银杏内酯B对体外培养乳鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用

中国微循环 2004 年 8 月第 8 卷第 4 期 ·213 · 银杏内酯 B 对体外培养乳鼠 心肌细胞氧化损伤的保护作用 宗刚军 , 陈景开 , 周辽军 【摘要】 目的 探讨银杏内酯 B 对体外培养乳鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用及其机制。方法 利用低浓度过氧化氢诱导原代培养乳鼠心肌细胞氧化损伤为模型 ,通过电镜观察细胞超微结构 ,以及培 养介质中 LDH活力 ,MDA 含量 ,心肌细胞内 Na + - K+ - ATPase , GSH - PX活力的改变 ,来评价银杏内酯 B 对心肌细胞的保护作用 ,并探讨其机制。结果 过氧化氢对心肌细胞有显著的损伤作用。银杏内酯B 可 使培养介质中的 LDH和 MDA 水平显著下降 ,细胞内 Na + - K+ - ATPase , GSH - PX活力显著提高 ,同时 细胞超微结构得到改善。结论 银杏内酯 B 对过氧化氢致心肌细胞损伤有保护作用 ,机理与其抑制脂质 过氧化和提高细胞内钠钾泵活力的作用有关。 【关键词】 银杏内酯 B ; 心肌细胞 ; 氧化损伤 ; 钠钾泵 中图分类号 : R285. 1 文献标识码 : A The Protective Effect of Ginkgolide B on Oxidative Injury in Cultured Rat Cardiomyocytes ZONG Gang-jun , CHEN Jing-kai , ZHOU Liao-jun. 101 Hospital of PLA , Wuxi ,214044 , China 【Abstract】 Objective To determine whether the administration of ginkgolide B is able to protect cardiomy2 ocytes against oxidative stress. Methods An experimental model of oxidative injury was established by using cul2 tured neonatal rat cardiomyocytes. Myocyte damages were estimated by lactate dehydrogenase (LDH) release and ul2 trastructural morphological alteration. Malondialdehyde (MDA) content was measured as an index of lipid perioxida2 tion. The activity of Na +- K +-adenosine triphosphatase (Na +- K +-ATPase) and glutathione peroxidase ( GSH-PX) were also assayed. Results GinkgolideB treatment significantly decreased LDH leakage and MDA production and restored activities of Na +- K +-ATPase and GSH-PX to control level . Conclusions Pretreatment with ginkgolide B protects cardiomyocytes from induced injury and the beneficial effect may be related to its antioxidant properties and thus protect Na +- K+-ATPase from oxidative stress. 【Key words】 Ginkgolide B ; Cardiomyocytes ; Oxidative stress ; Na +- K+-ATPase 文章编号 : 1007 - 8568(2004) 04 - 0213 - 03 ·心血管专辑 · 参 考 文 献 1 Lopez B , Gonzalez A , Varo N , et al . Biochemical assessment of my2 ocardial fibrosis in hypertensive heart disease[J ] . Hypertension. 2001 , 38(5) : 1222～1226 2 Morishita R , Aoki M, Ogihara T. Functional analysis of cardiovascular renin-angiotensin system using a gain or loss of function approach[J ] . Hypertens Res. 2000 ,23(2) : 137～141 3 Guan S , Fox J , Mitchel KD. Angiotensin and angiotensin converting enzyme tissue levels in two kidney one clip hypertensive rats[J ] . Hy2 pertension. 1992 ,20 :763～767 4 于学军 ,戚文航 ,顾德官 ,等 . 自发性高血压大鼠左室肥厚及心肌 纤维化的动态变化[J ] . 高血压杂志 . 1999 ,7(2) :159～162 5 Sun Y, Cleutjens J PM, Diaz Arias AA , et al . Cardiac angiotensin con2 verting enzyme and myocardial fibrosis in the rat[J ] . Cardiovasc Res. 1994 ,28 :1423～1432 6 Swynghedauw B. Molecular Mechanisms of myocardial remodeling[J ] . Physiological Rev. 1999 ,79(1) :219～262 7 蔡辉 ,胡婉英 ,王艳君 ,等 . 卡托普利逆转压力负荷增加大鼠左室 重构的机理研究[J ] . 中国微循环 . 2003 ,7(2) :89～91 (收稿 :2003 - 09 - 09 修回 :2004 - 02 - 24) 作者单位 :214044 江苏无锡 ,中国人民解放军第 101 医院心内 科 第一作者简介 :宗刚军 (1976 - ) ,男 ,汉族 ,江苏如皋人 ,心血管 病学硕士 ,住院医师。研究方向 :冠心病的防治。 氧化损伤是导致心血管疾病的一种重要的病理 现象 [1 ]。大量研究证实 ,给予外源性抗氧化剂 ,或者 激活体内的抗氧化机制以减少氧自由基对组织的损 伤 ,已经成为心血管系统细胞保护的重要措施。近年 来发现银杏叶在心血管系统有广泛的药理作用 , 已 有实验证实 ,银杏叶具有较强的抗氧化性 ,能显著改 善微循环 [2 ] ,降低血黏度 [3 ]。银杏内酯 B 是银杏叶的 J . of Chinese Microcirculation Aug. 2004 ,Vol . 8 ,No. 4·214 · 提取物 , 目前尚不清楚银杏内酯B 是否对心肌细胞 有保护作用。本实验利用低浓度过氧化氢诱导体外 培养心肌细胞氧化损伤为模型 , 观察银杏内酯 B 对 过氧化氢致心肌细胞损伤的保护作用 , 并初步探讨 其中的作用机理。 材料与方法 1 材料 DMEM/ F12 干粉型培养基 , 新生牛血清 ( Hy - clone 产品 , 美国) ; 1 ∶250 胰蛋白酶 (Difco 产品 , 美 国) ; 银杏内酯 B (中国药品生物制品检定所) ; 3 % (w/ w) 过氧化氢 (Sigma 公司 , 美国) ; 乳酸脱氢酶 (LDH) 、丙二醛 (MDA) 、钠 - 钾 ATP 酶 (Na +- K + -ATPase) 、谷胱甘肽 - 过氧化物酶 ( GSH - PX)检测试 剂盒 (南京建成生物工程研究所) 。 2 方法 2. 1 乳鼠心肌细胞原代培养 参照 Simpson 等 的方法 [4 ] ,采用 0. 125 %胰蛋白酶反复消化出生 1～3 d Sprague-Dawley 乳鼠心室肌组织块至单细胞悬液 , 差速贴壁法分离纯化 , 去除成纤维细胞等非心肌细 胞 ,用含 15 %新生牛血清的 DMEM/ F12 培养液调节 细胞密度 5 ×10 5个/ ml ,接种于 35 mm培养皿 ,置入 5 %CO2培养箱中静置培养。24 h 后 , 更换无血清培 养液 , 继续培养 48 h , 待细胞融合后出现整体搏动 , 此时的心肌细胞用于实验。 2. 2 氧化损伤模型的建立和实验分组 实验 开始时 , 所有细胞均更换新鲜无血清培养液。随机 分为 3 组 : (1) 正常对照组 : 不加任何处理因素 ; (2) 过氧化氢组 ( H 2O 2组) : H 2O 2终浓度 0. 1 mmol/ L ; (3) 银杏内酯B 组 : 0. 1mmol/ L 银杏内酯 B 孵育 30 min , 再加入终浓度为 0. 1 mmol/ L 的 H 2O2。各组继续在 5 %CO 2培养箱中培养 , 于 16 h 后终止培养 , 收集心 肌细胞及培养上清液用于实验。 2. 3 透射电镜观察细胞超微结构 将各组贴壁 细胞 PBS液洗涤 3 遍 , 用细胞刮子刮下 , 收集细胞 , 4 %戊二醛及 1 %锇酸固定 ,常规乙醇、丙酮脱水 , E2 pon812 包埋 ,超薄切片 ,铀 - 铅复染 ,透射电子显微 镜下观察超微结构。 2. 4 测定培养介质中 LDH活性、MDA含量、心 肌细胞内 Na +- K +-ATPase、GSH - PX活力 通过测 定培养介质中 LDH(单位 :μ/ L) 的含量评价过氧化 氢对心肌细胞膜的损伤程度 , 测定采用 2 , 4 一二硝 基苯肼显色法。MDA(单位 :nmol/ L)是脂质过氧化反 应的终产物 , 测定采用硫代巴比妥酸法。心肌细胞 Na +- K +-ATPase 活力的测定采取反复冻融法破碎细 胞 ,然后用定磷法测定 ,规定每小时每毫克组织蛋白 的 ATP酶分解 ATP产生 1μmol/ L 无机磷的量为一 个 ATP酶活力单位 (单位 :μ/ L) 。GSH - PX活力单位 定义 :规定为每毫克蛋白质 ,每分钟扣除非酶反应的 作用 ,使反应体系中 GSH浓度降低 1μmol/ L 为一个 酶活力单位 (单位 :μ/ L) 。蛋白定量采用考马斯亮蓝 法。 3 统计学方法 数据 x ±s 用表示。采用方差和 q 检验。P < 0. 05 有统计学意义。 结 果 1 各组心肌细胞超微结构改变 正常对照组 : 心肌细胞核较小 ,异染色质丰富 ,细胞质内线粒体发 达 , 其体积大小和形状不一 , 肌原纤维 , 肌节清晰可 见 (图 1) 。H 2O 2组 :少部分细胞细胞膜破裂 ,胞浆内 大量空洞 , 核碎裂 , 细胞器肿胀扩张 ; 多数的细胞变 小 ,胞浆致密 ,细胞器互相靠近 ,细胞核固缩 ,染色质 边集 ,聚集于核膜边缘呈境界分明块状或新月形 ,可 见凋亡小体形成 (图 2) 。银杏内酯 B 组 :多数细胞核 膜完整 ,核仁清晰可见 ,染色质分布均匀 ,大部分线粒 体基本完好 ,仅在部分区域内有少量空泡发现(图 3) 。 图 1 正常心肌细胞超微结构 ( ×6000) 图 2 电镜下可见凋亡小体形成 ( ×6000) 中国微循环 2004 年 8 月第 8 卷第 4 期 ·215 · 表 1 银杏内酯B 对培养上清液 LDH、MDA含量及细胞内 Na +- K+-ATPase、GSH - PX活力的影响 组别 LDH MDA Na +- K+-ATPase GSH - PX 对照组 H 2O 2组 银杏内酯B组 12. 66 ±4. 33 36. 89 ±7. 83 & & 21. 60 ±6. 08 * * 0. 83 ±0. 14 1. 52 ±0. 42 & & 1. 04 ±0. 29 * 2. 97 ±0. 66 1. 55 ±0. 39 & & 2. 37 ±0. 51 * * 17. 44 ±4. 70 10. 25 ±3. 57 & & 15. 56 ±4. 12 * * 注 :与对照组相比较△P < 0. 05 , △△P < 0. 01 ;与 H 2O 2 组相比较 * P < 0. 05 , * * P < 0. 01。 图 3 银杏内酯B 干预后心肌细胞超微结构 ( ×8000) 2 培养介质中 LDH、MDA 含量及心肌细胞内 Na +- K+-ATPase , GSH - PX活力见表 1。H 2O 2组培养 液中 LDH的活力显著升高 ,银杏内酯 B 可以显著抑 制 H 2O 2所致细胞膜通透性的改变 , 表现为 LDH的 漏出显著减少。H 2O 2 组培养细胞上清液中 MDA 较 对照组有明显的升高 ( P < 0. 01) ,银杏内酯B 组MDA 与正常对照组之间无明显差异 ( P > 0. 05) , 而显著 低于 H 2O 2 组 ( P < 0. 05) 。H 2O 2 组心肌细胞 Na + - K+-ATPase 活力降低了 48 % ( P < 0. 01) ,银杏内酯 B 干预后使 H 2O 2 对 Na +- K +-ATPase 的抑制作用显著 减轻 ( P < 0. 01) 。H 2O 2组心肌细胞 GSH - PX活力降 低了 41 % ( P < 0. 01) , 银杏内酯B 干预后使 H 2O 2对 GSH - PX的抑制作用显著减轻 ( P < 0. 01) 。 讨 论 本实验中 ,我们用低浓度 (0. 1mmol/ L) H2O 2模拟 心肌细胞的氧化应激状态 ,此浓度更接近于体内缺血 再灌注时活性氧产生的浓度 , 所造成损伤的过程类 似于体内活性氧导致心肌细胞损伤的病理过程 [5 ] ,以 心肌细胞凋亡样改变为主。本实验结果显示 , 银杏 内酯 B 的干预后 , 心肌细胞超微结构得到明显改 善 , 可以显著减少由于 H 2O 2所导致 LDH漏出量的 增加 , 说明银杏内酯 B 可以保护 H 2O 2 对心肌细胞 的损伤 ,维持心肌细胞膜稳定性和完整性。同时 ,银 杏内酯 B 能显著降低 MDA 含量 , 以及使细胞内 GSH - PX活力显著升高 , 说明银杏内酯 B 可以抑制 由 H 2O 2诱导的脂质过氧化 ,提高内源性抗氧化酶的 活力 , 提示银杏内酯 B 对心肌细胞的保护作用与其 具有抗氧化性有关。 Na +- K +-ATPase 是调节质膜两侧离子分布的关 键性蛋白质分子 , 其活力降低的直接后果是细胞内 Na +堆积 , K+丢失。细胞内 Na +浓度升高可以激活质 膜上的 Na +/ Ca 2 +交换蛋白 , 加速 Ca2 +向胞浆内转 运 ,促进细胞内 Ca 2 +超载 ,使细胞损伤进一步加重。 Na + - K + - ATPase 镶嵌于质膜的脂质双分子层中 , 而细胞膜又是最容易受到活性氧攻击的部位之一。 研究表明 , 活性氧可通过对 Na + - K+ - ATPase 本身 直接的损伤及对 Na + - K + - ATPase 所处微环境的 改变 , 导致 Na + - K+ - ATPase 的活力下降 , 应用多 种自由基清除剂如 SOD、过氧化氢酶、VitE等可以减 轻再灌注对心肌的 Na + - K+ - ATPase 抑制作用 [6 ]。 本实验表明银杏内酯 B 可以减轻 H 2O 2 对心肌细胞 Na + - K+ - ATPase 活力的抑制作用。由于银杏内酯 B 可以显著降低 MDA水平 , 由此可以推断 , 银杏内 酯 B 通过抑制脂质过氧化 , 阻止活性氧对细胞膜的 损伤 , 保护 Na + - K+ - ATPase 所处微环境的正常结 构和功能 , 并防止由 MDA 引起蛋白交联所导致 Na + - K + - ATPase 结构的直接破坏 , 从而维持 Na + - K+ - ATPase 的活力。 本实验证实 ,银杏内酯B 通过抑制脂质过氧化 , 提高内源性抗氧化酶的活力 , 阻止活性氧对细胞膜 的损伤 ,同时提高了细胞内钠钾泵活力 ,抑制心肌细 胞凋亡的发生 ,实现对心肌细胞保护作用。 参 考 文 献 1 Ferrai R , Agnoletti L , Comini L , et al . 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