发酵过程的工艺控制

发酵过程的工艺控制 第十章 发酵过程的工艺控制 ? 知识要点和教学要求 (1)、理解微生物发酵的动力学 (2)、掌握 补料分批培养 (3)、掌握连续培养 (4)、掌握发酵工艺控制最优化 (5)、掌握温度对发酵过程的影响及其控制 (6)、掌握PH值对发酵过程的影响和控制 (7)、掌握泡沫对发酵过程的影响和控制 ? 能力培养要求 通过本章节的学习，学生能理解微生物发酵的分类及温度、PH值、泡沫等对发酵过程的影响和控制。 ? 内容 10.1 微生物发酵的动力学 一般来说，微生物学的生长和培养方式可以分为分批培养、连续培养和补料分批培养等三种类型。 1. 分批培养 分批培养又称分批发酵，是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。 在分批培养过程中，随着微生长细胞和底物、代谢物的浓度等的不断变化，微生物垢生长可分为停滞期、对数生长期、稳定期和死亡期等四个阶段，图10-1为典型的细胞菌生长曲线。 2. 停滞期 停滞期是微生物细胞适应新环境的过程。 1 实际上，接种物的生理状态和浓度是停滞期长短的关键。如果接种物处于对数生长期，那么就很有可能不存在停滞期，微生物细胞立即开始生长。反过来，如果接种物本身已经停止生长，那么微生物细胞就需要有更长的停滞期，以适应新的环境。 3. 对数生长期 处于对数生长期的微生物细胞的生长速度大大加快，单位时间内细胞的数目或重量的增加维持恒定，并达到最大值。其生长速度可用数学方程示: 式中，x---细胞浓度(g/l);t---培养时间(hr);---细胞的比生长速度(1/h)。如果当t=0时，细胞的浓度为x0(g/l)，上式积分后就为: 于是，用微生物细胞浓度的自然对数对时间作图，就可得到一条直线，该直线的斜率就等于。 微生物的生长有时也可用“倍增时间”(td)来表示，“倍增时间”(td)定义为微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间，即: 3. 稳定期 由于细胞的溶解作用，一些新的营养物质，诸如细胞内的一些糖类、蛋白质等被释放出来，又作为细胞的营养物质，从而使存活的细胞继续缓慢地生长，出现通常所称的二次或隐性生长。 4. 死亡期 当发酵过程处惊天动地死亡期时，微生物细胞内所储存的能量已经基本耗尽，细胞开始在自身所含的酶的作用下死亡。 5. 微生物分批培养生长速度的动力学方程 2 分批培养过程中，虽然培养基中的营养物质随时间的变化而变化，但通常在特定条件下，其比生长速度往往是恒定的。在特定温度、PH值、营养物类型、营养物浓度等条件下，微生物细胞的比生长速度与限制性营养物的浓度之间存在如下的关系式: 式中，---微生物的最大比生长速度;S---限制性营养物质的浓度;Ks---饱和常数，数值上等于=时的限制性营养物质浓度，它的大小表示了微生物对营养物质的吸收的亲和力大小，Ks越大，表示微生物对营养物质的吸收亲和力越小，反之就越大，对于许多微生物来说，Ks值是很小的，一般为0.1-120mg/l或0.01-3.0mmol/l，这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力。表10-3为一些微生物的Ks值。最大比生长速度在工业生产上有很大的意义，随微生物种类和培养条件的不同而不同，通常为0.09-0.65h-1。一般来说，细菌的大于真菌;而就同一细菌而言，培养温度升高，增大;营养物质的改变，也要发生变化，通常容易被微生物利用的营养物质，其较大，随着营养物质碳链的逐渐加长，则逐渐变小。习惯上上式称为Monod方程。 6. 分批培养时微生物细胞的生长与产物形成的动力学 在微生物的生长和产物的形成过程中，发酵培养基中的营养物质被微生物细胞所利用，生成细胞和形成代谢产物，人们常用得率系数来描述微生物生长过程的特征，即生成的细胞或产物与消耗的营养物质之间的关系。在实际工作中，最常用的是细胞得率系数(YX/s)(YP/s)，分别定义为消耗1g营养物质生成的细胞的克数和生成产物的克数。工业生产上，可通过测定一定时间内细胞和产物的生成量以及 3 营养物质的消耗量来进行计算，获得表观得率系数: 按产物的生成与营养物质的利用之间的关系，可将发酵分为三种类型，如表10-4所示。 表10-4产物的生成与营养物质的利用关系 类型 产物的生成与营养物质的利用的关系 发酵的例子 产物形成直接与营养物质的利用有关 乙醇发酵 产物形成间接与营养物质的利用有关 柠檬酸的发酵 产物形成表面上与营养物质的利用有关 青霉素的发酵 在微生物的分批培养中，产物的形成与微生物细胞生长关系的动力学模式有三种，如图10-4表示营养物质以化学计量关系转化为单一产物(P)，产物形成速度与生长速度的关系。 7. 产物形成与细胞生长相关联模式 在该模式中，产物形成速度与生长速度的关系可表示为: 式中，P---产物浓度(g/l);---产物相对于细胞的生成速度(克产物/克细胞)。上式表示，在微生物的分批培养过程中，产物的形成速度与细胞的比生长速度成正比。因此，对于符合该模式的培养过程来说，要提高产物的形成速度就应当争取获得高的细胞的比生长速度。 8. 产物形成与细胞生长无关联模式 在该模式中，产物形成速度与生长速度无关联，而只与细胞的浓度有关，此时，细胞具有控制产物形成速度的组成酶系统，这时产物形成与细胞浓度的关系可表示为: 式中，---非生长关联的产物形成常数[g产物/(g细胞hr)]。 9. 产物形成与细胞生长有关联和无关联的复合模式。 在此模式中，产物形成取决于与细胞生长有关联和无关联的两种 4 形式，这时，产物形成与细胞生长的关系可表达为: 10.2 补料分批培养 补料分批培养是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法，又称半连续培养或半连续发酵，是介于分批培养过程与连续培养过程之间的一种过渡培养方式。目前补料分批培养已在发酵工业上普遍被用于单细胞蛋白、氨基酸、抗生素、维生素、酶制剂、有机酸以及有机溶剂等的生产过程。 1. 补料分批培养的类型 补料分批培养的动力学 单一补料分批培养 单一补料分批培养是补料分批培养中一种类型，其特点是补料一直到培养液达到额定值为止，培养过程中不取出培养液。 2. 补料分批培养的优点 补料分批培养是介于分批培养和连续培养之间一种微生物细胞的培养方式，它兼有两种培养方式的优点，并在某种程度克服了它们所存在的缺点。表10-7为补料分批培养的一些优点。 表10-7补料分批培养的一些优点 与分批培养方式比较 与连续培养方式比较 1`可以解除培养过程中的底物抑制、产物的反馈抑制1不需要严格的无菌条件; 和葡萄糖的分解阻遏效应; 2不会产生微生物菌种的老 2对于耗氧过程，可以避免在分批培养过程中因一次化和变异; 性投糖过多造成的细胞大量生长、耗氧过多以至通风搅3最终产物浓度较高，有利拌设备不能匹配的状况;在某种程度上可减少微生物细于产物的分离; 胞的生成量、提高目的产物的转化率; 4使用范围广。 3微生物细胞可以被控制在一系列连续的过渡态阶 段，可用来控制细胞的质量;并可重复某个时期细胞培 养的过渡态，可用于理论研究。 5 10.3 连续培养 连续培养是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的液量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物培养方式。连续培养又称连续发酵，它与封闭系统中的分批培养方式相反，是在开放的系统中进行的培养方式。图10-6为典型的实验室连续培养系统。 表10-8连续培养过程的优缺点 连续培养方式的优点 连续培养方式的缺点 1提供了一个微生物在恒定状态下高速生长的环1在长时间的培养过程中，微生物菌境，便于进行微生物的代谢、生理、生化和遗传特性种容易发生变异，发酵过程易染菌; 的研究; 2新加入的培养基与原有的培养基不 2在工业生产上可减少分批培养中每次清洗、装易完全混合，影响培养和营养物质的利料、消毒、接种、放罐等操作时间，提高生产效率; 用。 3产物质量比较稳定; 4所需的设备和投资较少，便于实现自动化。 10.4 发酵工艺控制最优化 在特定的发酵生产过程中，生产效率的高低取决于工艺和工艺控制的最优化，即能否实现生产过程内的最优化控制生产过程最优化控制的实现，包含了从明确目标到目标值实施等全部内部。 明确控制目标 明确影响因素 确定实现目标值的方法 确定最佳工艺 实施最佳工艺 10.5 温度对发酵过程的影响及其控制 温度对微生物细胞的生长和发酵代谢产物的影响 6 由于微生物的生长和产物的合成代谢都是在各种酶的催化下进行的，而温度却是保证酶活性的重要条件，因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境。温度对发酵的影响是多方面的，对微生物细胞的生长和产物的生成、代谢的影响是由各种因素综合表现的结果。 温度对微生物的影响 温度和微生物生长的关系，一方面在其最适温度范围内，微生物的生长速度随温度的升高而增加，发酵温度越高，培养的周期就越短;另一方面，处于不同生长阶段的微生物对温度的反应是不同的。 从对微生物细胞内的酶反应的影响来看温度可以通过改变培养液的物理性质。温度还会影响到微生物细胞的生物合成方向。 对于同一微生物细胞 细胞生长和代谢产物积累的最适温度也往往是不同的。 1. 发酵热 发酵过程中，随着微生物细胞对培养基中的营养物质的利用、机械搅拌的作用，将会产生一定的热量;同时由于发酵罐壁的散热、水分的蒸发等将会带走部分热量。习惯上将发酵过程中释放出来的引起温度变化的净热量称为发酵热。发酵热包括了生物热、搅拌热、蒸发热以及辐射热等。 2. 生物热(Q生物) 微生物细胞在生长繁殖过程中本身产生的大量热成为生物热。 3. 搅拌热(Q搅拌) 7 对于机械搅拌通气式发酵罐，由于机械搅拌带动培养液作相应的比较剧烈的运动，造成液体之间、液体与搅拌器等设备之间的摩擦，会产生比较可观的热量。 4. 蒸发热 在通气培养过程中，空气进入发酵罐后就与发酵液进行广泛的接触，除部分氧等被微生物利用外，大部分气体仍旧从发酵液出来，排放至大气中，必然会引起热量的散发，热量将被空气或蒸发的水分带走，这些热量就称为蒸发热。 4. 辐射热(Q辐射) 辐射热是指因发酵罐温度与环境温度不同，而使发酵液通过罐体向外辐射的热量。 发酵过程温度的控制和最适温度的选择 10.6 PH值对发酵过程的影响和控制 发酵过程中培养液的PH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是发酵过程中的重要参数，对微生物的生长和产物的积累有很大的影响。 1. PH值对发酵过程的影响 微生物细胞生长和代谢产物形成的最适PH值 PH值对微生物的生长繁殖和代谢产物的形成的影响的原因 发酵过程中PH值的变化情况 发酵过程中PH值的控制 在实际生产中，调节和控制发酵液PH值的方法应根据具体情况 8 加以选择。PH值调节和控制的方法主要有: 调节培养基的原始PH值，或加缓冲溶液(如磷酸盐)制成缓冲能力强、PH值变化不大的培养基，或使盐类和碳源的配比平衡。 可在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行PH值的调节，进而合理地控制发酵条件;也可通过调整通风量控制PH值。 如果仅用酸或碱调节PH值不能改善发酵情况时，进行补料是一个较好的办法，它既调节了培养液的PH值，又可补充营养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步提高发酵产物的产率。通过补料调节PH值来提高发酵产率的方法已在工业发酵过程中取得了明显的效果。 采用生理酸性铵盐作为氮源时，由于NH+4被微生物细胞利用后，剩下的酸根会引起发酵液PH值的下降，在培养液中可加入碳酸钙来调节PH值。但是需要注意的是，碳酸钙的加入量一般都很大，在操作上很容易引起染菌。因此，此方法在发酵过程中应用不是太广。 在发酵过程中根据PH值的变化可用京戏加氨水的方法来调节，同时又可把氨水作为氮源供给。由于氨水作用快，对发酵液的PH值波动影响大，应采用少量多次的流加方法进行流加，以免造成PH值过高，从而抑制微生物细胞的生长，或PH值过低，NH+4不足等现象。具体的流加方法应根据微生物的特性、发酵过程的菌体生长情况、耗糖情况等来决定，一般控制在PH值7.0-8.0，最好是采用自动控制连续流加方法。 以尿素作为氮源进行流加调节PH值，是目前国内味精厂普遍采 9 用的方法。尿素流加引起的PH值变化有一定的规律性，易于控制操作。由于通风、搅拌和微生物细胞内脲、酶的作用使尿素分解放出氨，使PH值上升;同时氨和培养基中的营养成分被微生物利用后和补充氮源。当流加尿素后，尿素被微生物的脲酶分解放出氨，使PH值上升，氨被微生物利用和形成代谢产物，使PH值降低，再次反复进行流加就可维持一定的PH值。流加时除主要根据PH值的变化外，还应考虑到微生物细胞的生长、发酵过程耗糖、代谢等不同的阶段采取少量多次流加，以控制合适的发酵PH值。 目前已有适合于发酵过程PH值的测量的电极，连续测量并PH值的变化，用于控制和监测发酵PH值。 2. 泡沫对发酵过程的影响和控制 发酵过程中泡沫的产生及其对发酵过程的影响 使发酵罐的装填系数减少; 造成大量逃液，导致产物的损失; 泡沫“顶罐”有可能使培养基从搅拌的轴封渗出，增加了染菌的机会; 由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期微生物随泡沫漂浮或粘附在罐盖或罐壁上，命使微生物生长的环境发生了改变，影响了微生物群体的效果，增加微生物群体的非均一性; 影响通气搅拌的正常进行，妨碍了微生物的呼吸，造成发酵异常，导致最终产物产量下降; 使微生物菌体提早自溶，这一过程的发展又会促使更多的泡沫生 10 成; 为了将泡沫控制在一定范围内，就需加入消泡剂，将会对发酵工艺和产物的提取带来困难。 因此，如何控制发酵过程中产生的泡沫，是否能使发酵过程得以顺利进行和取得高产、高效的重要因素之一。 发酵过程中泡沫的产生有两个原因:1由外界引进的气流被机械地分散形成;2由发酵过程产生的气体聚结生成的发酵泡沫。培养基的物理化学性质对泡沫形成的表面现象起决定性作用，此外，培养液的温度、酸碱度、浓度等对发酵过程的泡沫形成也有一定的影响。 3. 发酵过程中泡沫的消除和控制 4.化学消泡 化学消泡的机理 化学消泡剂的性能和工业上常用的化学消泡剂种类 化学消泡剂的应用 5.机械消泡 机械消泡不同于化学消泡，它是靠机械强烈振动和压力的变化，促使气泡破裂，或借助于机械力将排出气体中的液体加以分离回收，从而达到消泡的作用。机械消泡的优点是不需在发酵液中加入其他物质，减少了由于加入消泡剂所引起的染菌机会和对后继分离工艺的影响。但是机械消泡的效果不如化学消泡迅速、可靠，不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素，同时它还需要一定的设备和消耗一定的动力。 11 理想的机械消泡的装置必须满足动力消耗少、结构简单、坚固耐用、清洗杀菌容易、维修保养费用少等几个条件。 机械消泡的方法有罐内消泡和罐外消泡两种，即在发酵罐内将泡沫消除或将泡沫相出发酵罐外，消除后再将液体返回发酵罐内等两种。罐内消泡可以通过分耙式消泡桨、旋转圆板式、气流吸及式、冲击射板式、碟式及超声波等机械消泡装置来实现;而罐外消泡则可以通过旋转叶片式、喷雾式、离心式及转向式等机械消泡装置来实现。 罐内机械消泡 耙式消泡桨的机械消泡 旋转圆板式的机械消泡 流体吹入式机械消泡 气体吹入管内吸引消泡 罐外机械消泡 旋转叶片罐外机械消泡 喷雾消泡 离心力消泡 旋风分离器消泡 转向板消泡 流加补料的控制 流加补料是指在发酵过程中补充某些营养成分以维持生产菌的代谢活动和合成产物的需要。这种工艺的明显效果是使生产菌的自溶期被推迟，而生物合成期则得到了延长，可维持较高的产物增长幅度 12 和增加发酵液的总体积，从而使产量大幅度上升，对发酵单位或含量的提高起着重要的作用。同时，流加补料还可以作为工业生产上纠正发酵异常的一种手段。 6. 流加补料的内容和原则 流加补糖的控制 流加补料是生产过程中较为灵活控制微生物中间代谢的一种，不同微生物或同一微生物的培养条件不同，控制方法也有差异，需要根据具体情况，通过试验确定最适的控制方法。当然在流加补料中应注意料液配比要适当、加强无菌控制、注意培养基的碳氮平衡和经济核算等各种因素。 13