检测猪肉中地西泮的分子印迹仿生传感器的研制

检测猪肉中地西泮的分子印迹仿生传感器的研制 .. 检测猪肉中地西泮的分子印迹仿生传感器 的研制 作者:刘晓芳 姚冰 刘国艳 柴春彦 【摘要】 在一次性丝网印刷电极上原位制备地西泮的分子印迹膜，将丝网印刷电极通过电极插口与便携式电导仪相连接，组装成检测地西泮残留的电导型传感器，建立了检测地西泮的标准曲线并测试了实际肉类样品中的地西泮含量。通过扫描电镜分析了该膜的表征，与非印迹膜相比，印迹膜表面形成了大量印迹微孔。本传感器装置对地西泮具有很高的灵敏度和特异性，检出限为0.008 mg/L，线性范围为0.039,1.25 mg/L，基于肉品的检测回收率为91.3%,95.0%，可实现现场快速检测。 【关键词】 地西泮; 分子印迹膜; 电导型传感器 1 引 言 地西泮又名安定，属于第二代安眠镇静药，国家明令禁止在动物饲料和饮水中使用。但一些养殖企业为了提高饲料报酬，违禁使用安定类药物的现象时有发生，动物性产品中此类药物的残留对消费者健康和对外贸易均产生很大危害。因此建立快速、有效的测定地西泮的方法十分必要。分子印迹聚合物和分子印迹膜对目标化合物具有高度选择性，在样品中待测化学物质的分离、富集、检测领域得到广泛地应用[1,10]。Ariffin等应用地西泮分子印迹聚合物固相萃取柱，采用液质联用技术检测血液中地西泮含量[11]，该方法前处理步骤繁琐，需要大型仪器，不适合现场快速检测。有研究者利用电化学方法在柱状金属电极上制备印迹膜[12,14]或 .. .. 热聚合法制备分子印迹物[15]作为检测传感器的感受器部分。但是电化学法印迹膜难以批量制备，利用印迹物制备的传感仪组装过程较复杂，均不适用于大通量快速检测。有关利用分子印迹膜为感受器检测肉品中地西泮的电导型传感方法的研究尚未见报道。 本实验采用原位聚合的方法，直接在一次性丝网印刷电极条上制备地西泮分子印迹膜，并将这种电极条与电导分析仪相连接，组装了检测地西泮的电导型传感器。通过更换带有印迹膜的电极条，将微量待测样品直接滴入电极条工作区即可实现多个样品的快速检测。此电导型传感器具有灵敏度高、特异性强、检测速度快和成本低等优点，具有实际应用前景。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Hardwee C18固相萃取小柱(500 mg， 3 mL，德国Hardwee公司);FEI SIRION200型场发射扫描电镜(美国FEI公司); XMTD204电热恒温水浴锅(上海博泰实验设备有限公司);索氏提取器(江苏海门华盛实验仪器有限公司);SB80超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);CON 6/TDS 6 电导仪(新加坡OAKTON公司);一次性丝网印刷电极条(台湾芯宝科技股份有限公司)，其基本结构是在PVC基板上按图案印制导电银浆层、导电碳浆层及绝缘层。 地西泮标准品(Diazepam)、甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)均购于Sigma公司;偶氮异丁腈(AIBN)、二甲亚砜(DMSO)、甲醇、丙酮、乙酸及其它分析纯试剂均购自中国医药集团上海化学试剂公司。磷酸盐缓冲液(PBS)以NaH2PO4和Na2HPO4 配制;伯瑞坦 .. .. (BR)以磷酸、乙酸、硼酸配制;碳酸盐缓冲液以Na2CO3和NaHCO3配制;缓冲液pH调节液为HCl和NaOH溶液。实验用水均为二次蒸馏水。 2.2 印迹膜(MIF)的制备 取0.2847 g(1 mmol)地西泮和0.516 mL(6 mmol)MAA溶于10 mL二甲亚砜中，超声10 min，放置2 h进行预聚合。加入5.667 mL(30 mmol)EGDMA 和0.061g AIBN，超声混合均匀，充氮气除氧10 min，量取1.2 μL聚合液均匀涂布在丝网印刷电极工作区，将电极条固定在密闭容器底部，容器抽真空后置于60 ?水浴中。当丝网印刷电极上涂布聚合液的区域出现半透明蜡状物质后，取出电极条置于4 ?冷却，得到地西泮分子印迹膜(MIF)修饰的丝网印刷电极。用甲醇(9?1, V/V)溶液洗脱48 h，用甲醇洗去乙酸，-4 ?保存备用。 带有非印迹膜(NMIF)的丝网印刷电极条的制作方法参照上述方法，区别在于聚合过程中不加入模板分子。 2.3 传感检测方法的建立 检测装置示意图如图1所示。将分别修饰有MIF与NMIF的两条丝网印刷电极条通过两块加样控制挡板粘合为一体，两电极工作区之间的间隙组成测试样品加样区，然后将组装好的测试电极通过USB接口与电导仪相连。 图1 实验检测装置示意图 Fig.1 Schematic structure of analytical system 用BR缓冲液(pH 7.0)配制0.039， 0.078， 0.156， 0.312， R缓冲液滴入丝网0.625， 1.25 mg/L的地西泮标准溶液。取30 μL B 印刷电极的工作区，待传感仪读数稳定后，记录此刻电导值(背景值)，然 .. .. 后用吸水纸吸干电极工作区的缓冲液，加待测样品30 μL，稳定后记录电导值(终值)。每次检测结束后更换带有MIF修饰的丝网印刷电极条，共测试6个浓度，平行测定3次。以响应信号值(信号值=终值)为纵坐标，以地西泮的质量浓度为横坐标，作标准曲线。 3 结果与讨论 3.1 MIF与NMIF表征分析 随机选取数个制备好的MIF和NMIF，进行扫描电镜分析。本实验制备的MIF与NMIF厚度介于20,40 μm之间。非印迹膜表面较为光滑，并有小量小泡样阴影分布(图2A)，可能主要由于聚合分子在聚合结束后，聚合分子牵拉及堆积而成。而分子印迹膜上则有大量的分子印迹孔穴存在，在膜表面广泛分布(图2B)，在孔穴样分子聚合物表面存在着大量的印迹微孔，可能是由于模板分子被洗脱后而遗留的结构，该结构与分子印迹膜对模板分子的识别和吸附作用密切相关。表面立体扫描发现，非印迹膜表面结构较为均一，无明显的穴状结构;而分子印迹膜表面结构不均一，分布有大量的凹陷及孔穴样结构。 3.2 基于MIF传感器的测试标准曲线 以分子印迹膜为敏感元件的电导传感方法检测地西泮的标准曲线，回归方程为Y=23.28787x+1.9741(r=0.9995)，检出限为0.008 mg/L;在0.039,1.25 mg/L 范围内具有良好的线性关系。而以非印迹膜为感受器在相同条件下检测地西泮标准溶液，在不同溶液浓度下所获得的电导值无明显变化。说明洗脱后的MIF存在可以与地西泮分子结构相互补的孔穴，溶液中具有电化学活性的地西泮分子被特异性吸附至MIF表面后，膜本身 .. .. 的电化学活性改变。随着溶液中地西泮浓度的变化，产生相应的电导率信号。而NMIF对地西泮分子具有一定程度的非特异性吸附。当这种吸附趋于饱和时，所得到的电导率值在一定范围内表现出缓慢的变化;当溶液中待测物浓度增大时，电导响应值也随之增加，但是这种非特异性吸附引起的电导率变化远远低于MIF的特异性吸附。 3.3 测试条件对检测信号的影响 用0.1 mol/L BR缓冲液(pH 7.0)配制浓度分别为0.039、0.156、0.625和1.25 mg/L的地西泮测试液，按照 2.3中所建立的传感方法进行测试，分别在0、30、60、120、180、240和300 s时记录电导值， 实验结果见图3A。检测不同浓度地西泮溶液时，电导信号值均随着数据采集时间的延长而增大。检测值在初始60 s内显著增加，但是在较低浓度下变化趋势不明显;180 s后检测值趋于稳定。由本实验可知，MIF对溶液中地西泮分子的特异性吸附主要发生在前60 s内，180 s后达到吸附平衡状态。因此，本实验选取180 s作为检测数据采集时间。 为探讨不同缓冲液对测试地西泮含量的影响，分别以pH 6.0(0.2 mol/L)的PBS缓冲液、pH 7.0(0.1 mol/L)的BR缓冲液和pH 9.5(0.1 mol/L)的碳酸盐缓冲液为支持液，检测结果表明， 以PBS缓冲液为支持液时，检测值在较低浓度时呈递增趋势，但高浓度的检测值变化平缓;以碳酸盐缓冲液为支持液，测试结果呈波动性变化;而以BR缓冲液为支持液，检测值具有良好的线性关系(图3B)。因此，本实验选用pH 7.0(0.1 R缓冲液作为支持液。 mol/L)的B 3.4 干扰实验 .. .. 本实验选用畜禽肉中可能含有的违禁兽药琥珀酸氯霉素与己烯雌酚作干扰物质，将地西泮和每种干扰物质用0.1 mol/L BR缓冲液分别配制成干扰测试液，各物质的加入量见表1。实验发现， 两种干扰测试液的地西泮检出量均略高于溶液中地西泮的实际含量。其中己烯雌酚对检出量的影响比琥珀酸氯霉素更大，说明分子构型差异很大但分子量接近的物质会对检测造成干扰。这主要是由于检测过程中MIF同时对各特征基团和分子整体进行识别，琥珀酸氯霉素的分子结构和分子大小与地西泮差异明显，不能稳定结合在印迹孔穴中，大部分以布朗运动的形式在印迹孔穴中出入。己烯雌酚虽然与地西泮的分子结构也有很大差异，但其分子量与地西泮相当，且少量分子的酚羟基可以与印迹孔穴通过氢键、范德华力相结合，造成检测值偏高。该推断与文献[16]的研究结果一致。因而在实际样品测试时，为消除这种干扰，可以通过简单的预处理分离富集待测物质。表1 干扰物质对0.5 mg/L 地西泮溶液检测结果的影响 本实验也在肉品如牛肉、猪肉(包括鲜肉、熏肉和腊肉)样品中进行了待测物的标加实验，结果表明，不同来源肉品、色素、防腐剂等物质对同一浓度的地西泮测试未有显著影响。另外，维生素C、Fe3+等具有高氧化还原活性的物质对测试地西泮的影响并不显著，可能该实验建立的电导测试模式能有效地排除这些物质的干扰。离子在电导型传感测试中为必须考虑的影响因素之一。测试了不同离子类型和强度对电导传感法测试地西泮的影响，发现样品中含有0.2 mol/L的碳酸盐、磷酸盐，对测试结果影响并不显著，但5 mol/L的NaCl， KCl等强电解质对电导测试结果有显著影响，可使电导值增加2.52,4.85 ms，因而建议在样品前处理过程中 .. .. 通过液 3.5 回收率实验 参照商业标准[17]对标加样品进行前处理。称量10 g猪肉匀浆试样两份，加入地西泮标样，分别经提取、萃取得到的样品洗脱液于50 ?水浴氮气吹干。取一份氮气吹干物，用1 mL 1%高氯酸水溶液和2 mL正己烷复溶，静置分层后取下层水相过0.2 μm滤膜，供HPLC分析。取另一份氮气吹干物，用3 mL甲醇(1?99, V/V)溶液复溶，过0.2 μm滤膜，供传感测试。每个样品平行6次。标准加入实验结果表明，该传感方法检测结果与HPLC法检测结果一致(表2)，回收率为91.3%,95.0%，略低于HPLC法测定的回收率(92.0%,100.7%)。表2 回收率的测定结果 3.6 传感器性能 采用本方法对液体样品中的地西泮残留进行检测，可在3 min内完成。更换同一批次制作的带有MIF的电极条，对相同浓度的地西泮标加样品进行检测，5次测试得出的结果一致，相对标准差小于2.8%。随机抽取5批次制作的带有MIF的电极条，检测同一浓度的地西泮标加样品，相对标准差小于3.5%;将制备好的带有MIF的电极条在-4 ?条件保存3个月后，检测同一浓度的地西泮标加样品，与刚制备好的电极条检测结果相比，相对标准误差小于3.8%; 4个月后进行检测，与初次检测相比，相对标准误差小于4.6%。因此该传感仪的敏感元件的使用寿命在4个月以上。通过更换带有MIF的一次性丝网印刷电极条，该传感仪可长期使用。用过本实验制备的基于MIF为感受器的电导型传感仪具有检测速度快、重复性好、稳定性高、使用时间长等优点， 有很大的实际应用价值。 .. .. 【参考文献】 1 Alexander C, Andersson H S, Andersson L I, Ansell R J, Kirsch N, Nicholls I A, O′Mahony J， Whitcombe M J. 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