【doc】 间充质干细胞分化为内皮细胞的意义和细胞学基础

【doc】 间充质干细胞分化为内皮细胞的意义和细胞学基础 间充质干细胞分化为内皮细胞的意义和细 胞学基础 生理挝学进展2005年第36卷第3期 间充质干细胞分化为内皮细胞的 意义和细胞学基础木 郭新李玉林(吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室,长春130021) 摘要间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)主要存在于骨髓中,是多潜能干细胞,在脐 血,外周血,脂肪,皮肤等多种组织中也相继分离出MSCs.MSCs具有独特的免疫特性,在异种异体 环境内长期存在,使其临床应用前景更为广泛.目前,MSCs的分离培养,诱导分化及鉴定体系已趋 成熟,理论上可分化为所有中胚层来源的细胞,内皮细胞来源于中胚层,因此MSCs具有分化为内 皮细胞的可能性.本文对MSCs内皮分化意义和细胞学基础及其新近的研究进展作一综述. 关键词间充质干细胞;中胚层;内皮细胞 中图分类号R361.1 CytologicalBasisandSignificanceofMesenchymalStemCellsDifferentiat edintoEndothelialCells GUOXin,LIYu—Lin(TheKeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,BasicMedicalSchool, 朋inUniversity,Changchun130021) AbstractMesenchymalstemcells(MSCs)areamultipotentpopulationwhichmainlylocalizedinthe bonemarrow.MSCswerealsoisolatedfromtheumbilicalblood,peripheralblood,fattytissue,skinand soon.MSCshavespecialimmunityandpersistinthexenogeneicexplantationwhichexpandtheclinical application.Atpresent,thesystemofcuhuration,inductionandidentificationofMSCsaregraduallybe— comingmature.Meanwhile,MSCsdifferentiateintocellsderivedfrommesoderminthetheory.Endothe— lialcellsderivedfromthemesoderm,MSCshavepotencyofdifferentiatedintoendothelialcens(ECs). ThisreviewfocusesonthesignificanceandcytologicalbasisofhumanMSCsdifferentiateintoendothelial cells,aswellastherecentadvancementandapplicationonthetissueengineering. KeywordsMesenchymalstemcell:Mesoderm:Endothelialcell 干细胞独特的生物学特征及其在组织工程学中 诱人的应用前景,使之成为21世纪生命科学研究领 域的热点之一.尤其是成体干细胞跨系统,跨胚层 分化潜能的发现,不仅对细胞生物学理论的发展有 重大意义,而且对心血管,肿瘤,免疫,遗传等方面疾 病的治疗,以及器官重建和损伤修复,均具有深远的 影响.目前在成体干细胞研究领域中,间充质干细 胞备受瞩目. 间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs) 由于取材容易且对健康无害,诱导的组织又不存在 MHC限制,因此成为组织工程中重要的种子细胞, 尤其是血管组织工程中不可替代的细胞来源.它最 终将取代自体血管,成为体外内皮细胞的主要来源, 使大量产生内皮细胞的梦想成为现实.本文对 MSCs基本生物学特性及分化为内皮细胞(endothe— lialcells.ECs)的意义和最新的细胞学研究进展作 一 综述. 一 ,MSCs基本生物学特性 130多年前,德国病理学家Cohnheim在研究伤 口修复时,提出骨髓中可能存在非造血组织的干细 胞.直到20世纪70年代中期,Friedenstein等才首 次报道骨髓中小部分粘附细胞在培养过程中能够分 化形成类似骨或软骨的集落.后来研究表明, Friedenstein分离所得的细胞具有多能性,可分化为 成骨,软骨,脂肪,成肌等多种中胚层来源的细胞,因 此将这种细胞称为间充质干细胞.以后人们陆续从 脐血,外周血,肌肉,骨及小梁骨,脂肪组织,滑膜组 织和胰腺组织中分离出MSCs. 目前用于分离MSCs的方法主要有四种,即密 度梯度离心法,流式细胞分选法,磁珠分离法和贴壁 筛选法.由于MSCs没有特异性表面标志物,所以 ‘教育部博士学科点专项基金资助课题(20020183064) 博士研究生,现在香港中文大学从事科研工作 通讯作者 生理科学进展2005年第36卷第3期 目前采用联合鉴定方法:细胞化学,免疫组化及流式 细胞分析方法.MSCs表达CD29,CD44,CD71, CD90,CD106,CD120a,CD124,CD166等表面抗原, 不表达分化相关标志如?,?型胶原,骨桥蛋白等, 也不表达造血系统标志,包括CD14,CD34及白细胞 共同抗原CD45.除了采用以上联合方法鉴定外,人 们根据MSCs具有多向分化潜能的特点,对其采用 反证法.所以许多实验室将MSCs在体外诱导分 化,如果可分化为多种间充质细胞,则说明所分离的 细胞为MSCs.或者在体外将细胞大量扩增,然后直 接注入体内,在微环境作用下,细胞可分化为骨,软 骨,脂肪等细胞系,从而反向所分离的细胞是 MSCs,而不是成熟细胞. MSCs具有独特的免疫特性,不表达MHCII类 分子,也不表达B7分子,而B7分子对免疫识别相 当重要,同时体外观察其分化细胞,也未见MHCII 类分子表达.因此通常情况下,与造血系统和结缔 组织相比,MSCs表达的MHCII类分子要少.因此, MSCs具有特异性免疫功能,使其在异种异体环境内 长期存在. MSCs具有多向分化潜能,在培养体系中加入地 塞米松,B一甘油磷酸盐,抗坏血酸盐(维生素c),可 诱导其成骨分化;MSCs低速离心形成细胞微团,加 入含TGF一133的无血清培养基,即可促使MSCs向软 骨分化;IBMX(3一异丁基一1一甲基黄嘌呤),地塞米松, 胰岛素及消炎痛均为重要的脂肪诱导剂,可使约 95%的MSCs发生脂肪分化;两性霉素B可诱导 MSCs分化为肌细胞,5一氮胞苷和5一氮胞苷-2脱氧胞 苷也具有同样功能.MSCs可以向中胚层其他组织 分化,如真皮,结缔组织及上皮等.研究发现,博来 霉素诱导的肺损伤模型中,将骨髓MSCs移植人体 内,可分化为I型肺泡上皮(Kotton等.2001).但 MSCs诱导分化为血管内皮细胞方面的研究至今未 见报道. 二,MSCs体外诱导分化为血管内皮细胞的 意义 MSCs主要存在于成人骨髓中,是非造血组织的 多潜能干细胞,具有粘附特性,可分化为肢芽中胚层 (成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞,肌腱,肌管,肌肉, 真皮,骨髓基质细胞和骨骼肌细胞),脏壁中胚层细 胞(内皮细胞)…以及外胚层细胞(神经元,神经胶 质细胞).内皮细胞是组织工程化血管的核心,是 心脏外科及血管外科进行血管移植物的主要材料. 种子细胞的来源及如何为组织工程化器官提供血 供,又是目前组织工程学主要面临的两大难题,因此 研究并找到体外诱导内皮细胞分化的完善可行性体 系已迫在眉睫. MSCs具有内皮细胞的某些表型,因此研究和分 析MSCs生长,发育,分化和表型特征,不仅对研究 血管内皮细胞相关疾病的治疗有着重要的指导意 义,而且给血管组织工程学带来了一次革命性转变. MSCs作为种子细胞,具有其他细胞所不可比拟的优 越性:(1)从患者本人骨髓血培养扩增的MSCs,诱 导为血管内皮细胞,不存在组织相容性问题;(2)早 期血管代用品的组织工程学研究,大多应用单层内 皮细胞植入合成材料内壁,以抗血栓形成提高血管 通畅率.但这种内皮细胞属于已成熟细胞,其分裂 增殖能力不如MSCs,且还存在去分化的倾向.而 MSCs具有旺盛的增殖分化潜能,无诱导剂情况下, 可保持25代内无分化趋势;(3)人工合成材料中的 可降解性生物合成材料,包括PGA(聚乙二醇酸), PEA(聚丙醇酸),PuA(聚乙醇酸),与MSCs相结 合使用,为血管组织工程学带来不可估量的应用前 景. 总之,利用MSCs进行血管内皮构建,可促进工 程化器官的血管再生,机体缺血性疾病的治疗,同时 也解决了小口径血管(<5mm)易发生血栓的问题. 三,MSCs诱导分化为内皮细胞的理论基础 首先,MSCs是来源于早期中胚层和外胚层的一 类多能干细胞,理论上可分化为所有中胚层来源的 细胞,内皮细胞属于中胚层,是胚胎发育过程中第一 个分化的组织,因此MSCs具有分化为内皮细胞的 可能性.其次,MSCs主要存在于骨髓中,骨髓内主 要包括三种细胞系统:造血,内皮和基质细胞系统. 研究表明,这三种系统存在着各自的干/祖细胞,在 分化中彼此密切相关.其中MSCs属于基质细胞系 统,但却具有内皮细胞的一些表型特征,与内皮细胞 的分化,发育密切相关. (一)MSCs与早期内皮细胞发育的联系MSCs 的发现最早可追溯到130多年前,直到20世纪70 年代中期,Friedenstein等才首次报道确定了MSCs 的存在.1992年Haynesworth通过免疫小鼠制备的 单克隆抗体SH2,所识别的抗原被认为是MSCs的 特征性抗原.1999年Barry与Haynesworth首次 利用SH2单克隆抗体,确定识别抗原为endo~in (CD105),即TGF—I3RIII,并探讨该抗原在人MSCs 分化过程中的可能作用.该抗原主要分布在内 皮细胞中,与血管的发育有关,MSCs以此为特征性 标记,说明MSCs与内皮细胞存在一定的内在联系. 大多数SH2细胞,与UEA一1和FVIIIAg的内 皮细胞,可在同一部位共同表达,但有一部分细胞只 表达SH2,而不表达内皮标志.UEA一1和FVIIIAg 的细胞数,随着年龄增大和皮肤成熟度增加而逐渐 占多数,SH2细胞数却随着年龄增加而逐渐降低. 在胚胎,胎儿和出生后早期皮肤标本中,可观察到 SH2细胞,而3O岁以上成人的皮肤标本中未观察 到该细胞.此实验结果提出一个假设:SH2抗原是 微血管系统早期发育的细胞表面标志,在胚胎皮肤 形成和血管新生中起重要作用.SH2的MSCs 是否参与早期血管及内皮细胞发育,尚需进一步研 究证实. MSCs表达与血管内皮细胞有关的粘附分子,如 血管内皮细胞粘附分子(VCAM一1),细胞间粘附分 子(ICAM一1),整合素(IntegrinvB3),这些粘附分 子参与血管的生成.但MSCs不表达粘附分子PE— CAM一1(CD31),而外周血的内皮前体细胞却表达 CD31,这可能与血管内皮细胞的分化成熟有关. MSCs也不表达CD34,CD34是一种糖蛋白,是内皮 细胞和造血干细胞的传统标记物.过去认为造血细 胞只由CD34的干细胞群分化而来,但越来越多研 究显示,一部分CD34一干细胞群能产生必要的生长 因子,启动和促进最初静止细胞的分化,产生造血前 体细胞和内皮细胞,最终活化的CD34一干细胞成为 CD34的造血前体细胞.MSCs属于CD34一干细 胞群,是否经历一中间过渡类型而最终分化为 CD34细胞仍需进一步研究. (二)MSCs与内皮前期细胞(endotheliMprogen— itorceils,EPC)新血管形成包括两个不同的过程, 首先是血管形成,即血管生成母细胞在原位分化为 内皮细胞,随后形成原始的毛细血管丛.其次是血 管新生,是已经存在的血管内皮细胞通过萌芽形成 新的血管.传统观点认为,血管生成母细胞(he— mangioblast)或血管母细胞(angioblast,即内皮前体 细胞)来源的内皮细胞,原始分化只发生在胚胎形 成阶段早期,而血管新生过程发生在发育阶段和出 生后阶段.1997年Asahara等首次从人的外周血 中分离出CD34,KDR的内皮前体细胞/祖细胞 (endotheliMprogenitorceils,EPC),并证明该细胞在 体外能分化成内皮细胞.2001年Shintani等发现, 来自骨髓的单个核细胞(BM—MNCs)能产生功能性 EPC,在兔后肢缺血模型中,EPC能够存活并整合入 骨骼肌内的毛细血管,促进侧支静脉形成,参与血管 生理科学进展2005年第36券第3期 形成过程.MSCs由骨髓单个核细胞层分离纯化 而来,循环的EPC最初又来自于骨髓,这是否暗示, 在BM—MNCs中产生功能性EPC的是MSCs,但有关 这方面研究至今未见报道.因此需要在体外诱导 MSCs,观察其是否经历EPC这一过渡类型,或者可 直接诱导分化为内皮细胞,然后再进行体内实验进 一 步证实. 其他一些研究结果也提示MSCs与血管形成及 浸润有关.例如活化白细胞粘附分子ALCAM(acti— vatedleukocytecelladhesionmolecule,CD166),是 MSCs比较特异的标志物之一,主要表达于造血细 胞,内皮细胞和骨髓基质细胞,介导同种细胞(ho— mophilic)之间(ALCAM—ALCAM)和异种细胞(het— erophilic)之间(ALCAM—CD6)的粘附.该粘附分子 不仅参与胚胎造血,而且与血管新生和形成有 关.通过FACS分离的软骨膜来源的ALCAM细 胞,具有MSCs特性,可促进造血生成和血管新生, 当在培养中加入ALCAM—Fc或CD6一Fc,可阻止血管 向软骨浸润,暗示ALCAM的MSCs通过趋化破骨 细胞参与血管浸润. 总之,目前认为可分化为内皮细胞的原始细胞, 包括血管生成母细胞,内皮前体细胞(血管母细胞) 和最新发现的多能成体祖细胞(multipotentaduh progenitorcell,MAPC)?.这些细胞不仅存在于胚 胎中,也存在于成体组织中. 四,细胞体外分化为内皮细胞的实验细胞学 基础 干细胞体外诱导分化,产生大量内皮细胞一直 是该研究领域的焦点和难点.以往的工作多停留在 理论研究上,真正体外诱导分化为内皮细胞的实验 性研究却很少.目前利用ESs诱导分化为内皮细胞 已取得成功.麻省理工学院Langer等首次利用人 体ESs培育血管,首先使这些干细胞发育至能分化 成不同细胞类型的阶段,然后从中提取出有可能分 化为内皮细胞的干细胞,进一步对其培养.当这些 细胞形成原始血管结构时,移植入小鼠体内,发现在 14天时形成了毛细血管网.其中一些毛细血管中 含有鼠的血细胞,说明这些血管已经自发地与鼠循 环系统相结合.但由于ESs存在一定免疫排异反 应,并受到社会伦理等方面的限制,因此科研人员一 直寻找能替代ESs的一种种子细胞.MSCs已成为 代替ESs的理想种子细胞 目前关于MSCs诱导分化为内皮细胞的实验研 究很少,并且没有可行有效完善的诱导体系,因此探 生理科学进展2005年第36卷第3期 讨并建立一个有效的诱导分化体系就显得十分重 要.2002年,一个与MSCs极为相似的细胞群 MAPC的发现,并在体外被诱导分化为有功能的 ECs,这就为MSCs的内皮分化功能提供了可能. (一)MSCs与MAPC在个体发生学上的联 系2002年,明尼苏达大学的造血干细胞研究中心 CatherineVerfaillie领导的实验小组,发现一种成体 细胞可作为非胚胎来源的”通用”干细胞,称之为多 能成体祖细胞(muhipotentadultprogenitorcells, MAPCs).目前该研究小组已从骨髓,肌肉和脑组 织中培养出该种细胞?”J,并已证明大鼠和小鼠的 MAPCs,可以在体外诱导分化为内胚层(肝细胞), 中胚层(骨骼肌,平滑肌,心肌和vWF阳性的ECs), 神经外胚层(包括神经元,星形胶质细胞和少突胶 质细胞)三个胚层来源的细胞?’. 自从Verfaillie首次报道MAPCs体外诱导分化 为ECs,人们就对MAPCs的来源发生极大兴趣.这 种MAPCs是MSCs的一个细胞亚群(MSCs大约为 1/10,10单个核细胞,而MAPCs大约为1/10, 10.单个核细胞?),是用免疫磁珠除去骨髓单个 核细胞中CIM5和血型糖蛋白glyeophorinA的细 胞,将CIM5一和血型糖蛋白A一细胞接种在纤维连 接蛋白包被的培养皿中,在含2%FCS培养液中加 入EGF和PDGF—BB培养而得到,实际上是较MSCs 更加同源的一种细胞亚群.并已证明小鼠脑和肌肉 来源的MAPCs,其生物学特性与骨髓来源的相似, 因此推测脑组织和肌肉组织中可能也存在MSCs. 当骨髓,脑和肌肉三种组织,在一定条件下培养,其 条件适合MSCs中MAPC产生时,就有可能导致这 三种组织中MSCs发生基因重新编序成为 MAPC[121 . 由于MAPCs既可分化为ECs,又可分化为其它 类型的中胚层和非中胚层来源细胞,所以将该细胞 定义为血管母细胞(angioblast)/EPC的前体细胞, 在个体发生学上,甚至早于血管生成母细胞(he— mangioblast)10].同时提出,MAPC分化为CD34, VE—cadherin,AC133一和Flkl的”血管母细胞/ EPC”,随后分化为成熟的ECs.这说明MAPC与 ECs之间经历了中间过渡类型——血管母细胞/ EPC. (二)成体干细胞体外分化为血管内皮细胞 (endothelialcells,ECs)Verfaillie领导的研究小 组,首次在体外成功地将MAPCs诱导分化为ECs, 并进行大量扩增,同时证明诱导分化而来的ECs具 有成熟内皮细胞的功能,在人工基底膜上可形成血 管结构.体内平行实验证明,MAPCs根据局部微环 境分化为ECs,整合入宿主的毛细血管内,并促进肿 瘤的血管新生.研究发现,诱导MAPCs发生内皮分 化,只用2%FCS或更低浓度,而不用10%FCS,因 为高浓度血清促进传统MSCs的生长,只能分化为 成骨细胞,软骨细胞和脂肪细胞?.细胞接种密度 也有一定要求,低密度不能引起分化,如果在分化的 启动阶段9天内持续存在高浓度血清,则不能诱导 内皮分化.而且MAPCs未融合时(10/cm或更 少),用VEGF165处理,也未见内皮细胞分化. 与其它细胞系的研究相似,MAPCs分化为 ECs,要求在高密度培养条件下诱导,可能是抑制细 胞增殖而促进分化.血清存在时也不能发生分化, 是因为血清中含有大量的有丝分裂原.尽管 VEGF165在血管形成,血管新生及内皮细胞诱导分 化中有重要作用,但其它因子也是必需的,包括bF— GF和TGF—B?”.另外,一些受体包括Notch-4和 ephrins?,也有重要的调节作用. 五,展望 完美地修复或替代因疾病,战伤,意外事故或遗 传因素所造成的组织,肢体或器官的伤残,一直是人 类的”梦想”和难以攻克的医学高峰.利用干细胞 工程和现代生物医学技术,有可能使这一”梦想”成 为现实. 组织工程学的”上游”——干细胞工程,起着重 要的基础作用,其中种子细胞又是首要因素.MSCs 作为重要的种子细胞,无论从它的来源,分离方法及 分化的组织类型上都有其独特的优势,但MSCs的 研究面临着几个亟待解决的问题.首先,寻找和鉴 定MSCs所特有的细胞表面标志分子,对其分离和 培养具有重要意义.其次,分化潜能及功能研究将 拓展MSCs应用的范围,发现不同来源,不同特性的 分化潜能将扩大MSCs治疗疾病的适应证,例如心 血管外科和缺血性疾病的治疗.虽然目前MSCs无 完善有效的内皮诱导分化体系,但MAPC的研究已 经提供了重要的参考指标.除本文所述影响因素 外,干细胞与分化细胞间接触共培养也具有重要作 用加J.随着对干细胞分化机制和影响因素的深入 研究,人们在基因水平,特异分化因子,分化微环境 等方面,对MSCs分化为目的细胞的调控将更为精 确,并将以MSCs为突破口,真正使现代组织工程造 福于人类,使人类从移植器官步入到制造器官的新 时代! 参考文献 1DennisJE.CharbordP.Ori6nandDifferentiationofhum~Lrl andmurinestroma.StemCells.2002.20:205,214. 2HaynesworthSE,BaberMA,CaplanAI.Cellsurfaceanti— derivedmesenchymalcellsaredetec. gensonhumanmarrow— tedbymonoclonalantibodies.Bone.1992.13:69,80. 3BarryFP,BoyntonRE,HaynesworthS,eta1.,I’hemono— clonalantibodySH-2,raisedagainsthumanmesenchymal stemcells,recognizesanepitopeonendoglin(CD105). 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