【doc】 脊髓性肌萎缩症基因诊断

【doc】 脊髓性肌萎缩症基因诊断 脊髓性肌萎缩症基因诊断 ? 426? 脊髓性肌萎缩症基因诊断 李文磊丁新生吴婷姚娟邓晓萱 志2005年7月第38卷第7期ChinJNeurol.July2005,Vol38,No.7 【摘要】目的探讨中国人儿童型脊髓性肌萎缩症(SMA)的基因序列,基因缺失情况及错配 聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)技术在儿童型SMA基因诊断中的价值.方 法应用错配PCR-RFLP分析对34例拟诊为儿童型SMA(I型18例,?型11例,?型5例)的患 者,2O名SMA患者的健康家系成员及2O名健康人进行运动神经元存活基因(SMN)7号外显子缺失 ,并选择1例SMA患者的SMNc和1例健康人的SMNt基因7号外显子进行基因测序.结果34 例拟诊SMA患者31例(91.2%)有SMNt7号外显子缺失,其中I型18例,?型1O例,?型3例,所 有健康人均无SMN7号外显子缺失.SMNc和SMNt基因7号外显子测序长度均为187bp,两者的序 列只有1个碱基的差异(T—c),与国外报道一致.结论中国人儿童型 SMA基因序列与国外报道 一 致,I,?型基因缺失频率高,?型缺失频率较低,错配PCR—RFLP可 作为诊断I,?型SMA的有 效手段. 【关键词】肌萎缩症,脊髓性;碱基错配;聚合酶链反应;染色体,人,7 对 GeneticdiagnosisandgenesequencingofspinalmuscularatrophyLIWen—l ei,DINGXin—sheng, WUng,YAOJuan,DENGXiao—XualT~DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjing MedicalUniversity,Nanjing210029,China Correspondingauthor:DINGXin—sheng,Email:xsding@public1.ptLca 【Abstract】 ObjectiveTostudygenesequenceandthe~equencyofgenedeletionofchildhoo d— onsetspinalmuscularatrophy(SMA)inChina,andthevalueofthemismatchi ngpolymerasechainreaction— restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR—RFLP)ingenediagnosisonSMA.MethodsPCR—RFLP methodwasusedtodetectthehomozygousdeletionoftheexon7ofSMNgenei n34presumedSMApatients (18withtypeI,11withtype ?,5withtypeHI)and20normalfamilialmembersofthesepatientsand20 normalindividuals.Meanwhile,centromerlcSMNgeneofoneSMApatientandtelomericSMNgeneofone normalmemberwereselectedtoperformgenesequencing.ResultsHomozygousdeletionofexon7ofthe SMNgenewasdetectedin31of34(91.2%)casesofpresumedSMA,amongwhich18intypeI,1Oin type ?,3intypeHI,andnohomozygousdeletionwasfoundinthenormalcontrols;thesequencelengthsof theexon7oftelomericandcentromericSMNgenewereboth187bp,andtherewasonlyonenucleotide differencebetweenthetwosequences(T_+C),whichwasidenticaltoforeignreports.ConclusionsThe genesequenceofChinesepatientswithchildhood—onsetSMAWascoincide nttoforeigners,thepercentageof homozygousdeletionoftheexon7oftheSMNgenewashighintypeIand? SMApatients.yetthe percentagewaslowintypeHISMApatients.MismatchingPCR-RFLPmishtberecommendedasaneffective diagnosisfortypeIand?SMApatients. 【Keywords】Muscularatrophy,spinal;Basepairmismatch;Polymerasechainreaction; Chromosomes,human,pair7 脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA) 是一组遗传性下运动神经元变性疾病.其主要表现 为进行性,对称性肌无力和肌萎缩.儿童和成人均可 基金项目:江苏省教委自然科学基金资助项目(JW970091);江 苏省科委应用基金资助项目(BJ980083);江苏省卫生厅重点资助项 目(H2011) 作者单位:210029南京医科大学第一附属医院神经内科 通信作者:丁新生,Email:xsding@public1.ptt.js.cn . 论着 发病.1995年,Lefebvre等…克隆到SMA的致病基 因运动神经元存活基因(survivalmotor neuronalgene,SMN),并发现98.7%(226/229)的儿 童型患者存在SMNt基因缺失或中断,自此通过检 测SMNt基因缺失情况的基因诊断成为本病主要的 确诊方法.我们于1997年起就在国内率先应用错 配聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR— RFLP)分析进行该病的基因诊断,2003年7月至 2005年7月第38卷第7期ChinJNeurol,July:1 2004年8月又对SMN基因7号外显子进行了基因 测序,以探讨中国人SMA(主要是儿童型)的基因序 列及基因缺失情况,现将我们的研究结果报道如下. 资料和方法 1.对象:34例I,?型儿童型SMA患者均是 南京医科大学第一附属医院神经内科门诊及病房患 者,来自江苏,安徽,浙江,河北等省(以江苏省为 主),均为汉族,其中男l8例,女l6例,发病年龄在 5个月至l4岁.以上病例均根据病史,临床症状和 体征,实验室检查结果(包括肌电图)临床诊断为 SMA,诊断及分型符合1994年国际SMA联盟协会 会议制定的.其中I型l8例,男lO例,女8例, 年龄7,2O个月,全身严重肌无力及肌张力减退,四 肢肌力0,1级,无法坐立,呼吸及吞咽功能降低;I1 型11例,男5例,女6例,年龄2,7岁,四肢肌力 2,3级,肌张力减退,能坐但无法站立和行走;?型 5例,男3例,女2例,年龄lO,l4岁,四肢肌力3, 4级,可以独立行走.另取患者健康家系成员2O名 (患者的兄弟姐妹)及无血缘关系,无遗传病家族史 的健康人2O名作为对照. 2.DNA提取及引物合成:用乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝管各取实验对象外周血0.5ml,按照 美国GENTRA公司DNA提取试剂盒或北京帕弗瑞 生物技术有限公司的PEL—FREEZ试剂盒的操作步 骤提取DNA,并置于TE缓冲液中4?保存待用. 引物参照相应文献[2,3]合成,由中国科学院 上海细胞生物所合成.外显子7引物:R111:5一 AGACTATCAACTYAA11-rCTGATCA一3和错配引物 X7一Dra:5一CCTTCCTTC1]mTrGA哪G11-r一3. 3.PCR扩增及酶切反应:取1.5ml离心管,反 应体系为5Ol,按下列次序加样:5×Buffer5l, Mg”3l(25mmoL/L),4×dNTP1l(20p.mol/L), 引物各1l(25pmol/IM),Taq聚合酶2U,DNA模 板5p.1(100ng/p.1),置PCR扩增仪上(中科院遗传 所产PCR一90AD),94?预变性7min,然后94? 30S,55?1min,72?1min,循环35次后,72?延伸 7min.取上述外显子7的PCR扩增产物15l,加 内切酶DraI和相应的缓冲液进行酶切反应,总量为 每例25l,含DraI2单位.置于37?水浴中反应 3h. 4.电泳:配制2%琼脂糖凝胶(agrose:nusieve= 2:1),以0.5×TBE缓冲液电泳观察结果.加样量 为每孔18l(包括酶切后的产物l5l和10×加样 缓冲液3),相对分子质量标准为PGEM(Promega 公司).电压70,100V,时间约1h,0.5g/ml溴 化乙锭(EB)染色后,紫外灯下观察结果,照相. 5.基因测序:选择1例凝胶电泳仅有1条较短 片段条带的SMA患者(诊断为阳性)的DNA直接扩 增产物,另选1例凝胶电泳出现2条带的健康人(诊 断为阴性),将其1条长片段凝胶回收,两份标本送 上海博亚公司进行测序. 6.统计学方法:所有的数据均用SPSS10.0软 件进行x检验分析处理. 结果 1.基因测序结果:根据选用参照文献的引物, 我们选择测序的两份标本,1份是SMNt基因纯和缺 失的SMA患者的SMNc基因的7号外显子,1份是 健康人SMNt基因的7号外显子.2个片段测序结 果与国外报道…一致,长度均为187bp,两者的序 列只有1个碱基的差异(T—C),见图1;两者分别与 正常的SMNc及SMNt基因比较均有1个相同的碱 基差异(G—A),此不同的碱基位点是由于引入的 错配引物产生的,从而也形成了SMNc基因的DraI 酶切位点. 220230?2402030?4O TTTCCTTc000TTTC…TC—n’’T0rT’t’OTTTO…cCcT0T00 ,啊l凡』’左图:SMNc7号外显子测序结果(正向);右图:SMNt7号外 显子 测序结果(反向);箭头示SMNc和SMNt7号外显子的单碱基差 异(T—C) 图1SMN基因部分测序图 2.基因诊断结果:据我们上述基因测序结果, 以错配引物扩增出来的SMN基因7号外显子片段 长度为187bp,因SMNc基因被错配1个DraI酶切 位点,酶切后产生163bp和24bp2个片段,而 SMNt基因无此酶切位点,酶切后仍为187bp.因 此,健康人可见1条187bp带和1条163bp带(24 bp带因相对分子质量小,泳动快,已跑出胶块),而 SMA患者只有1条163bp带,无187bp带,诊断为 阳性.部分健康人可以不见163bp带,仅见187bp 带.我们临床拟诊为SMA的34例患者中,阳性31 例(91.2%),阴性3例(8.8%),其中l8例I型患 者均为阳性(100%),11例?型患者阳性l0例 (90.9%),5例?型患者阳性3例(60.0%,图2). 20名健康家系成员及20名健康对照均未检测到 SMN基因缺失. 1,4:SMA患者;2,3:健康人;M:Marker;P:阳性对照; N:阴性对照 图2部分SMA患者和健康人电泳结果 讨论 SMN基因是1995年法国Lefebvre等…发现的 位于5ql1.2,l3.3区域的导致SMA发病的决定性 基因,此基因全长20kb,含有8个外显子,在1条染 色体上有2个拷贝,在端粒侧的称为SMNt (TBCD541),在着丝粒侧的称为SMNc(CBCD541). 国外学者测序证实,这两种重复拷贝具有高度的同 源性,只有5个碱基排列顺序的差异,在外显子7和 8各相差1个碱基,SMNt外显子7的密码子280为 不C,SMNc的为唧,8号外显子的核苷酸1155在 SMNt上是G,在SMNc上是A,其他3个位于内含子 内,其转录产物约1.7kb,编码294个氨基酸.SMA 发病主要是5ql1.2,13.3区域基因异常所致,如基 因缺失,截断,移位,点突变等,而最常见的是SMNt 基因7,8号外显子部位的基因缺失,据近几年国内 外不同研究单位报道,7号和8号外显子缺失率达 90.0%,98.6%,两者几乎同时缺失,而7号外显子 的缺失率更高,凡是8号外显子缺失者7号外显子 均缺失,约5%的患者仅缺失7号外显子而8号外 显子存在.因此,临床上就可以通过检测7,8 号外显子甚至只检测7号外显子的缺失情况来进行 SMA的快速,简便的基因诊断. 检测7号外显子的缺失情况,主要是排除其同 源拷贝SMNc的干扰,错配PCR—RFLP是目前国内 外最常用的简便,迅速,准确率较高的SMA诊断方 2005年7月第38卷第7期ChinJNeurol,July2005,Vol38,No.7 法[6],其原理是在反向引物3端第2个碱基上引人 突变碱基T,使有意义链上碱基G变为A,与SMNc 外显子7的密码子280形成DraI酶切位点,SMNt 外显子7不存在此位点,酶切后电泳健康人会出现 2个条带或1个较长片段的条带(假基因丢失),而 SMA患者只有1个较短片段的条带.关于7号外 显子扩增片段的长度,国内各家报道各不相同,有 200bp,190bp,188bp等’7.,但均未进行测序,为 了证实其确切长度以及探究中国人SMN基因具体 序列情况,我们分别对SMA患者及健康人的SMN 基因7号外显子进行了基因测序,测序结果表明, SMNt和SMNc7号外显子扩增片段长度均为187bp, 两者只存在1个碱基的差别,即163碱基位置上 SMNt为C,SMNc为T,此与国外报道SMN基因序 列相同.同时,与国外报道的健康人SMN基因相 比,SMNt和SMNc均在165碱基位置上将原基因的 碱基G更替为A,此即错配引物引人的1个突变碱 基,这就在SMNc基因163碱基位置形成了1个DraI 酶切位点,因此酶切后SMNc的2个片段长度分别 是163bp和24bp. 1994年国际SMA联盟协会会议制定了SMA的 诊断及分型标准,根据发病年龄和病情轻重常将本 病分为四型,其中I,?型称为儿童型SMA,均为 常染色体隐性遗传病,新生儿发病率为1/6000, 1/10000,基因携带者频率为1/40,1/60J,居儿童 期神经肌肉疾病的第二位,发病率仅次于迪谢内肌 营养不良.此三型基因检测均表现为纯和性缺失, 据近几年各家报道,I,?型的基因缺失率基本相 似,但?型缺失率差异很大,可从40%,98%不等, 有报道?型发生点突变或移码的可能性高于I,? 型.我们的34例患者中,总阳性率为91.2%,I 型阳性率100%,II型阳性率90.9%,IU型阳性率 60.0%,IU型的缺失率也相对较低.国内吴志国 等的研究结果,?型缺失率明显低于I和?型, 分析其原因:(1)临床诊断有误;(2)SMA还存在其 他的发病机制,如基因内突变或转化或其他部位基 因异常,这可通过基因测序进一步证实;(3)遗传异 质性的存在.据埃及和越南的研究报道,他们国家 SMA的基因缺失率就很低,这提示种族和遗传因素 可能影响SMA的发病?”. 因此,我们认为,中国人SMA的分子学发病基 础与国外报道是一致的,发病机制也是以基因缺失 为主,基因诊断也适用于中国SMA患者.但SMA mm 2005年7月第38卷第7期ChinJNeurol,July2005,Vol38,No.7 的分子发病机制是非常复杂的,错配PCR-RFLP用 于临床基因检测,简便,迅速,可作为SMA诊断首选 的筛选方法.如有缺失即可确诊,对没有检测到缺 失的患者,可根据情况进一步做SMN基因定量分 析,连锁分析,必要时还要进行基因测序,可将诊断 的准确率提高到99%以上.此种方法还可以进一 步应用于SMA的产前诊断,将具有更大的临床意 义. 参考文献 lLefebvreS,BurglerL.ReboulletS,eta1.Identificationand characterizationofUspinalmuscularatrophydetermininggene.Cell, 1995.8O:l55.165. 2vanderSteegeG,DraaijerTG,GrootscholtenPM,eta1.PCR—based DNAtesttoconfirmtheclinicaldiagnosisofautosomalrecessive spinalmuscularatrophy.Lancet,1995,345:985-986. 3丁新生,姚娟,陈克连,等.脊髓性肌萎缩症的基因诊断.临床神 经病学杂志.1997,10:330-332. 4OginoS,LeonardDG,RennertH,eta1.Spinalmuscularatrophy genetictestingexperienceatanacademicmedicalcenter.JMol ? 429? Diagn.2002,4:53-58. 5NguyenDB.SadewaAH.Tal【eshimaY.eta1.DeletionoftheSMN1 andNAIPgenesinVietnamesepatientswithspinalmuscular atrophy.KobeJMedSci.2003.49:55-58. 6姚娟,丁新生,沈鸣九,等.聚合酶链反应用于进行性脊髓性肌萎 缩的诊断.中华医学检验杂志,1998,2l:l33.135. 7麻宏伟,王阳,张字瑾,等.脊髓性肌萎缩的基因诊断和产前基因 诊断研究.中国实用儿科杂志,2000,15:219-220. 8吴志国,肖波,杨晓苏,等.聚合酶链反应.限制性片段长度多态 性分析技术在儿童型脊髓性肌萎缩症基因诊断中的应用.中华 神经科杂志,2003,36:425-427. 9WirthB.AnupdateofthemutationspectrumoftheSUrvivalmotor neurongene(SMN1)inautosomalrecessivespinalmuscularatrophy (SMA).HamMutat,2ooO,l5:228-237. 10ShawkyRM.Abde1.AhemK,RifaatMM.eta1.Molecular diagnosisofspinalmuscularatrophyinEgyptians.EastMediterr HealthJ.2O0l.7:229-237. 1lKhanhTV.TakeshimaY,HaradaY.eta1.Moleculargenetic analysesoffiveVietnamesepatientswithspinalmuscul81”atrophy. KobeJMedSci.2oo2.48:177.182. (收稿日期:2004—10一l8) (本文编辑:陈秀华) 脑干脑炎20例 施磊 临床资料我院2001年2月至2003年l1月收治20例 脑干脑炎,其中男性l5例,女性5例,平均年龄37岁;急性 起病l6例,亚急性起病4例;发病前2周有上感病史者9 例,肠道感染5例,无明显感染病史者6例,5例曾有不明原 因的低热. 神经系统损害体征:单侧动眼神经麻痹者2例,双侧动 眼神经麻痹伴单侧滑车神经损害2例;单例三叉神经麻痹者 6例,双侧三叉神经麻痹者2例;单侧外展神经损害者6例, 双侧外展神经损害l例;单侧面神经麻痹者6例,双侧面神 经麻痹l例;单侧听力损害伴前庭性眼震者6例,双侧听力 损害伴前庭性眼震3例.一侧肢体运动,感觉障碍者8例, 双侧肢体运动和感觉障碍l3例.Babinski征阳性者l4例. 轻至中度脑膜刺激征4例,单侧锥体束征l0例,双侧锥体束 征l2例,Homer征6例. 辅助检查:外周血白细胞计数增高者4例,以淋巴细胞 或单核细胞增高为主.脑脊液有不同程度异常,颅内压轻度 升高者3例,自细胞数增高者l6例.头部cT扫描,5例示 脑干异常低密度病灶,增强扫描未见明显增强.l5例行头 作者单位:432800湖北省大悟县人民医院急诊科 . 病例报告. 部磁共振成像(MRI)检查,其中2例正常,l3例可见异常信 号改变,T.像低信号,T2像高信号;病灶位于中脑者3例,脑 桥8例,延髓2例,大小形态不等;所有患者磁共振增强均未 见强化. 治疗:生理盐水250ml+地塞米松l0mg+西咪替丁 1.0g+10%氯化钾5ml,静脉点滴,每日1次;2周逐渐减 量,给予口服泼尼松30ms/d,连用2周后逐渐减量至 10ms/d,维持1周,总疗程5周.同时给予生理盐水250ml +头孢他啶3g,每日1次,静脉点滴,连用1周;5%葡萄糖 +阿昔洛韦500mg,静脉点滴,每8小时1次,连用2周;5% 葡萄糖250ml+三磷酸胞苷二钠80mg,静脉点滴,每日1 次,连用2周后停用.脱水和补电解质根据颅压高低和检查 结果而定.以上治疗方法同时进行,治疗后患者痊愈4例,显 着好转者5例,好转者4例,遗留后遗症者4例.死亡者3例. 讨论脑干脑炎又称脑干型脑炎,主要表现为交叉性麻 痹,病侧周围性脑神经麻痹,对侧肢体中枢性偏瘫,偏身感觉 障碍等,病因和临床体征复杂,易与脑干梗死混淆.其病因 和发病机制尚未阐明,可能的病因和发病机制为:(1)病毒 直接侵犯脑干;(2)病毒感染后引起机体免疫反应异常所产 (下转第433页)