高氧诱导新生鼠肺上皮细胞DNA损伤及其修复基因OGG1的研究(可编辑)

高氧诱导新生鼠肺上皮细胞DNA损伤及其修复基因OGG1的研究(可编辑) 高氧诱导新生鼠肺上皮细胞DNA损伤及其修复基因 OGG1的研究 高氧诱导新生鼠肺上皮细胞损伤及其修复基因 的研究 , 导 论文课题起止时间: 生旦二 呈生兰旦 .中国医科大学辽宁 年月中国医科大学研究生学位论文独创性声明 掣嬲嶝删 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 论文作者斟:纽丛日期:鱼三:尘:丛 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学,且导师 为通讯作者,通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分保密内容除外,以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名: ‖指导教师签名: 垒二兰生:: 日 期: 二::目 录 一、摘要 中文论著摘要?.. 英文论著摘要?.. 二、英文缩略语三、论文 前言? 翮舌? 材料与实验结果??.. 讨论? 结论??..?. 四、本研究创新性的自我评价..: 五、参考文献??.. 六、附录 综述? 在学期间科研成绩 致谢? 个人简介??..中文论著摘要 高氧诱导新生鼠肺上皮细胞损伤及其修复基因 的研究 目的 支气管肺发育不良是胎龄小于周的早产儿最常见和严重的并发症, 特别好发于极低出生体重儿。相关报道显示极低出生体重儿出生体重 发病率高达%,大约%的患儿在儿童早期会因为呼吸窘迫再次入 院,特别是发生呼吸道合胞体病毒感染时。患儿常伴有长期的呼吸系统和神 经系统发育不良性疾病,可持续致青少年期甚至成年期,严重影响早产儿生 存质 量,大大的增加了医疗负担。 临床研究己证实多种危险因素均可导致早产儿的发生,包括高氧症、机 械通气性肺损伤和出生前感染。这些因素以积累和协作的方式引起肺部炎症 反应 和肺损伤,从而导致肺泡及肺血管发育障碍。目前为止,的发生机制仍不清 楚。但大量研究证实,氧化应激在的发生、发展中起到关键性作用。我们先 前的研究已证实在高氧致新生鼠的发生过程中存在氧化应激性肺损伤,其它 研究也有相关报道。 攻击可造成多种类型的氧化性损伤,从而危害细胞正常的活 力和生理功能,甚至导致癌症的发生。目前认为,氧化性损伤主要由碱基切 除修复途径修复。在哺乳动物细胞,.羟基鸟嘌呤转葡糖基酶 在碱基切除修复途径中发挥重要作用。研究发现,肺动脉内皮细胞过表 达可以减轻黄嘌呤氧化酶诱导的线粒体损伤和细胞凋亡。另有研究 显示,转染到肺动脉内皮细胞致活性表达显著降低,可使黄嘌呤氧 化酶诱导的线粒体损伤修复延迟,同时增加细胞凋亡。 研究已发现,在对抗氧化性损伤中起到重要作用。然而,高氧致新生鼠的发生 过程中是否存在肺上皮的损伤,以及该损伤是否与 基因有关相关研究少有报道。本研究就以上问题展开探索,从而阐明损伤 与的关系,试图为的防治寻找新的思路和途径。 材料与方法 一、实验模型与分组 、动物模型及分组 健康成年大鼠 ,雌雄交配:,雌鼠孕.自然分娩的 新生鼠只,生后内随机分成实验组高氧组,.和对照 组空气组,.,每组均为只,雌雄不限。 实验组高氧组将新生大鼠连同母鼠生后置于氧箱有机玻璃 箱中,持续输入氧气,氧浓度维持为%,用测氧仪持续监测美国., 浓度.%钠石灰吸收,温度,湿度%%变色硅 胶吸收水蒸气,每定时开箱 ,添加水、饲料及清理氧箱,并与空气组 交换母鼠以避免因氧中毒而致代母鼠喂养能力下降。对照组空气组置于正常 空气环境中,氧浓度为%,饲养条件及实验控制因素同实验组。 二、标本采集及处理 / 每组分别于实验后,,,,随机抽取只,%水合氯醛. 腹腔注射麻醉,腹主动脉放血后,分离肺组织,左肺至于%多聚甲醛中固定,其 中只用于冰冻切片制备免疫荧光检测肺上皮蛋白,另只用于石蜡切 片制备观察肺组织形态学改变,右肺立即置于液氮中,后于.冻存,用于 基因及蛋白等检测。 三、细胞的分离,纯化,培养及鉴定 / 新生大鼠经%水合氯醛. 腹腔麻醉处死,无菌条件下 取肺组织,分别采用胰酶和胶原酶消化、分离细胞,分离纯化后的 细胞于培养基中培养,经倒置显微镜、透射电子显微镜及.免疫荧光 共聚焦显微镜鉴定后用于实验。 . 四、实验方法及检测指标 、原代培养新生鼠细胞鉴定:倒置显微镜;透射电子显微镜; .免疫荧光共聚焦显微镜。 、染色法观察新生鼠肺组织形态学改变。 、竞争测定新生鼠肺组织和细胞中含量。 、彗星实验检测新生鼠细胞中丝条断裂。 、免疫荧光检测新生鼠肺组织中蛋白表达及定位。 、 检测新生鼠肺组织和细胞中蛋白表达。 、. 检测新生鼠肺组织和细胞中 表达。 五,统计学分析 应用 .软件进行统计学分析。组内及组间数据分析采用单因素方差 分析和,显著性检验水平为.。 实验结果 、原代培养新生鼠细胞鉴定 、倒置显微镜鉴定 呈岛状贴壁生长,细胞圆形、立方形或多边形,胞浆内有反差明显的颗粒。 、透射电子显微镜鉴定 胞质内可见细胞特异性结构板层小体,细胞表面有短小微绒毛。 、.免疫荧光共聚焦显微镜鉴定 表面活性蛋白.特异表达于细胞,可见红色荧光定位于胞浆。 二、染色观察新生鼠肺组织形态学 空气组:至,肺泡结构逐渐规则,肺泡腔大小逐渐均匀,肺泡间隔逐渐 变薄。高氧组:,与空气无明显差别:,肺泡间隔变厚,肺间质可见少量 中性粒细胞和巨噬细胞浸润;,肺泡间隔进一步变厚,肺间质中性粒细胞和巨 噬细胞浸润增加,且肺泡腔内可见少量中性粒细胞和巨噬细胞浸润;,肺泡上 皮结构破坏增加,肺间质和肺泡腔大量炎性细胞浸润,肺泡腔可见纤维蛋白 沉淀。 三、新生鼠肺组织及细胞中含量 、竞争测定肺组织中一含量 与空气组相比:高氧,含量无明显差别.;高氧,,,, 含量显著增加高氧,.;高氧,,,.。总的来说, 含量随高氧暴露时间延长而逐渐增加。 、竞争测定细胞中.含量 与空气组相比:高氧,,,,含量显著增加高氧,,, ,.。总的来说,含量随高氧暴露时间延长而逐渐增加。 四、高氧暴露诱导新生鼠细胞丝条断裂 利用碱性彗星实验检测细胞丝条断裂情况。空气对照组,只 有极少量的发生迁移;高氧,可见从细胞核显著迁移,形成“彗星 尾”;彗星尾长和尾矩是国际公认的评估丝条断裂的指标。与空气组 相比,高氧暴露组各时间点的尾长.;,,.和 尾矩,,,,.均显著增加,且随高氧暴露时间延长而逐渐增加。 五,新生鼠肺组织及细胞中蛋白表达及定位 、免疫荧光检测肺组织蛋白表达及定位 空气组及和高氧组,蛋白主要定位细胞质,且蛋白表 达无明显差异;高氧,和,细胞核和细胞质中蛋白荧光信号均显著 增加,且细胞质增加更明显。高氧,,蛋白表达最高;高氧, 蛋白表达较高氧减少,但较高氧增多。 、 检测肺组织蛋白表达 在肺组织中,我们检测到分子量大约在 的优势条带。与空气组相比, 高氧,蛋白表达无明显改变.:高氧,,,,蛋白表 达显著增加,,,.;,.。总的来说,肺组织蛋白表达 于高氧开始升高,高氧和达高峰,高氧开始下降。 、 检测细胞蛋白表达 在细胞中,我们检测到分子量大约在 的优势条带。与空气组相 比,高氧,,,蛋白表达显著增加,.;,,.; 高氧,蛋白表达无明显改变.。总的来说,细胞 蛋白表达于高氧开始升高,高氧达高峰,高氧开始下降,高氧 进一步下降。 六,新生鼠肺组织及细胞 表达 利用实时荧光定量检测肺组织及细胞中 相对表达 表达在高氧组和 量。肺组织.和细胞. 空气组各时间点均无明显差异。 ’ 结论 本研究分别通过体内和体外的高氧暴露实验,证实了在发生早期肺上皮 细胞存在氧化性损伤,且随高氧暴露时间的延长而逐渐增加。此外, 损伤修复基因表达上调可能在此过程中发挥重要作用。 关键词 支气管肺发育不良;损伤;高氧;新生;英文论著摘要 . % %,, .,, ’. , ., . , . ? 喇 . . . ,.... , ..... ? %; %; . 、? ;,,. ,.% ,、 。%%. , . ..,,, 、, % , . /, , % , , . .,,,, % . . . /, ’ . . , . . : , ? ,. 诵 . . . . 晰 . .. . . .. . , . ., ., . . ,. , , , . , , 鑫. .一 ,,..,,,. ; ,, . ., ,, . . .? 巧“’ . ,,. ,, . ,, . ;.. ,,, 谢 . . . . , ., , , . .、丽.. .,., ,,, . ,, ;. . , ,.. . , 、? ,,. ;. , .. , , ,.., , .. . . ?. , ,. , ,,, 英文缩略语 论文 高氧诱导新生鼠肺上皮细胞损伤及其修复基因 的研究 刖百 支气管肺发育不良是胎龄小于周的早产儿最常见和严重的并发症, 特别好发于极低出生体重儿。相关报道显示极低出生体重儿出生体重 发病率高达%【】,大约%的患儿在儿童早期会因为呼吸窘迫再次入 院,特别是发生呼吸道合胞体病毒感染时【】。患儿常伴有长期的呼吸系统和 神经系统发育不良性疾病,可持续致青少年期甚至成年期,严重影响早产儿 生存 质量,大大的增加了医疗负担。 临床研究已证实多种危险因素均可导致早产儿的发生,包括高氧症、机 械通气性肺损伤和出生前感染’。这些因素以积累和协作的方式引起肺部炎 症反 应和肺损伤,从而导致肺泡及肺血管发育障碍。目前为止,的发生机制仍 不清楚。但大量研究证实,氧化应激在的发生、发展中起到关键性作用。先 前研究显示,氧诱导的肺损伤在的发生中起到关键性作用,且由活性氧 诱导【。我们先前的研究已证实在高氧致新生鼠的发生过程中存在氧化应 激性肺损伤【,.,其它研究也有相关报道【。 攻击可造成多种类型的氧化性损伤,从而危害细胞正常的活 力和生理功能,甚至导致癌症的发生【 】。细胞可通过修复途径修复受损的 钔。目前认为,氧化性损伤主要由碱基切除修复途径修复【.?。 在哺乳动物细胞,.羟基鸟嘌呤转葡糖基酶在碱基切除修复途 径中发挥重要作用【’们。研究发现,肺动脉内皮细胞过表达可以减轻黄嘌 呤氧化酶诱导的线粒体损伤和细胞凋亡【。另有研究显示,转染到 肺动脉内皮细胞致活性表达显著降低,可使黄嘌呤氧化酶诱导的线粒体 损伤修复延迟,同时增加细胞凋亡【。 研究已发现,在对抗氧化性损伤中起到重要作用。然而,高氧致 新生鼠的发生过程中是否存在肺上皮的损伤,以及该损伤是否与 基因有关相关研究少有报道。本研究就以上问题展开探索,从而阐明损伤 与的关系,试图为的防治寻找新的思路和途径。 材料与方法 一、材料 一实验动物 健康成年大鼠中国医科大学附属盛京医院动物实验中心。 二试剂 、 兔抗大鼠多克隆抗体,、.抗体 标记的山羊抗兔荧光二抗 、、、 、? 试剂盒、 引物设计、试剂盒碧云天、 、蛋白北京天根、膜、试剂 染料、 盒、彗星实验试剂盒北京博乐通、、核酸酶、碱性磷酸酶、 、胰蛋白酶、型胶原酶、 培养基、胎牛血清:。 三仪器 氧箱、测氧仪美国.、气体分析仪、温度湿度计、动物 手术器械、.?超低温冰箱海尔、石蜡包埋机、石蜡切片机、冰冻切片机、 光学显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、荧光显微镜 及 图像采集软件及分析软件、透射电子显微镜、倒置相差显微镜 、细胞培养超净台、细胞培养箱、恒温水浴箱、高 速低温离心机、移液器、电子天平、紫外分光光度仪、超声匀浆器一、扩增 仪。、荧光定量仪、 电泳仪.、垂直板电泳装置.、水平摇床.、 ..图像分析软件、细胞培养皿、离心管、冻存管、六孔板、吸管、 滤网、血细胞计数板、载玻片、盖玻片、湿盒。 二、方法 一高氧致新生鼠肺损伤模型制备及标本采集 、实验动物及分组 健康成年大鼠 ,雌雄交配:,雌鼠孕.自然分娩的 新生鼠只,生后内随机分成实验组高氧组,.和对照 组空气组,.,每组均为只,雌雄不限。 、动物模型制备 实验组高氧组将新生大鼠连同母鼠生后置于氧箱有机玻璃 箱中,持续输入氧气,氧浓度维持为%,用测氧仪持续监测美国., 浓度.%钠石灰吸收,温度~?,湿度%~%变色硅胶 吸收水蒸气,每定时开箱 ,添加水、饲料及清理氧箱,并与空气组交 换母鼠以避免因氧中毒而致代母鼠喂养能力下降。对照组空气组置于正常空 气环境中,氧浓度为%,饲养条件及实验控制因素同实验组。 、标本采集 每组分别于实验开始后的,,,,随机抽取只小鼠,腹腔注射%水合 / 氯醛. 麻醉后处死。左肺组织立即置于%多聚甲醛中固定,用于 免疫荧光检测;右肺组织立即投入液氮中,后于.?冰箱中冻存,用于基因及 蛋 白检测。每组另取只小鼠,麻醉方法同前,取左肺组织置于%多聚甲醛中固定, 用于肺组织病理学观察。 二原代培养新生鼠细胞的分离、纯化、培养、分组及鉴 定 、细胞的分离、纯化、培养 新生鼠细胞的分离、纯化、培养参照我们先前的培养方法。出生 / 内的大鼠,%水合氯醛麻醉. ,%醇消毒,无菌手术器 械取肺组织剪碎、胰酶及胶原酶消化、过滤、离心 /、加培养 液悬浮细胞,移入包被的培养皿中进行免疫黏附纯化,纯化后的细胞 置于细胞培养箱内继续培养?,%,次日移除培养基及悬浮的细胞, 加入新鲜培养基分组后继续培养。 、细胞的分组 换液后的细胞随机分成实验组高氧组;.,?,%和 对照组空气组;.,,%继续培养,两组细胞均与培养后, ,,后收集细胞,用于相应的检测。 、细胞的鉴定 倒置显微镜鉴定 将细胞置于倒置显微镜下观察、摄片。 透射电子显微镜鉴定 取长满细胞的培养皿,胰酶消化,离心后取上清,加入.%戊二醛固 定,%饿酸固定,丙酮梯度脱水,醋酸铅染色,环氧树脂包埋,超薄切片后于透 射电子显微镜下观察、摄片。 .免疫荧光共聚焦显微镜鉴定 取培养的细胞,洗次,%多聚甲醛固定 ,洗 次,.% .室温孵育,洗次,%血清室温封闭,. 一抗孵育过夜,洗次,加入标记的荧光二抗?避光孵育, 洗次,染核 ,洗次,荧光共聚焦显微镜下观察、摄片。 阴性对照组用代替主要一抗,其余同前。 三光镜观察肺组织病理学改变眦 左肺组织置于%多聚甲醛中固定,常规脱水,石蜡包埋,制备“石蜡切 片,常规脱蜡,染色苏木素.伊红染色,光镜下观察肺组织形态学改变。 四竞争酶联免疫吸附法检测肺组织及细胞中 .含量 肺组织和细胞的提取按照提取试剂盒说明书 进行。利用/ 吸收率检验纯度。将热变性,核酸酶 消化,碱性磷酸酶消化 ,样品煮沸 后立即置于冰上,获得裂解产物,利用 检测 .含量,绘制标准曲线计算肺组织和细胞中.含量。具 体步骤按照说明书进行。 五彗星实验测定细胞中丝条断裂 彗星实验按照彗星实验试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下:细胞 浓度调至×个细胞/。取“细胞加入 上样胶混均后作为第二层铺 在载玻片上已经铺上第一层胶,立即盖上盖玻片,。固化,移除盖玻片。 将载玻片浸没于裂解液中,避光裂解。取出载玻片,用蒸馏水洗去过多的 盐。将载玻片置于水平电泳槽内,加入碱性裂解液. ,. ,,室温下避光解螺旋 。调节电压 /, ,室温下电泳。 取出载玻片,用中和缓冲液 .漂洗次/ 。冷乙醇脱水 ,常温 放置。 荧光染料染色,利用 荧光显微镜系统及相关软件 观察、摄片。本实验采用尾长和尾矩两个国际公认指标,对损伤程度 进行评估,并用 ..图像分析软件对相关数据进行分析。 六肺组织免疫荧光染色 左肺组织置于%多聚甲醛中固定,%蔗糖脱水,.’冻存,常规制备 冰冻切片,.% .室温孵育 ,洗次,%血清室温封闭, 兔多克隆抗。孵育过夜,洗次,加入标记的荧光二抗? 避光孵育,洗次,染核 ,洗次,荧光共聚焦显微镜下 观察、摄片。阴性对照组用代替主要一抗,其余同前。 七检测肺组织和细胞中蛋白表达 、蛋白提取及定量 取肺组织和细胞,加入蛋白裂解液,于冰上剪碎、超声粉碎机粉碎, ,取上清为蛋白提取物。用试剂 冰上裂解,离心?, , 盒按照说明书进行蛋白定量。 、 检测肺组织和细胞中蛋白表达 各时间点取蛋白 。% ,加入 的×样品缓冲液,?煮沸 .电泳,? 。将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转膜到处理过的 膜大小适当的膜用甲醇浸泡 ,再用转印缓冲液浸泡 上,转膜条件为 。%脱脂奶粉液室温封闭。加入稀释的一 。用 抗:,,杂交过夜。振荡液洗膜次,每次 稀释二抗,?孵育。振荡液洗膜次,每次 。采用试剂盒, 利用.凝胶成像分析系统化学发光分析、成像。以作为内参,利 用软件对每条蛋白电泳条带进行灰度值分析,计算蛋白相对表达量。 八 检测肺组织和细胞 表达 、提取总及定量: 组织和细胞中加入裂解液裂解组织和细胞;加入氯仿 , 用力振荡,室温静置 ;取上清移至新的管 ,离心?, , 中,加入等体积异丙醇,充分混匀,室温静置 ,离心?, ; , , 弃上清,加入%醇用水配制,轻洗管壁,离心?, , 重复次;倒掉乙醇,室温干燥,加入水溶解沉淀;采用紫外分光光度仪 测定/啪比值及浓度。 、反转录合成 调整浓度为 /; 反应体系: 试 剂 使用量 .?. ..。 反应条件:。, ;。, 、 定量反应 引物序列: ? “ .?..溶液 . 灭菌蒸馏水 ’ 反应条件: 。 ;, ;, ,; ,;,, 、定量分析 利用比较值法即计算目的 的相对表达量。三、统计学分析 应用 .软件进行统计学分析。组内及组间数据分析采用单因素方差 分析法,.有统计学差异。 实验结果 一,原代培养新生鼠细胞鉴定 一倒置显微镜鉴定 呈岛状贴壁生长,细胞圆形、立方形或多边形,胞浆内有反差明显的颗粒。 图; 二透射电子显微镜鉴定 胞质内可见细胞特异性结构板层小体,细胞表面有短小微绒毛。图 : 三.免疫荧光共聚焦显微镜鉴定 表面活性蛋白.特异表达于细胞,可见红色荧光定位于胞浆。 图; 二?染色观察新生鼠肺组织形态学 .、 空气组:图,可见肺泡结构不规则,肺泡腔小,肺泡间隔厚;图 ,可见肺泡结构变规则,肺泡间隔变薄;图,可见肺泡结构继续变规 则,肺泡间隔继续变薄:图,可见肺泡结构基本均匀一致,肺组织充分 肺泡化,肺泡间隔进一步变薄。 高氧组:图,与空气无明显差别;图,可见肺泡间隔变 厚,肺间质可见少量中性粒细胞和巨噬细胞浸润;图,可见肺泡间隔进 一步变厚,肺间质中性粒细胞和巨噬细胞浸润增加,且肺泡腔内可见少量中 性粒 细胞和巨噬细胞浸润;图,可见肺泡上皮结构破坏增加,肺间质和肺泡 腔大量炎性细胞浸润,肺泡腔可见纤维蛋白沉淀。 三、新生鼠肺组织及细胞中.含量 一竞争测定新生鼠肺组织中.含量 与空气组相比:高氧,含量无明显差别.;高氧,,,, 含量显著增加高氧,.:高氧,,,.。总的来说, 含量随高氧暴露时间延长而逐渐增加。表,图 表,各组肺组织含量的比较?, 注:.或.,与空气组比较;.或.,高氧组内比较 二竞争测定细胞中含量 与空气组相比:高氧,,,,含量显著增加高氧,,, ,.。总的来说,含量随高氧暴露时间延长而逐渐增加。表, 图 表,各组细胞含量的比较?, 注:.或.,与空气组比较;.或.,高氧组内比较 四,高氧暴露诱导新生鼠细胞丝条断裂 利用碱性彗星实验测定新生鼠细胞丝条断裂情况。空气对照组 ,只有极少量的发生迁移图:高氧,可见从细胞核显著 迁移,形成“彗星尾”图; 彗星尾长和尾矩是国际公认的评估 丝条断裂的指标。与空气组相比,高氧暴露组各时间点的尾长,.;,, ,.;表,图和尾矩,,,,.:表,图 均显著增加,且随高氧暴露时间延长而逐渐增加。 表,各组细胞中彗星尾长的比较士, 注:.或.,与空气组比较;.或.,高氧组内比较 表,各组细胞中尾矩的比较?, 注:.或.,与空气组比较;.或.,高氧组内比较 五~新生鼠肺组织及细胞蛋白表达及定位 一免疫荧光检测肺组织蛋白表达及定位 空气组图.及图.和高氧组图.,蛋白 主要定位细胞质,且蛋白表达无明显差异;高氧图.,图. 和图.,细胞核和细胞质中蛋白荧光信号均显著增加,且细胞质 增加更明显。高氧,,蛋白表达最高;高氧,蛋白表达较高氧 减少,但较高氧增多。 二 检测肺组织蛋白表达 在肺组织中,我们检测到分子量大约在 的优势条带。与空气组相比, 高氧,蛋白表达无明显改变.:高氧,,,,蛋白表 达显著增加,,,.;,.。总的来说,肺组织蛋白表达 于高氧开始升高,高氧和达高峰,高氧开始下降。表,图.表,各组肺组织中蛋 白表达的比较?, 注:.或.,与空气组比较:.或.,高氧组内比较 三 检测细胞蛋白表达 在细胞中,我们检测到分子量大约在 的优势条带。与空气组相 比,高氧,,,蛋白表达显著增加,.;,,.; 高氧,蛋白表达无明显改变.。总的来说,细胞 蛋白表达于高氧开始升高,高氧达高峰,高氧开始下降,高氧 。 进一步下降。表,图. 表,各组细胞中蛋白表达的比较 , 注:.或.,与空气组比较;.或.,高氧组内比较 六~新生鼠肺组织及细胞 表达 利用实时荧光定量检测新生鼠肺组织及细胞中 相 对表达量。肺组织.,表,图和细胞.,表,图 表达在高氧组和空气组各时间点均无明显差异。 表,各组肺组织中 表达的比较?. .. .. .. .. .. 空气组 高氧组.. .. .. .. .?. ??。。。。?。。???????一??一 注:所有时间点,. 表,各组细胞中 表达的比较?. .. .?. .?. .?. 空气组 高氧组 ./. .?. .?. .?. 注:所有时间点,. 图,原代培养新生鼠细胞鉴定:导致显微镜;透射电 镜 ?免疫荧光共聚焦显微镜图,染色观察肺组织形态学改变:空气,高氧,空气, 高氧,空气,高氧空气;高氧×? ? ?抓 ?? ?” . . . .. 九 .??? 。.,??????。。 ? .:‘???????。?叭 ? 图,肺组织和细胞中含量宰.,宰宰. 。、。。。? ; ?一’ 图,彗星实验测定细胞丝条断裂:空气,高氧, 彗星尾长,尾矩×;.,??. .上???????。图.,免疫荧光共聚焦显微镜检测肺组织蛋白表达及定位:空气 ,空气,高氧,高氧,高氧,高氧× .??一一一一?一一 熏焱::盯‘二一?一 图.,肺组织和细胞中蛋门表达.,??. ?????????????? ?~。??????~~ ????????????? , 茎 二量 喾 .考主’ 主 .笔云吣 薹??一?? 一 ?‘辜. 图,组织和细胞中 表达. 讨论 虽然是多病因疾病,但研究显示氧化应激己成为与多病因相关的导致 发生的主要致病因素【。大量研究证实,氧化应激性肺损伤参与了的 发生、发展过程。和等人发现,在患儿的支气管肺泡灌 洗液中,可见显著增加的巨噬细胞和白介素。等人【】发现,在羔羊 模型中可见大量白介素.和肿瘤坏死因子.等促炎性细胞因子存在于支气管肺泡 灌洗液中。其它研究显示,吸入高浓度氧可以增加肺组织的脂质过氧化作用,并 导致氧化应激性肺损伤【‘,。氧化应激在的发生中起到了关键性的作用已 被公认。对于氧化性肺损伤的防治,先前的研究多集中在抗氧化剂治疗等方面 。但临床应用一般抗氧化剂治疗患儿疗效甚微】。因此,从新的角度 寻求的防治方法势在必行。 氧化应激可造成多种类型的氧化性损伤,以损伤最为严重。体外研究发 现,蜡样芽胞杆菌联合镉或铅暴露于紫外线,可因抑制氧化性损伤修复机制, 而导致严重的损伤和细胞毒性的发生【。等人【】研究发现,将 细胞暴露%,可导致严重 的氧化性损伤,且损伤与高氧暴露呈 时间依从性。等人研究发现,在早产狒狒高氧机械通气模型中, 高氧机械通气组%比机械通气组维持在. 肺组织氧化性损伤显著增加。本研究采用多种方法证实了持续暴露高浓度氧 %可诱导新生鼠肺上皮氧化性损伤的发生,且随高氧暴露时间的 延长而逐渐加重。这与先前的研究结果是一致的。 攻击核和线粒体可产生多种类型的氧化性损 伤【。目前认为,是修复氧化性损伤的主要途径,并由转葡糖基 酶起始,识别和切除损伤的碱基【,。是切除氧化性损伤最重要的 修复酬们。体内研究发现,将成年大鼠暴露%氧可诱发白内障的 发生,同时可检测到晶状体损伤显著增加及蛋白表达上调。 等人刀发现,成年大鼠经口灌注柴油车尾气颗粒小时后,可 检测到肺组织损伤显著增加,同时伴肺组织 表达显著增加。 体外研究显示,将细胞暴露于高氧%可诱导严重的氧化性损 伤,然而将细胞过表达可减轻高氧诱导的损伤且增加细胞存活 率【】。大量研究显示,在对抗氧化应激诱导的损伤中起到重要的作用。 然而,是否参与了的发生过程,相关研究罕见报道。 本研究分别通过体内和体外的高氧暴露实验证实,蛋白在高氧暴露早 期随高氧暴露时间的延长而逐渐增加,达高峰后又随高氧暴露时间延长而逐渐下 降,且蛋白表达以细胞质定位的增加为主。因此,我们推测高氧诱 导肺上皮发生严重的氧化性损伤,接着激活了修复蛋白使其表 达上调,随着高氧暴露时间的延长,损伤修复减少可能部分归因于 蛋白表达减少,以致损伤持续增加。线粒体近似于电子传递链且其修 复能力相对有限,线粒体与核相比对诱导的氧化性损伤更 敏感.纠。因此,我们进一步推测细胞质和线粒体定位的在高氧的发 生过程中起到关键性作用。先前的研究显示,线粒体定位的在对抗 诱导的氧化性损伤中起到关键性作用‘盈,与我们的结果是一致的。然而, 体内和体外高氧暴露实验显示, 在高氧组所有的时间点表达均无明 显上调。 表达 与蛋白表达并不一致。因此,我们推断 在中发生中主要在蛋白水平发挥调节作用,这与先前的研究结果并不一致。 先前的研究显示,成年大鼠亚慢性暴露苯胺可诱发脾脏氧化性损伤,同 时检测到脾脏蛋白及 表达明显上调【。因此,在高氧 氧化性损伤中的具体调节机制还有待于进一步研究,也将是我们下一步要研究的课题。 结论 本研究分别通过体内和体外的高氧暴露实验,证实了在发生早期肺上皮 细胞存在氧化性损伤,且随高氧暴露时间的延长而逐渐增加。此外, 损伤修复基因表达上调可能在此过程中发挥重要作用。 本研究创新性的自我评价 支气管肺发育不良是极低出生体重儿最常见和最严重的并发症之一。 到目前为止,其发病机制仍不完全清楚,也没有有效的治疗方法。先前的研究己 证实氧化应激在的发生、发展中起到了关键性作用。我们以往的研究也证实 了高氧致新生鼠的发生过程中存在氧化应激性肺损伤。然而,在此过程中是 否存在肺上皮的氧化性损伤,以及该损伤是否与损伤修复基因有 关相关研究少有报道。 本研究通过体内体外高氧暴露实验,采用多种方法证实了发生早期肺上 皮细胞存在氧化性损伤,并进一步推测修复基因表达上调可能在 此过程中发挥重要作用。本研究试图从损伤修复的角度探索的发生机制, 为的防治寻找新的思路和途径。 参考文献. : , ..:. . , ,, . , . ,:. . , . : . , , , , . : :. . ,,:. . .. . . ,: . .。 . ,:.. &, : . . ,:. .. 。:.. . . ,: .. ,:. , ’ ., . ,:. . . . :?.. ,, .. ,:。.. ... : .:. ’, , . ,:. . ., . 凡 . . ,:,:.. . . ?. .:,:. . , , , : ,:. . , , .,:一. . , , . ,:一. , . .. :.. .只 , ,. . ,:?.. . , : . .. ,:一. , . : ..几, , 。: . 一. , , ,. :.. . , . & , ,:. , .’心 . :. : . . , . , ,, . . . .. , ,, . 厩 ,:., , , .,. ,: ?. , , . , :,。 .. ,: , ,.. ,:?.., , , ,:. . , ’ . . ,:?.. , . . ,: . , ,.,: . . , ,.,:..