生物素标记的DNA探针检测葡萄球菌肠毒素B基因

生物素标记的DNA探针检测葡萄球菌肠毒素B基因 生物素标记的DNA探针检测葡萄球菌肠毒 素B基因 :一 中华医学检验杂志1999年9月第22卷第5期ChiDJMedISei 生物素标记的DNA探针检测葡萄球菌 肠毒素B基因 / 壹芝墨生晁福寰王红勇姜永强尚继栋 【摘要】目的建立一种灵敏度高,特异性好的DNA探针检测葡萄球菌肠毒素B基因方法.方 法用聚合酶链反应(PCR)扩增的方法进行葡萄球菌B型肠毒素基因探针生物素标记,用制备好的 基因探针,进行斑点杂交,对葡萄球菌肠毒素10株标准株和39株临床株分别进行了检测.结果探 针灵敏度为250Pg.检测模板灵敏度为0.98ngo对西安,济南,北京等地临床分离株,进行PER和斑点 杂交方法的比较,阳性符台率达到100%.结论用PER扩增的方法标记生物素基因探针,建立斑点 杂交的方法,为葡萄球菌肠毒素B基因的诊断提供了科学依据. 【关建词】箩昝握钍塞醚照 肼^pr0be删袖bi0血fdetection0f印^0口c删幻哪蚴B窖岫eZ.h/@m',皿口 ,删0Fu,hum,o1.础u耙Her/&En,2/ronment~Medii~,Academy胁‰Msd/~g &,n300050 【A恻1ObjedlteToeslabllshasensitivesadspecificgene咄methodfordetec6on0f stfroc哪l眦【el岫BI皿B)gene.Metb0凼C,ene呻belabeledwithbibyPCR哪detecteddot b曲doI1,sad日ep蛐ly10山rdsuaimsad39clinical~pcclmensd~cted.?? Thesensitivity 0f靴0.25Ilgl0f?as0.98【lg.h~idmtion"aithPcR methodon眦0feliI】jcBl印础HfromXiaI】,Jinan.i丑gTlleacr咖0fp0嘶椰 100%.啊dI?1l】ehybddlzafiontIlbj劬1l蛐pr0bePcR|臣旦IIjc丑lb蛆for thedi?.鸺iB0f皿Bgene. 【脚words】sta咖0cDNAbes蹦ylnmchaiIIIe日cli? 葡萄球菌肠毒素是引起食物中毒和医院感染的 重要病原,肠毒素B基因还是生物战剂的主要毒素 之一_1J,因此,检测金黄色葡萄球菌(金葡菌)产毒基 因具有重要意义.肠毒素的检测有生物学和免疫学 方法,近年来又发展基因探针的检测方法,由于放射 性同位素标记探针的半衰期短及放射污染等缺点, 限制了该技术的推广应用.我们用聚合酶链反应 (ecr)扩增的方法进行了生物素标记DNA探针,生 物素标记的DNA探针与固化在硝酸纤维素膜上的 检测金 葡萄球菌肠毒素B(sEB)基因进行斑点杂交, 葡菌产毒基因,克服了同位素探针固有的缺点.报 告如下. 本课受军事医学科学院创新基金资助 作者单位:300050天津,军事医学科学院卫生学环境医学研究所 (高志贤,晁福寰,王红勇);军事医学科学院微生物流行病研究所(郏 玉玲,姜永强,尚继栋) 281 . 论着 . ?// }?, 材料和方法 一 ,材料 1.仪器及试剂:PE-2400PcR扩增仪,为美国PE 公司产品;杂交炉为美国产品;凝胶成像系统为 Kodak公司产品.Bio-11-dtrrP购于北京医科大学药 学院;1DNA聚合酶叫ne产品;硝酸纤维素膜 (Nc膜),溶葡萄球菌素为Sigma公司产品;琼脂糖 凝胶,为Spain公司产品. 2.菌株:标准菌株由美国威斯康辛大学Bergdoll 教授惠赠,l临床菌株为西安,济南,北京地区临床分 离菌株. 二,PCR扩增制备生物素标记的SEBDNA探针 1.引物设计:根据文献报道并通过计算机系统 设计一对引物,由军事医学科学院生物研究所 合成并纯化,引物的碱基序列为:上游引物5. TACGTAGATGTGTITGGA-3;下游引物5'-ATA?T. ATCTAATrC.GTI'-3. #医学检验朵志l年9只第篮巷第5期clIiILjM山Sei,Seotemberl9,?2:2,'No.5 2.金葡菌染色体DNA的制备:将甘油冻存的金 葡菌的FRIS6,243,FRllC~O,1091,1093FRI216等标 准菌株及临床菌株活化后,接种5oIIll液体培养基 (每5OOg培养液含:蛋白胨10g,酵母粉20g,NaC1 2.5g,}]PO40.5g,KH2P040.5g,ragso40.1g,CaCI2 0.05g,於酸005g),37摇床培养16,l8小时后, 8000r/min,离心5分钟,收集菌落,菌体用生理盐 水洗过后,用溶葡萄球菌剂悬菌(100ml含NaC1 0.584g,Tris0.48g,NaOH0.16g,EDTA1.86g),加 适量的溶葡萄球菌素,37水浴至菌悬液粘稠,加入 等体积4-%SDS-IO0mmol/LTfis裂解液,室温下作用 并不时振荡,约3O分钟后加入等体积饱和酚混匀, 室温15分钟稍加振荡,4?12000r/rain,离心3O分 钟,吸取上层水相,此水相反复用酚抽提2次后,吸 水相加0.1体积3mol/LNaAC(pH5.5)及2倍体积 的一2o预冷的无水乙醇,混匀后,放置于一2o, 至少1小时后,412000r/min,离心1O分钟,小心 弃去上清液,灭菌去离子水溶解DNA,用紫外分光 光度计定量后,置于一20?备用. 3.PCR反应体系为:引物4(0.05tmaol/L), 10×PCR缓冲液5,&~ITP1.8(O.025/~nol/L)+ dUTP2.5(O_o1mnol/L),模板1ptl,无菌去离子水 35.3,DNA聚合酶4U. 4.方法:在PCR扩增的同时,进行DNA生物素 标记,即将Bio-11-dIJTP掺人到PCR扩增产物中,扩 增时生物素化的dUTt'与dTrP的比例为1:3代替 dTrl?.具体扩增步骤:94qC预变性3分钟,94qC变性 3O秒,56~C退火3O秒,72?延伸30秒,共35个循 环,72%延伸1O分钟. 5.扩增探针检测与纯化:取扩增产物40加 入含EB的2%的低熔点琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯 下判断扩增结果并将其用消毒的手术刀切下.将切 下含有扩增产物的低熔点琼脂糖凝胶放在1.5ml 的Eppendorf管内,在65?的水浴中化胶,然后加入 等体积的平衡好的苯酚,摇匀,8000r/min离心5分 钟,然后加1/10体积的3mol/LNaAC和两倍体积冷 的无水乙醇,放人一加?冰箱放置2小时,然后,4? 12000r/rain离心10分钟.再用70%的乙醇洗,之 后,4?12000r/rnin离心5分钟.Eppendorf管倒置 投有水珠,之后用TE稀释,用紫外分光光度计定 量,用时在IO0~C拂水中煮5分钟,使DNA完全变 性. 三,生物素标记的DNA探针杂交棱测 在5x5硝酸纤维素膜用标尺画格,用去离子水 浸泡1O分钟,之后,再用2×SSC(O.3mol/LNaCl, O.03mobil柠檬酸钠,1Omol/LNaOH)浸泡30分钟, 晾干后,将此膜放在琼脂糖凝胶的平板上,将不同稀 释度的标准品或不同样品点在膜上,凉干后,放入杂 交炉在1200J能量下进行交联,之后放在干燥器中 备用.下步骤参考文献[4.8]进行. 结果 1.杂交体系及反应条件优化:在杂交体系及条 件优化试验中,探针是采用PCR扩增出169bD的生 物素标记DNA片段,其浓度为50ng/ml;杂交体系 中用了5o%的去离子甲酰胺和加%的硫酸葡聚糖; 预杂交及杂交温度为30qC;预杂交及杂交时问为4 小时及16小时. 2.生物素探针的灵敏度检测:将制备好的生物 素探针,进行倍比稀释,其探针的浓度分别为 125ng,62.5ng,31.3ng,15.7llg,7.85ng,3.93ng, 1.97ng,0.98ng,0.49rig,0.25ng,点膜后直接封闭, 酶联和显色.生物素探针摄低可以检测到250嵋. 3.杂交检测的特异性和灵敏性:将待测的产 SEA(FRI100,1000),产SEB(FItIS6,243),产SEC (FRI10931101,1091),SED(FP,I216,472,419)不同标 准株的染色体DNA浓度梯度+按倍比稀释的方法, 进行稀释,临床株不经稀释,点膜后进行杂交检测. 经过多次杂交,由杂交试验结果可知,产SEB的标 准株的DNA和其他肠毒素的DNA均是阴性,说明 无交叉反应,明了本方法的特异性较好.其摄低 检测限为0.98ng,由此可见灵敏度也较高. 4.样品检测及方法比较:试验采用PCR法,斑 点杂交法对西安,济南,北京地区39株临床分离菌 株进行了检测,结果两者检出阳性符合率为100%. 说明用生物素标记的DNA探针检测SEB基因 的方法是可行的,可以运用于临床检验. 讨论 分子杂交过程,就是DNA复性的过程.只是 DNA来源不同,只要待测DNA样品中存在与加入的 DNA探针同源互补序列,在一定条件下,就可以形 成异源DNA双链.在形成DNA双链的过程中,DNA 探针分子量的太小和浓度直接影响杂交速度,DYA 探针分子量越太,扩散越慢,也难于形成正确配对. 因此.杂交速度较慢也就是说探针长短影响杂交 中华医学检验杂志1999年9月第22卷第5期ChinJMedLabSci 速度,探针片段越长,其扩散的速度越慢,杂交速度 越慢,因此,本试验我们选择了169bp的DNA片段. 由于DNA探针浓度直接影响到DNA单链间碰撞的 机率,DNA探针浓度越太,杂交速度越快,本试验我 们采用探针浓度为50n?d.其次,温度的高低也 直接影响杂交,温度过高,不利于杂交,甚至出现假 阴性结果;而温度过低,则少数碱基配对形成的局部 双链不易解离,难以继续寻找正确配对.由于甲酰 胺可以干扰碱基的堆积力和氢键的形成,降低T值, 50%的甲酰胺可以使Tm降低30?.本试验采用了 50%的甲酰胺,结果表明,预杂交及杂交温度3O? 时,试验结果较好.另外,离子强度过低,不利于杂 交,在高盐浓度下,其结合能力在硝酸纤维素膜上, 结合能力达80—100t~cm2,因此,采用0.15,1.0 me//盐溶液中进行杂交研究.再者,硫酸葡聚糖, 能促进DNA链间的结合,其微粒的表面可吸附DNA 探针分子,从而使DNA接触面积增大,有利于杂交, 20%硫酸葡聚糖存在时,杂交速度可提高LO,2o 倍.本试验采用了20%硫酸葡聚糖用来提高杂交 速度. 在本试验中,我们采用PCR扩增的方法,制备 了生物素探针,优越于Notermans[和NeillEs利用放 射性同位素标记合成寡核苷酸制备的探针,克服了 同位素探针的固有缺点,易于推广应用,具有良好的 前景.尤其是在pcR应用于临床检测其价值还不 能肯定的情况下,应用生物素标记基因探针进行斑 点杂交,操作安全,方便,无需特殊设备,灵敏度和特 异性都较好,作为一种微生物诊断手段也是可取的, 本法也为我们下一步SEB基因传感器的构建提供 了一些试验依据. 参考文献 1雷祚荣.葡萄球菌毒紊和葡萄球菌毒紊病北京:中国科学技 术出版社.1992120-140. 2尚世强,洪文澜,俞意民.等.细菌DNA的聚台酶链反应扩增及 反相杂交初步分型.中华医学检验杂志,1998.21:281—284 3杨正林,杨瑚馥,杜琼等聚合酶链反应一般孔板杂交技术用于结 核分枝杆菌的检测中华医学检验杂志.1998,21:285-287 4汪晓辉.郭兆彪,张敏丽,等.用随机扩增DNA多志性制备李斯 特菌属特异探针.中华医学检验杂志,1998.21:291-293 5金冬雁,黎孟枫,等.译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科 学出版社,1996483-490. 6卢圣栋.理代分子生物学实验技术北京:高等教育出版社, 19932】1一. 7N0l目加蛐S,HeuvemmaKJ.】蚰K.S哪tbdic目nBDI~'A p10b曲fardelecfioaof拍cSt~hylecaectmaureua啦血b.APpl EnviamMJczolfio1.19明,54:531-533 8dlRJ.Famai~GR.Ddah~F,ela1.伽de0bfor deteelim皿d慵幽Staplaylecaectmmlreus曲o0nl nI?日呲?^,B,andCandtoxicshockD如Detofin1.J cIiDMicr~io1.1990,28:1514-1518. (收稿:1999-03.10修回:1999417—14) (本文编辑:毛家都) 粪肠球菌引起感染性心内膜炎一例 戎建荣王淑峰 粪肠球菌引起感染性心内膜炎较少 见,1998年IO月23日.我们从1侧重度 二尖瓣关闭不全合并细菌性心内膜炎患 者的二尖瓣前叶螯生物中分离培养出1 株粪肠球菌,报告如下: 患者,女,2l岁.因心脏杂音,咳嗽 加尉就诊.超声心动图符合二尖瓣关闭 不全.施行二尖瓣替换术.切开左心房 作者单位030012山西省人民医院检验 科(戎建荣);山西医科大学第一附属医院检 验科(王赦峰) 后二尖瓣前叶有螯生物.病理结果:中 性白细胞侵润,肉芽组织形成.纤维素中 混有坏死组织和大量细菌.随即取材培 养为粪肠球菌. 细菌学鉴定:羊血平板上菌落细小 无色,湿润光滑,n溶血,边缘整齐.涂 片为革兰阳性球菌,短链状,转种肉汤呈 混浊生长.麦康凯培养基生长. 生化反应;触酶,山梨糖阴性;胆汁 七叶苷,甘露醇,阿拉伯糖,6.5%NaCI肉 汤均阳性.据文献[1,2初定为粪肠球 菌,经VrlEK32法国生物梅里埃公司细 . 案例报告 菌仪GPI卡鉴定为粪肠球菌.鉴定 值为99%. 术后根据药敏试验给予氧哌嗪西林 治疗.3周后痊禽出院. 参考文献 主编临床鞭生物诊断学.第8 1蕖文诚. 版.南京:东南太学出版社,1998.305—332 2孔簧林.主编.实用临床细菌鉴定云 南:云南科技出版社,199730-32. (收稿:1999411-06修回:19994)3.24) (本文编辑:毛家都)