葡萄籽中单宁的提取

葡萄籽中单宁的提取 张　薇1 ,胡章勇1 ,王辉宪1 ,熊兴耀2,李　霞1 ( 1 湖南农业大学理学院, 长沙 410128; 2 湖南农业大学园艺园林学院,长沙 410128) 摘　要: 用丙酮在不同浓度、不同时间内从葡萄籽中提取单宁,用正丁醇盐酸法测定单宁含量。通过比较得到最佳提取 条件为10∶7 丙酮-水体系以 16∶1的液料比进行抽提, 时间为12 h,提取温度为45℃,单宁提取率可达到 0. 95%。 关键词: 葡萄籽; 单宁;提取工艺 中图分类号: O658. 2　　文献标识码: A　　文章编号: 1001-5280( 2006) 03-0253-03 　　单宁是一类分子结构复杂的多元酚类化合物, 为 类黄酮和非类黄酮的聚合物,又称为鞣酸、单宁酸。为 淡黄色至浅棕色无晶粉末, 有水解类 condensed tannin 和缩合类ploymerized tannin [ 1]。缩合类以黄烷结构为 主干, 呈黄橙色。水解类又分缩酚酸酯型和鞣质酸两 种,呈黄色。 单宁能与蛋白质或其它聚合体(如多糖)结合, 使 其沉淀出来, 对于不溶于水的蛋白质,则使其化学稳定 性和物理稳定性增加, 起鞣制作用。 单宁与花色苷分子缩合成单宁花色苷聚合物。这 种结合态的花色苷, pH 变化和添加二氧化硫,色调变 化不明显, 而且在相同pH 条件下,结合态的花色苷呈 色分子比例要高于游离态的花色苷。此外, 单宁与花色 苷结合会增加乙醛的生成量。乙醛与花色苷反应生成 易与儿茶酚和花色啶相结合的复合物, 因此限制了花 色苷的氧化和SO 2脱色,有助于稳定葡萄酒颜色[ 2, 3]。 单宁不仅是多种传统草药和药方中的活性成分, 而且具有独特和多样的生理活性,其药学活性是综合 作用的结果。单宁对多种细菌、真菌、酵母菌都有明显 的抑制能力, 而在相同的抑制浓度下不影响动物体细 胞的生长。利用单宁治疗流感、疤疹,都与其抗病毒有 关。低分子量的水解单宁,尤其二聚糠花单宁和没食子 单宁可作口服剂用来抑制艾滋病( AIDS)病毒HIV, 与 合成的抗AIDS药物相比, 它活性较高而毒性较低。单 宁还具有抗肿瘤和抗癌变作用。仙鹤草、猪牙皂、酸模 根等草药具有抗肿瘤活性, 长期饮用绿茶和食用水果 蔬菜可有效减少癌症和肿瘤的发病率, 都与这些植物 　　收稿日期: 2006-06-18 作者简介:张　薇( 1962- ) ,女, 江苏南京人, 副教授, 从事 天然产物化学与有机化学教学与研究。 基金项目: 国家攻关计划,项目编号 2005BA531。 中所含的单宁类化合物有关。单宁是有效的抗诱变剂, 能减少诱变剂的致癌作用; 可以提高染色体精确修复 的能力;可以提高体细胞的免疫力,抑制肿瘤细胞的生 长。在这些作用中, 单宁的收敛性、酶抑制、清除自由 基、抗脂质过氧化等活性得到了集中体现。单宁还具有 抗心脑血管疾病的作用。 广泛存在于植物体的单宁是人类膳食中的一类重 要成分。由于单宁独特的化学和生物学特性,从食用植 物中提取单宁并将其纯化, 作为一类天然的食品添加 剂,可以调节食品风味, 还可以起到高效、无毒且具有 保健性的抗氧化和防腐作用。 单宁的提取大多从植物中来,如从黑荆树中提取 单宁,它属于缩合类,目前广泛应用于鞣革。但黑荆树 在我国分布少,轮伐期长, 因此单宁主要依靠进口, 价 格非常昂贵。还有利用元宝枫、土茯苓、苦菜、葡萄果等 对其中单宁进行提取的研究 [ 1, 4～6]。植物单宁化学研究 方兴未艾,对其进行广泛的基础和应用研究是非常有 意义的。本实验是探讨从葡萄籽 [ 7]中提取单宁的。 1　材料与方法 1. 1　材　料 葡萄籽采自怀化芷江白马铺;甲醇、丙酮、正丁醇、 氯化钠、盐酸均为分析纯( AR) ; 蒸馏水;硫酸铁铵溶 液,用浓度为2 mol/ L 盐酸配成2/ 100( W / V)的溶液; 葡萄单宁( CR) (化学对照品,天津尖峰天然产物开发 公司生产)。 紫外可见分光光度计、RE-52AA 型旋转蒸发器、 DLSB-5/ 10 型低温冷却液循环泵、真空恒温干燥箱、 组合恒温磁力搅拌器、电子天平。 1. 2　方　法 1. 2. 1　葡萄籽中提取单宁的方法 葡萄籽烘干 粉碎( 10 目) 脱脂 萃取 2532006 年 第 3期　　　 　　　　　　　　　　　　　　　作 物 研 究　　　　　　　　　　　　　　　 (加入萃取剂提取数小时) 过滤得母液 浓缩 在低温下加无机盐沉淀 抽滤干燥 真空干 燥得产品。 1. 2. 2　提取剂的选择 选择乙醇和丙酮作为葡萄籽单宁的提取剂, 比较 不同的提取剂对单宁的提取率。 1. 2. 3　单因素实验 液料比采用 4, 6, 8, 10, 12, 14和 16 mL/ g 7个水 平,浸提温度采用30, 35, 40, 45和 50℃5个水平,浸提 时间采用2, 4, 6, 8, 10, 12, 14和16 h 8个水平, 分别进 行单因素试验。 1. 2. 4　正交试验 选L 9 ( 33)做正交试验, 确定提取葡萄籽中单宁的 最佳工艺参数。 Fo lin法会夸大单宁含量,不仅包括缩合单宁和黄 酮的含量,也包括了其它非单宁酚, 如简单酚、带酚羟 基的氨基酸和抗坏血酸等易被氧化的物质。而与香草 醛反应除缩合单宁外, 还包括黄烷醇如儿茶素等,因此 它也能使单宁的含量有点夸大。正丁醇盐酸法, 花色素 反应,专门用于葡萄单宁的测定。基于花色素反应产生 红色物质,用分光光度法在650 nm 处进行检测。因此 本实验采用正丁醇盐酸法来测定单宁的含量。 单宁曲线的绘制:称取葡萄单宁标准品11. 5 mg 溶于10 mL 甲醇中, 吸取该溶液0, 0. 1, 0. 25, 0. 5, 1. 0, 1. 5 mL 置于10 mL 容量瓶中,加甲醇至刻度, 摇 匀。各取1 mL 于具塞瓶中, 将正丁醇与盐酸按95∶5 的体积混合后, 取出6 mL 置于具塞锥形瓶中,再加入 0. 2 mL 硫酸铁铵溶液, 混匀置沸水浴回流。加热 40 min后,立即置于冰水中冷却, 在加热完毕 15 min后, 于650 nm 波长处测定吸光度。 样品测定:将正丁醇与盐酸按95∶5的体积混合 后,取出6 mL 置于具塞锥形瓶中,再加入0. 2 mL 硫酸 铁铵溶液和1 mL 试样溶液,混匀, 置沸水浴回流。加热 40 min 后,立即置于冰水中冷却,在加热完毕 15 min 后,于650 nm 波长处测定吸光度。 2　结果与分析 2. 1　单宁的测定 测得单宁标准曲线的回归方程和葡萄籽中单宁的 提取率( %)分别为: y = 0. 0885x , r = 0. 9981 单宁( % ) = P × V 1× 100/ V 2× W 式中: y —单宁在650 nm 波长处测定的吸光度; x —相当于 0. 1 mg / mL 单宁标准溶液的毫升数; W — 鲜葡萄籽的质量, mg; V 2—比色时所吸提取液体积, mL; V 1—提取液总体积, mL; P —从标准曲线查得 的提取液所含单宁, mg ; 100换算为百分含量。 2. 2　提取剂的确定 比较提取的单宁量和后续的回收溶剂、干燥等操 作,乙醇和丙酮都比较理想。但乙醇母液中去除蛋白质 时要消耗大量的无机盐(采用等电点法除蛋白质) , 所 以选择丙酮作提取剂最优。 2. 3　液料比的影响 在55℃提取时间为4 h 的条件下, 改变液料比, 进 行葡萄籽单宁的提取试验, 结果见图1。 图1　液料比对葡萄籽单宁提取率的影响 试验结果显示, 液料比的上升会增加单宁的溶出 量,但到达一定比例后,上升的幅度明显趋缓。液料比 的大小会影响两相的混合情况,尤其在搅拌不充分的 情况下,会改变表观传质系数,从而影响传质速率[ 8, 9]。 液料比的提高会在较大程度上提高传质推动力, 增加 单宁提取率, 但也增加了后续纯化的浓缩工艺处理的 能耗,所以液料比不宜太高。本实验初步选取液料比为 14 mL/ g。 2. 4　温度的影响 在提取时间为4 h液料比为6 mL/ g 的条件下, 改 变提取温度, 进行葡萄籽单宁的提取试验, 结果见图2。 图2　不同提取温度对葡萄籽单宁提取效果的影响 45℃后, 随着温度的上升伴随着单宁提取率略有 254 CROP RESEARCH　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2006( 3) 下降,可见45℃最佳。温度过高可能导致葡萄籽单宁部 分被氧化,从而降低了提取率。 2. 5　时间的影响 在45℃液料比为 6 mL/ g 的条件下, 改变提取时 间,进行葡萄籽单宁的提取试验,结果见图3。 图 3　浸提时间对葡萄籽单宁提取率的影响 图 3表明,在12 h 前, 随着提取时间的增加,葡萄 籽单宁提取率也有所增加, 12 h 处提取率最高。12 h 后葡萄籽单宁的提取率逐渐下降,可能是细胞内溶液 和浸提液浓度经过一定时间后趋于平衡, 单宁成分溶 出量减少,而且单宁是多酚类物质,部分氧化也会使提 取率降低[ 9, 10]。 2. 6　热浸提葡萄籽单宁的正交试验 在上述单因素试验的基础上,选定3因素3水平做 正交试验,试验结果见表1。极差分析显示, 影响葡萄籽 单宁提取率的各因素的主次关系依次为热浸提料液比 ( C)、热浸提时间( B)、热浸提温度( A) , 最优组合为 A 2B2C3。 表1　正交试验结果 因素 编号 A. 温度 (℃) B.时间 ( h) C. 料液比 ( ml/ g) 单宁提取率 ( % ) 1 40 10 12 0. 54 2 40 12 14 0. 76 3 40 14 16 0. 76 4 45 10 14 0. 87 5 45 12 16 0. 95 6 45 14 12 0. 74 7 50 10 16 0. 89 8 50 12 12 0. 66 9 50 14 14 0. 76 K1 2. 067 2. 303 1. 944 K2 2. 565 2. 374 2. 390 K3 2. 310 2. 265 2. 608 R 0. 1660 0. 0363 0. 2213 优先水平 A 2 B2 C3 　　因素C 的 p 值为0. 040( < 0. 05) ,说明液料比对提 取率的影响达到显著水平,而因素B的 p 值为0. 61( > 0. 05) , 说明提取时间对提取率的影响不显著。这与直 观分析的结果相符,可见因素的主次顺序为 C> A > B,最适组合为A 2B2C3。 3　结　论 本实验初步研究了在以丙酮为萃取剂下,从葡萄 籽中提取葡萄单宁的工艺参数,得出了最佳提取工艺 条件为10∶7的丙酮-水体系作为提取溶液, 45℃下, 提取时间为12 h,液料比为16 mL/ g。得到的单宁纯度 为32/ 100(葡萄籽为100 g )。 本实验得到的产品性状如下:棕褐色粉末, 可溶解 于甲醇、丙酮、乙醇,但微溶于水。将少量产品溶于丙酮 中,再加入几滴0. 1 mol / L 的FeCl3溶液,显墨绿色。 我国每年产葡萄140多万吨,而且还在逐年增加。 一般葡萄的出籽率为8%～10% ,这样以葡萄籽为原料 生产葡萄单宁就有充足的资源。葡萄籽是葡萄酒厂的 主要副产物, 加强葡萄籽的研究, 具有十分重要的意 义,既可避免环境污染,又可提高经济效益,变废为宝。 参考文献: [ 1]　杨连利, 李仲瑾,李小贝,等. 元宝枫单宁类化合物的提取 研究[ J] . 皮革化工, 2004, 21( 5) : 1-3. 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