淀粉酶活力测定实验报告

淀粉酶活力测定实验报告 篇一:实验二 淀粉酶活性测定预习报告 生物化学实验预习报告 实验二酶活力测定的研究(1) ——淀粉酶活性的研究 一、研究背景 酶即由活细胞产生的一类有催化活性的生物大分子，大多数由蛋白质组成(少数为RNA)，它是细胞赖以生存的基础，细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。酶的催化具有高效性、专一性、可调节性以及需要温和的条件。酶的催化活性受外界条件的影响，如温度、pH、离子强度、激活剂、抑制剂等均会使酶活性发生改变。另外，酶在工业生产及生活中应用广泛，如酱油、食醋以及酿酒工业都需要酶的参与，洗衣粉加入酶增强去污能力等。酶活性的测定具有较强的实际意义，例如某些酶活性的变化可以引起特定的疾病，测定这些酶的活性可以作为疾病诊断的一个依据。 淀粉酶是水解淀粉糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的方式，可以分为α-淀粉酶与β-淀粉酶等。休眠的种子中只有β-淀粉酶存在，而α-淀粉酶在种子萌发过程中才形成。测定淀粉酶 的活性具有重要的意义，淀粉酶普遍存在于植物体内，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，其活性高低可以衡量种子萌发速率，也可以作为水稻抗逆性的生化指标(如干旱、盐、重金属胁迫)。本实验中我们通过学习经典的淀粉酶活力测定方法，具体的实验细节，从而获取酶活力测定的相关理念。 二、研究目标 1.掌握酶活力测定的一般思路与方法; 2.进一步熟练使用分光光度法测定物质浓度; 3.测定α-淀粉酶与β-淀粉酶的活性; 4.体会并掌握实验细节的与分析方法。 三、研究策略 两种淀粉酶的特性有所不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热，在70?15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力(原因分析见思考题6)。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力(α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力)，再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。另外，实验时分别设置对照组和测定组，从而排除无关变量的干扰。采用分光光度法测定产物麦芽糖的含量，计算出产物的生成速率，从而征出淀粉酶的活性。 四、研究及可行性分析 1.研究方案 (1)酶的获取 淀粉酶广泛存在于禾谷类的种子(特别是萌发后的种子)中，所以取萌发的小麦种子研磨浸提得到初始酶液。 (2)反应过程 α-淀粉酶耐高温，而β-淀粉酶在高温下易被钝化。可以在适当的高温下水浴处理，使β-淀粉酶失去活性的同时α-淀粉酶活性基本不受影响，与此同时，设置对照组以排除干扰因 素(如萌发种子中产生的麦芽糖)，对比测定组与对照组的差异，分解淀粉所得到的产物就可以认为是α-淀粉酶催化的产生，即可得到α-淀粉酶活力。另外，不做高温处理，在相同的测定条件下测量α-淀粉酶和β-淀粉酶的总活力，最终计算两者差值得到β-淀粉酶活力。 (3)产物检测(还原糖的3,5-二硝基水杨酸法) 淀粉水解产物为麦芽糖，在碱性条件下，麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，在一定范围内，麦芽糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，在520nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。 (4)酶活力计算 酶活力的大小与所催化反应的产物生成速率成正比。规定淀粉酶的活力单位为:每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数(mg麦芽糖?min-1?g-1鲜重)。以分光光度法测定产物麦芽糖的含量，计算出产物的生成速率，最终得到酶的活力。 2.可行性分析 就实验方案本身而言，利用两种酶的不同特性加以处理，钝化其一，测定另一种酶的活性，方案合理，简便易行，具有可操作性;实验材料(萌发小麦种子)可在实验室获得，所需各种试剂均为实验室常备试剂，温度控制可通过恒温水浴箱实现，分光光度计、离心机等仪器实验室都有，所用试管、研钵等器具实验室均可提供;实验所用时间约为3h(下文会粗略计算)，可在规定时间内完成，故时间上有可行性。综合以上各点，本实验具有很大的可行性。 3.预期实验结果 α-淀粉酶与β-淀粉酶活力均可通过本实验测得。 五、具体实验设计 1.实验仪器及试剂 722型光栅分光光度计、托盘天平、离心机、恒温水浴锅、具塞刻度试管、50ml容量瓶、研钵、石英砂、微量可调手动移液器、1%淀粉溶液、蒸馏水、pH5.6的柠檬缓冲液、3,5-二硝基水杨酸溶液(DNS)、麦芽糖标准液(1mg/ml)、0.4MNaOH溶液、萌发的小麦种子 2.实验步骤 (1)初始酶液的制取(30min) 2g萌发的小麦种子?少量石英砂，研磨至匀浆?少量多次用蒸馏水转移到50ml容量瓶至40ml?颠倒浸提15~20min?定容至刻度?混匀?3500r/min离心 20min?上清液 (2)α-淀粉酶活性的测定(50min) 取所制取的酶液5ml，放入100ml容量瓶中，定容至刻度，混合均匀得到稀释后酶液。 (4)麦芽糖含量的测定 α-淀粉酶活性(mg麦芽糖?min-1?g-1鲜重)=[(A-A’)×样品稀释总体积]/[样品总重(g)×5min]; (α-+β-)淀粉酶总活性(mg麦芽糖?min-1?g-1鲜重)=[(B-B’)×样品稀释总体积]/[样品总重(g)×5min]; A——α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度 A’——α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度 B——α-及β-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度 B’——α-及β-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度 3.实验所需时间预计 所用时间共计约3h。 4.某些试剂与操作的作用 (1)1%淀粉溶液淀粉酶的反应底物 (2)pH5.6的柠檬缓冲液提供和维持淀粉酶反应的最适pH 1使酶失去活性(对照组)2为还原糖的3,5-二硝基水杨酸反应(3)0.4MNaOH溶液?;? 3使对照组与测定组的处理保持一致，降低实验无关变量所造成的误差 提供碱性环境;? (4)3,5-二硝基水杨酸溶液显色剂，与麦芽糖反应，通过颜色变化深浅反映出麦芽糖含量 (5)麦芽糖标准溶液(1mg/ml)绘制标准曲线 (6)酶提取液70?恒温水浴15min 使β-淀粉酶活性丧失而α-淀粉酶活性不受影响 (7)酶液40?恒温水浴15min 在最适温度下，使酶的活性维持在最高状态 (8)淀粉溶液40?预热使底物的的温度与酶的最适温度相吻合，避免混合时温度发生变化导致酶的活性不在最高状态。 (9)酶与底物混合液40?恒温水浴5min 最适温度下，酶具最大活性与底物以恒定初速度反应生成产物 (10)α-及β-淀粉酶总活性测定时酶液的稀释总活性较高，分解淀粉速率较快，短时间内底物迅速减少，因而测定得到的便不是初速度，而稀释后降低酶的比活，便于测定 (11)产物与3,5-二硝基水杨酸沸水浴共热5min 使麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸在加热条(转载于:www.CDfdS.cOM 池 锝 网:淀粉酶活力测定实验报告)件下充分反应，显色充分，生成有色物质的量及颜色稳定 (12)测定吸光度前溶液稀释至15ml 低浓度下分光光度法对待测物质浓度的测定更加准确 5.误差分析 本实验中容易产生误差的地方有以下几个: (1)初始酶液的制取。为减小误差，应研磨充分，浸提充分，准确定容。 (2)进行钝化和保温这两步。因此，为了保证酶促反应时间的准确性，必须做到准确记录时间，尽量减小因各管保温时间不同 而引起的误差，同时恒温水浴温度变化不应超过?0.5?，以减少温度变化所引起的误差。 (3)显色的过程。显色需要加热15min，时间要严格控制，而且沸水浴的水位要高于试管中试剂的高度，因为显色程度与水温和加热时间有关系。 六、质疑及相关思考 1.酶活力测定时需要测反应的初速度，这就需要底物浓度要足够大且远远超过酶量，测定时间要在最初的几分钟内(底物转化量5%)。在本实验中，底物为2ml1%的淀粉溶液，测定反应时间为5min，这两个标准是如何确定的,而这些标准是否真的满足酶活力测定的要求, 2.本实验α-淀粉酶活性测定时是在70?恒温水浴15min，该条件下β-淀粉酶活性是否真的完全丧失，而α-淀粉酶活性是否完全不受影响,我想不能完全这么肯定，如果是这样的话，这些因素所带来的误差有多大,是不是可以忽略, 3.实验中显色时间控制为15min，我在其他资料上也看到有的将显色时间定为10min[1]，我们知道，显色时间过短，待测物质未与显色剂充分反应，显色不充分，会使测定结果偏低;若显色时间过长，生成有色物质可能会由于不稳定而被分解，也会使测定结果偏低。那么本实验最恰当的显色时间到底应该确定为多少, 4.关于β-淀粉酶活性的计算上，我们分别测定了α-淀粉酶活性以及(α-+β-)淀粉酶总活性，用二者的差值作为β-淀粉酶活性。 这个思路是否科学,因为我们不知道α-淀粉酶与β-淀粉酶之间是不是有协同之类的作用，也就是说当两者同时存在时可能会对彼此的活性产生影响，从而导致我们测量到的总活性并不是α-淀粉酶与β-淀粉酶各自单独存在时的活性之和。 七、思考题 1.酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么, 首先应该从生物材料中提取要测定的目标酶，可以通过分离纯化技术或者直接钝化与目标酶催化反应有关的其他酶的活性;其次由于酶促反应速率可用单位时间内底物消耗量或产物生成量来表示，但产物从无到有，浓度变化大，容易检测，故一般通过测定产物的生成量来计算酶的活力;最后要测定初速度，酶促反应进程曲线是双曲线，在最初数分钟的反应时间内产物的生成量才与时间成正比，因此只有初速度才能反映出酶的真实催化能力。 2.根据上述总体思路你认为在设计酶活力测定实验时，对结果可信性影响最大的是哪方面,为什么,在该项设计中要注意什么, 对结果可信性影响最大的就是测定的条件，即测定酶活力时必须在该酶的最适条件下进行。因为只有在最适条件下酶才具有最大的活性，我们才能够测得该酶所催化进行化学反应的最大反应速率。 1要选择合适的底物在设计最适条件时，应该注意以下几个方面:?(专一性不强的酶或 2选择合适的辅因子、者催化可逆反应的酶)，且底物浓度要足 够高，使酶达到饱和状态;? 3反应混合液的最适温度、pH、缓冲液种类及浓度、离子活化剂、变构剂的种类及浓度;? 4指示酶与辅助酶的种类和浓度(酶偶联法)5其他影响酶活性的因素，如抑制强度等;?;? 剂、氧化剂、表面活性剂等。 3.淀粉酶和转氨酶的作用各自有什么特点,在设计其酶活力测定的具体实验方案时你认为主要应该有哪些针对性的考虑, 篇二:实验三、淀粉酶活性的测定实验报告 实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热，70? 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测 定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，离心机，电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g，定容至1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中; (5)pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至 6.8，加水稀释至1000ml即得。 (6)0.4mol/L的NaOH溶液; (7)1%NaCl溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70?士0.5? 恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40?士 0.5? 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40?下预热的1,淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入40?恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶 活动,准备测糖。 3、淀粉酶总活力测定:取酶液5ml,用蒸馏水稀释至100m1,为稀释酶液。另取4支试管编号,2支为对照,2支为测定管，然后加入稀释之酶液lml，在对照管中加入4m1 0.4mol 氢氧化钠，4支试管中各加1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶测定第( 5 )步的操作,同样准备测糖。 4、麦芽糖的测定 (1)标准曲线的制作: 取25ml刻度试管7支,编号.分别加入麦芽糖 标准液( lmg/ml )0,0.2,0.6, 1.0,1.4,1.8,2.0ml ,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml,再各加3,5一二硝基水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热10min .取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸光度，以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量( mg )为横坐标,绘制标准曲线。 (2) 样品的测定: 取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中,各加入2m1 3,5-二硝基水杨酸试剂.以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度平均值,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后进行结果计算。 五、结果处理 式中 A 为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖( mg ); Ao 为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量( mg ); B 为(a十β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖( mg ); Bo 为(a十β)淀粉酶的对照管中麦芽糖( mg ); V T 为样品稀释总体积( ml ); V U 为比色时所用样品液体积( ml ); W 为样品重( g ). 本实验规定:40?时5min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。 篇三:淀粉酶活性测定实验报告-样本 专业: 姓名:学号: 实验报告 多效唑处理对小麦种子α-淀粉酶活力的影响 一、 实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下(70?)下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，麦芽糖的浓度利用比色法测得。 二、材料、试剂与仪器 材料:萌发3d的小麦种子。 试剂:1%淀粉溶液、蒸馏水、3，5-二硝基水杨酸溶液、麦芽糖标准液、1M NaOH。 仪器:分光光度计、水浴锅、离心机、天平;容量瓶、移液管、刻度试管、研钵等。 三、实验方法 1(麦芽糖标准曲线的制作 取7支干净的具塞刻度试管，按下表加入试剂摇匀，置沸水浴中煮沸5 min，取出后流水冷却，加蒸馏水定容至10 mL。用分光光度计测定吸光值A540。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值A540为纵坐标，绘制标准曲线。 表 1 麦芽糖标准曲线制备方法 试管编号 试剂 1 2 3 4 1mg/mL麦芽糖标准液(mL) 0 0.1 0.3 0.5 蒸馏水(mL) 1.0 0.9 0.7 0.5 3, 5-二硝基水杨酸(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 麦芽糖浓度(mg/mL) 0 0.1 0.3 0.5 2. 酶液制备 5 0.7 0.3 1.0 0.7 6 0.9 0.1 1.0 0.9 7 1.0 0 1.0 1.0 称取1 g萌发3天的小麦种子，置于研钵中，加少量的石英砂和2 mL 蒸馏水，研磨至匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL 蒸馏水分3次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取20 min，每隔3分钟搅动1次，使其充分提取。然后再3000 r/min下离心10 min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至100 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。 3. 酶活力的测定 变化取2支干净的具塞刻度试管，按表2加入试剂并进行相应处理，用分光光度计测定吸光值A540。用测试组吸光度与对照组吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg/mL)。 表 2 淀粉酶活力测定方法 试剂及处理方式 试管编号 对照组 测试组 3 1 1 ? ? 2 0 ? ? 2 2 ? ? 0 22 2 ? ? 淀粉酶原液(mL) 置70?水浴中15min，取出后在流水中冷却，钝化β-淀粉酶 1M NaOH(mL) 40?恒温水浴中保温10min 1%淀粉溶液(mL) 40?恒温水浴中保温5min 1M NaOH(mL) 取上述体系2ml至另一试管 3，5-二硝基水杨酸(mL) 摇匀，置沸水浴中5min，取出后流水冷却，加蒸馏水定容至10ml m?L 计算α-淀粉酶活性(U)公式:U? M U为α-淀粉酶活性(mg/g);m为查得得麦芽糖含量(mg/mL);L为淀粉酶原液总体积(mL)，M为样品重量。 四、实验结果 1. 标准曲线制作 根据以上数据建立标准曲线的方程，绘制标准曲线。 2.酶活性测定 五、结论 根据上面结果与分析，作出如下总结: