【word】 发育期大鼠视皮层锥体神经元自发兴奋性突触后电流变化

【word】 发育期大鼠视皮层锥体神经元自发兴奋性突触后电流变化 发育期大鼠视皮层锥体神经元自发兴奋性 突触后电流变化 第15卷2期 2009年6月 天津医科大学 JOURNALOFTIANJINMEDICALUNIVERSITY Vol_15.No.2 Jun.20O9169 发育期大鼠视皮层锥体神经元 自发兴奋性突触后电流变化 张卫鹏1,2,史学峰,-,邢咏新.-,赵堪兴1,2 (1.天津医科大学眼科临床学院眼肌科,天津300020;2.天津市眼科医院) [摘要】目的:研究发育过程中大鼠视皮层2/3层锥体神经元的白发兴奋性突触后电流(sEPSCs)变化,以及在生后早 期自发性突触活动情况,探讨视觉经验在视皮层发育过程中对神经元突触的修饰作用.方法:应用红外微分干涉相差 显微镜(m—DIC)结合电荷耦合式摄像机(CCD—Camera)可视法膜 7,8,14,15~21,22-28d各 片钳全细胞记录生后2— 组sEPSCs变化.同时于电极内液中加入虫荧光黄,对所记录细胞进 行染色观察形态学改变.结景:视皮层神经元 sEPSCs幅值随发育逐渐升高(单因素方差分析P<0.O1).视皮层神 经元sEPSCs频率随发育逐渐提高(单因素方差分 析P<0.01).但2,7d组与8—14d组差异无统计学意义(两独立样 本t检验P>0.05).视皮层2,3层神经元胞体及突起 以及生物电学特性随发育逐渐成熟.结论:大鼠视皮层锥体神经元突 触后膜AMPA受体功能表达随发育逐渐成熟,生 后早期突触并非完全处于静息状态,具有一定的早期白发突触功能 活动. [关键词】视皮层;突触发育;静息突触;自发性兴奋性突触后电 流;AMPA受体 [中图分类号】R339.14~6+R777.4+4[文献标识码]A[文章编 号]1006—8147(2009)02—0169—05 ChangesofspontaneousEPSCsinvisualcortexneurons ofratduringdevelopmentperiod ZHANGWei-peng’SHIXue-fengXINGYong-xin’ZHAOKan-xing (1.DepartmentofOphthalmology,ClinicalEyeHospital,TianjinMedicalUn ivemi~,Tianjin300020,China; 2.TianjinEyeHospita1) ABSTRACTObjective:Toinvestigatethemodificationalfunctionofvisuale xperienceontosynapsesby recordingdevelopmentalchangesofspontaneousEPSCsinlayer2/3pyramid alneuronsofratvisualcortex, andobservethespontaneoussynapticactivitiesduringtheearlierpostnatalperiod.Methods:Bycombining infrareddifferentialinterferencecontrast(IR-DIC)techniqueandCCD-Camerasystemwithvisualpatch clampwhole-cellrecordingtechnique,spontaneousEPSCsofP2-7,P8-14,P15-21,P22-28groupswere obervedandanalyzed,simultaneouslytheneuronswerestainedbyaddinglueiferyellowtothepipettesolu— tion.Results:TheamplitudeofsEPSCswasenhancedwhenaging(onewayANOVA,P<O.oi).ThesEPSCs frequencyincreasedwithage(onewayANOVA,P<0.01).TherewasnosignificantdifferencebetweenP2~7 groupandP8~14group(twoindependentsamplet-test,P>O.05).Theelectrophysiologyanddendriteof neuronbecamematureoverdevelopment.Conclusion:Althoughmostsynapsesareregardedassilent synapsesatearlypostnataldays,whichshowexclusivelyNMDAreceptor-mediatedfunction,theresultsim- plythereareearlyAMPAreceptor—mediatedfunctionalactivitiesinlayer2/ 3pyramidalneurons,synapses arenotcompletelysilent,theydohaveearlyspontaneousactivities. KEYWORDSVisualcortex;Synapsedevelopment;Silentsynapses;Sponta neousEPSCs;AMPAreceptor 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30730099) 作者简介:张卫鹏(1972一),男,主治医师,博士在读,研究方向:斜视与小儿眼病;赵堪兴(1946-),男,教授,主任医师,研究方向:斜视与A,JL眼病. 170天津医科大学第l5卷 神经生物学的一个关键问题是研究哺乳动物大 脑神经元联系发育的确切模式,同时视觉发育研究 发现,弱视的发生发展过程与视觉系统根据环境刺 激调整和改变与生具有的神经联系和突触结构的可 塑性过程密切相关.弱视的功能改变是以突触联系 为物质基础的,视觉发育可塑性关键期内这种活动 依赖性的神经机制.一直是眼科学和神经科学研究 的热点.虽然有很多关于突触发育的形态学研究,但 发育中突触联系的功能状态研究较少,本文通过对 发育期大鼠视皮层神经元回路的电生理学研究.观 察不同发育时期神经元电生理信号和突触活动的改 变情况.探讨视觉经验在视皮层发育过程中对活动 依赖性突触发育的修饰作用,以及生后早期谷氨酸 类型突触由静息突触向功能突触的转化过程中 AMPA受体功能特点和作用.并以此作为我们研究 弱视发病机制的基础. 1材料与方法 1.1材料实验所用大鼠为2,28dWistar大鼠共 63只,主要试剂EGTA,HEPES,ATP等均购于美国 Sigma公司,玻璃微电极购于美国WPI公司.主要仪 器膜片钳放大器为德国HEKA公司EPC10,振动切 片机为LeicaVT1000S,电极拉制仪为HEKAPIP5. 显微镜为OLYMPUSBX51WI.CCD为DVCCom— pany710M—T1-FW. 1.2方法 1.2.1实验分组依年龄将63只Wistar大鼠分为 4组,睁眼前:2,7d,n=23;8,14d,n=28.睁眼后:l5, 21d,n=21;22,28d,n=18(n为细胞数). 1.2.2视皮层脑片及电极的制备采用正常Wistar 大鼠,年龄为出生后2,28d.麻醉后迅速断头取脑, 将其置于用氧混合气饱和的4?人工脑脊液中冷却 3min后应用振动切片机在冠状平面上将视皮层脑 块切成厚度为350m的薄片,然后移人含氧混合气 饱和的人工脑脊液的孵育槽内室温下(18,25?)孵 育lh备用.人工脑脊液(artificialcerebrospinalflu. id,ACSF)成分为mmol/L):氯化钠125,氯化钾3,磷 酸二氢钠1.25,氯化钙2.4,氯化镁1-3,葡萄糖10, 碳酸氢钠26(pH7-3).另外记录时ACSF需额外加 人10Ixmol荷包牡丹碱(bicuculline,BMI)以阻断 GABAa受体介导的突触后电流(postsynapticcur- rent,PSCs).应用电极拉制仪拉制玻璃毛细管微电 极.充灌电极内液后阻抗在4—10Mft之间,电极内 液成分mmol/L)为:氯化钾117.5,氯化镁2,HEPES 10,EGTA5,Na2,ATP2,pH值调至7.3.如需荧光 染色电极内液需另加人0.3%的Lueiferyellow. 1.2.3视皮层脑片膜片钳全细胞记录及分析应用 红外微分干涉相差显微镜(IR—DIC)结合电荷耦合 式摄像机(CCD—Camera),可视法膜片钳全细胞记录. 在形态及电生理下I,2】确定2/3层锥体神经元. 应用EPC一10(HEKA,Germany)膜片钳放大器进行 封接记录,如图1显示的是处于封接状态下的一锥 体神经元. 图1显示视皮层2,3层一处于全细胞记录状态的锥体神经元 将细胞膜电位牵制于一80mV,记录槽内ASCF 中加入50I~molBMI的情况下记录sEPSCs,此时所 记录的sEPSCs主要为AMPA受体介导[3--51.细胞静息 膜电位在一65mV以上的以及串联电阻大于2OMQ 者将不被纳入,记录过程中对接人电阻实时监控,一 般在150,400MQ之间,如记录中接人电阻变化在 20%以上,记录将不被纳入分析数据.应用Pulse及 Pulsefit软件进行数据的采集与分析.绘图软件采用 Origin8.0. 1.3统计学分析采用SPSS11.5统计软件包进行 统计处理,计量资料均以均数?标准误(矗)表示,经 方差齐性检验后,两样本均数比较采用两独立样本 t检验,多组样本比较采用单因素方差分析,P<0.05 视为差异具有统计学意义. 2结果 2.1不同发育阶段大鼠视皮层2/3层锥体神经元 sEPSCs幅值及频率变化从整体发育上看频率和 幅值都随发育在提高.频率(单因素方差分析, F=87.46,P<0.01差异具有显着统计学意义):见图2. 2,7d组与8,14d组频率差异无统计学意义(mJ独 立样本t检验,t=0.849,P>0.05),且2,7d组频率略 高,图3中1,2,3分别为4,11,23d鼠一锥体神经 元的一段sEPSCs,从图3中可见23d鼠sEPSCs频 率明显高于4d和11d鼠,但4d和11d鼠sEPsCs 频率相差不明显;幅值(单因素方差分析,F=20.69, 第2期张卫鹏.等.发育期大鼠视皮层锥体神经元自发兴奋性突触后电流变化17l P<0.01差异具有显着统计学意义):见图4.2,7d组 与8,14d组幅值变化差异无统计学意义(两独立样 本t检验,t=1.299,P>0.05).图5显示的是不同天数 神经元sEPSCs幅值比较:1为记录到的4d大鼠锥 体神经元sEPSCs的335个事件(events)平均后结 果.2为11d鼠(281events).3为23d鼠(317events). 从图5中可以看到平均后的sEPSC4d鼠和11d鼠幅 值相差无几,而23d鼠幅值升高了近1倍. 图2整体上看频率随发育逐渐提高(单因素方差分析P<0.01),但2— 7d组和8,14d组比较变化差异无统计学意义(t检验,P>O.05) 1 2 圈31(4d),2(11d},3{23d)分别是一锥体神经元的一段sEPSCs 图4整体上看幅值随发育逐渐提高《单因素方差分析P<O.o1).但 2-7d组和8-14d组比较变化差异无统计学意义(t检验.P>0.05) 】23 V- l10pA.. 50ms 图5l,2,3分别显示的是一个4d{335events),11d(281events),23 d{317events}细胞记录到的sEPSC平均后结果 研究结果显示生后早期视皮层2/3层确有一定 的AMPA受体功能表达.突触并非完全处于静息状 态.2,7d组与8,14d组相比无论频率和幅值差别 并无统计学意义. 2.2不同发育时期细胞形态特征及诱发动作电位 反应类型可视法下建立全细胞记录后从电压钳模 式下转换到电流钳模式,向细胞内注入不同强度相 同时长的电流观察诱发动作电位,同时电极内液内 加入0.3%的luciferyellow观察所记录细胞胞体及突 起形态.如图6A中可见一11d大鼠的锥体神经元, 其树突二级分支发育较少,顶树突发育略短,生物电 学功能尚不成熟表现为向细胞内注入不同强度电流 只能诱发出单个动作电位,而从图6B中又可以看到 一 18d大鼠锥体神经元.其树突二级分支多.顶树 突发育较长.生物电学功能较为成熟表现为可以诱 发出串动作电位.而且随注入电流强度的增加动作 电位的个数随之增加.生后早期,锥体神经元形态学 上和生物电学功能等均处于相对不成熟状态.随着 发育逐渐成熟. __j20mv 50ms +50pA +25pA =二二一—广——————————————LP 20mV 5OmS B 圈6A为11d大鼠视皮层2/3层锥体神经元:B为较分化成熟的 18d大鼠锥体神经元 2.3确定所记录到sEPSCs谷氨酸受体反应类型如 图7所见,1为加人阻滞药物前的sEPSCs,2为记录 槽内加入0.5Ixmol1似后sEPSCs振幅及频率均有 下降,说明sEPSCs为T1敏感性的,因为兀x阻断 了电压依赖性钠通道.此时记录的就是所谓的 miniatureEPSCs.3为在记录槽内加入10I~molCNQX 后,sEPSCs消失,4为人工脑脊液洗脱后sEPSCs重 AAA吣叩卸” 一A一 加m5O 《盘 172天津医科大学第15卷 新出现,由此说明sEPSCs是由AMPA受体介导的. 10pA O.1s 图71,2,3,4分别为加药前,加入Trx,加入CNQX和洗脱后的sEPSCs 3讨论 突触是神经环路中相邻神经元之间点状接触区 域,其功能是进行细胞间的信息传递.突触的重塑是 指通过改变突触的大小或数目增加突触的联系.目 前普遍认为在哺乳动物中枢神经系统中.突触形成 同时伴随有学习或其他相关的活动.中枢神经系统 内的突触传递主要由谷氨酸介导的兴奋性突触完 成,离子型谷氨酸受体主要是NMDA受体和AMPA 受体,AMPA受体的主要功能是介导快速的突触传 递,当细胞接近其静息膜电位时提供内向电流的主 要成分,是神经系统进行正常信息传递所必须的.近 年来对海马和躯体感觉皮层电生理学与形态学研究 表明,在发育早期的神经系统存在仅表达NMDA受 体而缺乏AMPA受体的突触.这种突触被认为是发 育不成熟的突触,并不具有正常的信息传递的功能, 属于突触后静息突触,并且在特定的刺激下随着突 触后膜AMPA受体的插入这种静息突触能完成向 功能突触的转化【5’61. 由于有些研究发现无论是在电生理学特性上[71 还是在免疫组织化学上[81这种静息突触都缺乏AM— PA受体的表现仅表现为NMDA受体的特点.因此 目前普遍认为NMDA受体的发育要早于AMPA受 体的发育.随着发育成熟这些静息突触的数量明显 减少,突触信号的传递也表现为既有NMDA成分又 有AMPA成分.但是另有免疫组织化学研究[91和电 生理研究【认为大量新生的谷氨酸类型突触既表现 AMPA成分又表现NMDA成分.甚至有研究[51发现 生后早期视皮层2/3层相对与第6层几乎完全缺乏 静息突触.笔者利用脑片膜片钳技术记录不同发育 阶段大鼠视皮层神经元的电生理特性.发现发育早 期的神经元处于一个相对不成熟时期.表现为向细 胞内注入一定时长不同皮安(pA)的电流只能诱发 出单个动作电位,并且通过向细胞内注入染料发现 细胞树突发育也相对不成熟分支较少,如图5A.随 着天数的增加神经元生理功能逐渐发育成熟.表现 为通过向细胞内注入不同pA的电流可以诱发出连 续的串动作电位,同时细胞树突发育也逐渐成熟,二 级分支较多,如图5B.可见2/3层锥体神经元的确 经历了一个由幼稚到成熟的阶段.通过记录不同发 育阶段神经元自发性兴奋性突触后电流(sEPSCs)发 现,随着发育sEPSCs的波幅和频率都是呈现由低到 高逐渐成熟的这一过程.这一随发育而增加的自发 性突触活动一个可能的机制就是有新的有功能的突 触出现,即突触后膜有AMPA受体的插入而使突触 从原来”静息”状态转到功能状态,说明以视觉经验, 活动依赖的突触功能增强的一个过程.以往的研究 多记录诱发的突触后电流来观察突触功能活动.而 本研究把细胞膜电位牵制到一80mY(同时脑脊液里 含有Mg2可阻遏经NMDA受体的电流)所记录的 sEPSCs主要是由AMPA受体介导的并且是Trx敏 感,动作电位依赖的自发性突触活动[4,5Aol.是一种理 想的,较为直接的,能代表AMPA受体功能的一种 电生理信号.通过记录生后2,7d大鼠视皮层2/3层 神经元sEPSCs,发现虽然这一时期神经元发育处于 一 相对不成熟时期,但在这一时期视皮层2/3层确 有一定数量的自发性突触活动事件发生(且2,7d 组sEPsCs与8,14d组sEPSCs在波幅和频率上表 现无明显差异),这说明发育早期,视皮层2/3层即 有AMPA受体功能的表达.在视皮层2/3层AMPA 受体的功能并非完全缺失. 总之此研究结果显示.生后早期视皮层2/3层 锥体神经元及突触处于一相对不成熟时期并随着发 育逐渐成熟.视觉经验在这一过程中起了关键性作 用.尽管突触在这一时期被认为是”静息”突触只有 NMDA受体的功能表达嗍.但笔者发现此期有一定 AMPA受体介导的突触活动,说明这一时期AMPA 受体具有一定的功能.这些谷氨酸类型突触并非完 全静息.这些早期由AMPA受体介导的突触功能活 动是有一定的生理功能的.其对于整个神经网络的 形成与扩布是非常关键的.这种早期的突触功能活 动也使得后来以经验,活动依赖性的突触回路的成 熟与更新成为可能【5J.同样这种早期的自发性突触活 动在其他皮层也有发现Ill】并被证实是AMPA受体功 能依赖性的,其在新皮层网络构建与分化上扮演着 一 个重要的角色. (下转第183页) 第2期郭娟.等.复方丹参合剂与大承气汤合用对小肠梗阻肠黏膜屏 障的协同保护作用183 组成.复方丹参合剂是常用的活血化瘀方剂之一,由 丹参,三七和冰片组成,目前广泛用于各种血瘀症的 治疗.活血化瘀是依据瘀血致病的病因,病机而确定 其临床治则的,其临证运用千变万化,不拘一格.在 历代医家理论的启迪下,近几年来在临床工作中,运 用活血化瘀法治疗急腹症,颇有收益【.,01.由大承气 汤,复方丹参合剂组成的活血承气合剂可发挥上述 两个方剂各自优势.发挥多靶点治疗效果,可减少药 量.降低医疗成本,提高治愈率【”l. 本实验通过建立不完全性小肠梗阻动物模型,对 血浆和小肠组织DAO的测定及组织形态学的观察, 证明大承气汤与复方丹参合剂对小肠黏膜屏障有保 护作用,且二者合用时对肠黏膜屏障的保护作用增 强.为大承气汤和复方丹参合剂联合治疗不完全性小 肠梗阻提供了试验基础.证实了吴咸中院士通里攻下 法治疗急腹症时加用活血化瘀中药的合理性. 参考文献: [1]WuXZ.ModemresearchonpurgationmethodoftraditionalChi— nesemedicine-Applicationofthemethodinacuteabdominaldis— easesandexperimentalstudies[J].CJIM,1998,4(1):5 [2]吴水生,施红,张小如.中药复方药效学研究中应重视多靶点作 用的现实意义[J].中国中西医结合杂志,2001,21(7):545 [3]赵兴连.试论中药性能的多样性.山东中医药大学, 2000,24(4):253 [4]金万亮.大承气汤对腹部术后肠功能恢复的疗效观察娜.中国中 西医结合外科杂志,2000,6(5):326 [5]陈海龙,冯立民,关风林.阳明腑实证患者肠黏膜屏障功能的改 变及复方大承气汤干预作用的l临床观察[J】中医杂志,2003,44 (9):673 [6]金伟飞,王仲迪.复方大承气汤灌胃促进腹部手术后胃肠功能 恢复的疗效观察fJ],现代中西医结合杂志,2004,13(10):1301 [7]张宇,刘晓红.复方大承气汤治疗粘连性肠梗阻54例疗效观察 [J】_新中医,2007,39(1):13 [8]李耀春.活血化瘀中药对通里攻下中药增效作用研究进展[J1.天 津中医药,2006,23(3):263 [9]张峰华.活血化瘀在治疗腹痛中的应用[J].陕西中医,2005,26 (6):95 [10]罗康华.活血化瘀治疗急腹症举隅[J].中国中医急症,2002,11 (5):362 『l1]吴咸中.活血化瘀药物对其他治则药物增效作用的实验研究 【A].第九届全国中西医结合普通外科学术交流大会暨胆道胰 腺疾病新进展学习班论文汇编【C】.2005 (2008一ll一26收稿) (上接第172页) 参考文献: [1]JeanD,Kimc,YangYM.Impairedlong-termmemoryandlong— termpotentiationinN-typeCa2channel-deficientmiceSPm. 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