了T淋巴细胞的增殖.UA还可以增强 非特异免疫功能,表现为巨噬细胞吞噬功能的增强. 对免疫功能低下小鼠,UA能显着改善其细胞免疫 和体液免疫功能.各剂量组均能增强由环磷酰胺所造 成的抗体形成功能低下,提高血清溶血素水平,增加血 清IL-6的水平,其中以中剂量组效果最为显着;T淋巴 细胞增殖转化功能增强,刺激指数显着性升高.但对于 淋巴细胞培养上清中的IL-2水平,在低剂量时表现出非 常显着的促进作用,而中,高剂量组并不能对抗环磷酰 胺毒性所导致的其分泌减少,与对照组相比并无显着性 差异.总之UA对于细胞免疫功能的影响是多种因素 作用的,对于正常小鼠,UA在中剂量时使IL-2水平升 高但抑制T淋巴细胞转化,而对于环磷酰胺致免疫功能 低下小鼠,UA在中,高剂量时不能增加IL-2水平却能 使刺激指数升高,促进T淋巴细胞的增殖转化.因此认 为UA的这种调节作用并非IL-2单一因素,很可能是多 种细胞因子的调节网络,这需要进一步研究来证实.对 于非特异免疫功能,各剂量组的UA均能增强吞噬指 数,对吞噬率的影响无显着性差异.国外学者发现UA 能够通过抑制NF-v.J3的活化来减少细菌脂多糖(LPS) 诱导的巨噬细胞的NO,诱生一氧化氮合酶(iNOS)和可 诱生的环氧合酶的表达.随后又发现UA在没有LPS 的情况下能够通过活化NF-~B来上调静止巨噬细胞 iN()smRNA和TNF-amRNA表达从而增加NO和 TNF-a的产生.这些研究表明UA对不同活化状态的巨 噬细胞发挥不同的作用口引.在本研究中UA对于非特? 异性免疫功能的影响,在正常和免疫低下机体中均可增 强吞噬指数.我们还发现UA对于免疫功能低下小鼠 的免疫功能各指标的作用均不呈剂量依赖性增加. 人体免疫系统的正负调节因素相互制约,除了免 疫系统中免疫细胞,免疫分子之间相互调节外,免疫 系统和神经系统,内分泌系统之间也相互调节,因此, uA对神经,内分泌系统的影响也值得进一步研究. 近几年国内外学者证实了UA的抗肿瘤作用,在肿瘤状 态下,机体的免疫功能受到抑制,尤其是细胞免疫功能, 如果能使机体处于Th,的优势状态下,机体能更有效的 对抗肿瘤.对于肿瘤状态下的机体,熊果酸是否能表现 出Th,的优势状态仍需进一步的实验研究. 参考文献: [1]王鹏,吴忠.熊果酸在药用植物中的分布及药理作用[J].中药 材,2000,23(11):717-721. 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