肌苷高产菌的转化育种及均匀设计在发酵条件试验中的应用

0 ～ 《食品与发酵工业》 Food and Fermentation Industries ／ I994 No．1 肌苷高产菌的转化育种及均匀设计在发酵条件 试验中的应用 L／ 张克旭 陈 宁 孙振环 刘永生 常佳春 郑升喜 赵 华 (天津轻工 业学院 食品工程系) ^H 摘 要 ：应用感受态细胞转化法， T'X2为供体 ，“ TSAI9为受体 ，成功地选育出丁具有目的遗传标记 Ade⋯ +Xan+8一批 +6-MI~--SG3，产肌苷高的转化于 TsxB29，在技酵条件试验 中，引进均 匀设计理论 ． 利用徽机对试验数据进行统计处理 ，找出了最佳条件。在该条件下，转化于 TSXB29摇瓶发酵平均产肌苷 27．85mg／ml，最高达29．67mg／m1．经斜面传代 15次及连续摇瓶传代 10次，发现该转化于是稳定的。经连续 1 0批稳产试验，发现其 【0批平均产肌苷 27．38mg／ml，完垒可用于工业生产中。 ／ 、 ． ． 1 1 V 关蕾词 堕，矍些， !望 毋孝象^ _卜 ．1、 孑 肌苷又称次黄嘌呤核苷，主要应 用于医 药和作为呈鲜味物质 5’。肌苷酸化学或酶 法磷酸化的前体物质【 。肌苷等核酸类物 质的发酵是典型的“代谢控制发酵 ，因此 ，优 良菌种的选育是肌苷发酵的关键。找们根据 代谢控制原理 ，利用转化技术成功地获得了 产 率 高、遗 传 稳 定 性 好 的 目的 转 化 子 TSXB29。通过采用均匀设计理论，利用微机 对实验数据进行统计处理，找出了该转化 子 的最佳发酵条件。在此条件下 ，其平均产肌苷 为 27．85mg／ml，最高达 29．67mg／ml 经连续 传代和摇瓶传代．发现该转化子是稳定的。另 外 ，通过连续 10批稳产测定 ，其 10批摇瓶产 肌苷平均为 27．38mg／ml，达到国内肌苷发酵 的先进水平 材 料 与 方 法 一 、 材料 ① 本研究系天律市科学拄l术委员会资助项日。 1．菌种 供体菌为枯草杆菌 ( sabt／b~)TX2， 遗传标记 为 Xan一(本室保存菌种)。受体菌 为枯草杆菌 TSA19，遗传标记为 Ade +His一 +8 AG +6一MI~+SG (本室保存菌种)。 2．培养基 (1)完全培养其( ) 葡萄糖 2，蛋白胨 0．5，酵母膏 ，牛肉膏 1．4，NaC1 0．25，pH 7．2。 (2)基本培养基( ) 葡 萄 糖 0．5，柠 檬 酸 钠 0．1，(NH·) SO1 0．2，M gsO{ · 7H2O 0．02，K2HPO_1．4， KH2PO1 0，6，水洗琼脂 2．0，pH7．0 (3)补充(选择)培养基 基本 培 养 基 中加 入 Ade 50峙／ml，His 50v~g／ml，Xan 50pg／ml，8一AG 50pg／ml，6一MP 300tag／ml，SG 50～2000~g／rm，pH7．0，制成各 种补充培养基。 维普资讯 http://www.cqvip.com (4)GM培 养基 lX最低盐溶液 100ml lmol／L MgSO{·7H2O 0．5ml 50 葡萄糖溶液 1．0ml 5 水解酪蛋白 0．4ml 生长因子 Ade，His各 50ug／ml 10 酵母提出物 1．0ml (5)TM培养基 lX最低盐溶液 l00ml lmol／L MgsOd·7H2O 0．5ml 50 葡萄糖溶液 1．0ml 5 水解酪蛋白 0．2ml 生长因子 Ade．His，Xan各 50g／ml (6)种子培养基( ) 葡萄糖 2．0，酵母膏 1．5，蛋 白胨 1．0． NaC1 0．25，玉米浆 0．5．尿素 0．2．Ade，His及 Xan各 0．001～0．002，pH7．2(灭菌前)，0．75 kg／cm 灭菌 15rain。 (7)发酵培养基( ) 葡 萄 糖 l0，药 用 酵 母 粉 1．6，(NHt) SO{1．1，玉米浆 0．5．Na2HPO‘·12H2O 0．5， KC1 0．2，MgSO ·7H2O 0．1，CaCOa 2．尿素 0． (分 消)，pH7．0(灭 菌前 )，I kg／cm 灭 菌 lOmin。 3．主要溶液 (1)Tris—HCI饱和重蒸酚溶液。 (2)SE溶液 l SDS，0．1mol／ml EDTA，oH9⋯6 (3)TES溶液 0．05mol／L Tris HCI，20 蔗糠 ．1mmol／L EDTA ．pH7．6。 (4)TE溶液 0．05mol／L Tris HCI，0．2tool／L EDTA， pH8．0。 (5)氯仿 一异戊醇溶液 氯仿和异戊醇按体积 24：l配制。 (6)10X撮低盐溶液 K zHPO1 · 3H2O 140g， KH2PO 60g， (NH·)2SO 20g，柠檬酸钠 LOg，MgSO ·7HfO 2g，蒸馏水 l000ml。 · 34· 二 、方法 1．DNA的制备 取活化培养的 TX2菌体培养液 5ml，于 4000r／min离心 10rain，洗 涤后 悬 于 5ml TES 溶液 中，加 入终浓 度为 5rag／ml的溶菌酶， 37℃保温 10min，加入 10ml SE溶液，55c保 温至清亮。加入终浓度为 500~g／ml蛋白酶， 37℃保温 3h，用等体积 Tris—HCI饱和重蒸酚 除蛋白2次，再用氯仿一异戊醇除一 次．加入 2．5倍体积的冷乙醇沉淀 DNA，15000r／rain 离 L-10min，收 集 DNA沉 淀．吹干 后溶 于 5ml TE液 中，4c保存。 2．转 化 采用感受态细胞转化法“ 。将培养至对 数期的受体菌悬液离心，去上清液 ，用 GM 培养基洗一次 ．然后再悬于等体积的 GM培 养基中，37C培 养 4h。以 l：10的 比例 将 GM 培养基中培养的菌液稀释于 TM 培养基 中，37℃继续培养 60～90min，加入一定浓度 的供体 DNA，37C培养 30～60min。稀释后 涂平板，检出转化子 3．发酵 种子 ：250ml三 角瓶装 20m1种子培 养 基，旋转式摇床 200r／rain，33℃培 养 I8h，八 层纱布。 发酵 ：接种量 5％，500ml三角瓶装 20ml 发酵培养基 ，旋转式摇床 200～220r／min．33 ～ 34～36℃培养 72h，八层纱布 。 4．肌苷含量的测定 采用离子交换法或纸层析法 ]，用 75l G型紫外分光光度计进行测定 。 结 果 与 讨 论 1．感受态细胞的制备 并不 是所 有 的受体 细 胞 都可 以吸 收 DNA，只有感受态细胞才具有吸收 DNA的 能力。关于感受态出现的时间及持续时间，不 同菌种有所不同 对于枯草杆菌来说 ，其感受 态H{现在对数期的后期 ，稳定期的前期。据报 道 ，预先 _r解受体细 胞从 GM 培养基 转到 维普资讯 http://www.cqvip.com TM培养基 的时间，是 获得高感受态的重要 条件 受体细胞 TSA19在 GM培养基中的生 长规律如图 1所示 图 1． TSA19菌在 GM培养基中的生长规律 由图 l可以看出，当受体细胞在 GM培 养基中培养 4h+OD 停止增长 ．根据 已有规 律，将谚细胞培养物再转接到 TM培养基中 培养，可获得高感受态。 2．DNA浓度与转化频率的关系 在一定 条件下 ，转化子 的数 目与转化 DNA的浓度有关。测定了 DNA浓度与转化 子数 目(转化子频率)的关系+结果见图 2 由图 2结果可以看 出，当 DNA浓度 为 l~g／ml时 +转化频率最高 ，可达 4．6×1 0。。 DNA浓度(0g／m1) 图 2 DNA浓度与转化频率的关系 3．目的转化子的筛选 将转化子分别转接到 MM 平板和各种 选择培养基平板上 ，根据代谢控制原理 ，有 目 的地选择只在加有 Ade，His，Xan的基本培养 基 才能生长的菌落，然后再转接到各种抗性 培养基平板上，挑选具有SG，8-AG及 6-MP 抗性菌落 ，最后，将获得的转化子在无选择压 力的条件下连续传代 ，淘汰分离的转化于．共 获得 106株遗传性状稳定 的转化子 ，对 106 株转化子进行摇瓶产肌苷测定，结果如 】 所示 。 表 I 转化子摇瓶产苷情况 一 定产苷范围的菌株数 TSXB29 TSA1 9菌 批攻 菌株数 0 ～ 0．5 0．5～ l 0 1 0～ 1 6 l 6～ 21 21 r』上 ( mg／m1) (mg／n ) (rag／m[) (mg／mi) (mg／m1) (mg／m1) (mg／m1) 】 ． 56 】 3 j 7 】5 30 1 2O．35 24 ． 07 2 50 5 g 1】 22 3 20．47 由表 1可知 ，各转化子的产肌苷能力相 差很大 ．只有少数转化子的肌苷产量高于受 体亲株．其中编号为 TSXB29菌的产苷最高 ， 达 24．07mg／ml 将 转化子 TSXB2~进行复 筛，发现其遗传标记明显，摇瓶产苷稳定．是 优秀的肌苷高产菌株。 4．种子培养基组成对发酵产苷的影响 种子生长的好坏直接影响着发酵结果 ， 一 个良好的种子培养基配方是保证蔚体生长 旺盛，发酵产肌苷稳定、高产的先决条件，参 照有关文献 ，设计 表 2所示的几种不同的 种子培养基配方 ，在相同的试验条件下进行 摇瓶发酵，结果如表 2所示 从表 2中可知 ，采用 3号培养基配方产 肌苷最好．其组成是：葡萄糖 2 ，蛋白胨 1．o oA，酵母膏 1．5 ，玉米浆 1．0 ．NaC] 0．25 及尿素 0．8 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 表2． 各种种子培养基配方爰肌苷产量 项 目 2 3 4 6 葡萄糖 2．0 2．0 2．0 2 0 2 0 2 0 2 0 蛋白胨 】．0 l_0 1 0 1 5 1．O 0 25 0．25 O．25 0．25 0．25 0．25 0．25 酵母 青 1 5 1 5 1．0 玉米浆 0 5 0．5 0．5 1．0 0．5 尿素 0 2 0 5 0．2 0．2 灭苗前 pH值 ，2 0 种子 0 53 0 60 O ． 57 0．69 0．50 0．{6 0．21 OD~so 种子终 7 5 7 7 7 ． 5 7．5 平均产 苷 24 ． 08 24．91 20．25 22 07 21 30 l7 83 (mg／m1) 5．发酵培养基组成对发酵产苷的影响 发酵培养基成分主要由葡萄糖，药用酵 母 粉，玉 米 浆，尿 素，(NH{)zSO·，Na2HP04， KC1，MgSO。及 CaCO 等成分组成。由于发酵 培养基成分较多，运用正交设计试验不便，而 单组份分别试验又不能反映出各组份之间的 影响，因此，本试验 引入均 匀设计理论。。 ，利 用微机对数据进行统计处理 ，得到回归方程， 预测出最佳发酵培养基配方 。采用 5因素 10 水平 10组试验方式，考查葡萄糖 ，药用酵母 ， 玉米浆，尿素及 (Nil．) SO 5种主要成分对菌 株 TSXB29发酵产肌苷的影响，结果见表 3。 表 3 5种成分的均匀设计表与试脸结果 因素及组成 ( ) 试验结罘 葡萄糖 玉米浆 (NH‘)?so· 尿素 药酵 (ra~／rnD X X 2 X X- X5 8．5 0．85 1．20 0．3 1．7 20．87 g．0 0．65 1．{5 0．40 2．0 l7．15 9．5 1．O0 1．15 0．50 2．3 21．09 10．0 0．80 1．40 0．60 1_5 23．60 l0．5 0．60 1．10 0．70 1．8 23．48 11．0 0．95 1．35 0．25 2．1 23．{0 11．5 0．75 1．05 0．35 2．4 l7．87 l2．0 0．55 1．30 0．45 1．6 26．17 l2．5 0．90 1 00 0．55 1．9 26．79 l3．0 0．70 1．25 0．65 2．2 14 80 采用逐步回归法用微机处理上述数据，结果 见表 4。 表 d．用逐步回归法处理量据的结果 变量常数 回归系数 75．022 标准回归系数 X - 12．882 {．963 X 2 一120．996 4 653 X3 106．32l 4 086 X J 4．852 0 187 X．0 —0．563 d．672 x 84．084 5 027 X 3 39 665 3．739 x —3．089 0．929 由表 4结果得方程 ： IR= 75．002+ 12．882X 一 120．996X2 — — 106．321X3——4．852X‘——0．563X1"-4- 84．084X2 -4-39．665 x 一3．089 Xs (【) R(相关系数)一100．00 s(标准差)一0．070 F(置信度)一3551．67> 2 一598。 方程(1)经 F检验特别显著。根据标准 回归系数的绝对值 ，各因素对产苷影响的顺 序为：X [葡萄糖]>x [玉米浆]>xs[(NH．) SO．]>x。[尿素]。 对方程(1)求偏导值，得以下结果： X1一 一 11．44，X2 一 0．72，X 3Ⅲj = 1．34， X·¨ 一0．25，X5¨ 一1．5。根据试验特点和 已取得的结果 ，在试验水平范围内，安排优化 试验 ，结果见表 5。 根据表 5的优化试验结果 ，选择第 4组 为优化配方 ，即葡萄糖 l2 ，玉米浆 1．00 ， (NH。) SO 1．00 ，尿素 0．4 及药用酵母 1．6 。 6．初始 pH、Caco 含量、菌龄及接种量 对发酵产苷的影响 采用 4因素 3水平 L'(3 )正交试验法 ， 研究了初始 pH、CaCO~含量、菌龄及接种量 对发酵产苷的影响，结果如表 6所示。 维普资讯 http://www.cqvip.com 袭 5 优 化 试 验 结 果 因素及组成( ) 产苷(mg／m1) 水平 葡萄糖 玉米装 (NI-[．) ． 尿素 药用酵母 实测值 预测值 I I2．0 1．OO I．O0 O．25 l 5 25．3I 36 77 2 l2．0 1．DO 1．O0 0．40 1．5 27．1 4 36 O{ 3 I2．0 I_0O i O0 0．25 1．6 25 42 35．8I d 1 2．0 I_00 1．O0 0．d0 I_6 27 35 35．08 袭 6 正交试验设计袭及试验结果 分析表 初 始 Caco 种啬争 种量 产苷 lR 口H值 ( ) ch) ( ) (mg／mI) 1 6．7 1．0 l5 1 5 23．9l 2 6．7 2．0 l7 5 27．58 3 6 7 4．0 l8 lO 25．1 d 4 0 1．0 l7 lO 27．45 5 7．0 2．0 18 2 5 2 ．26 6 ，．0 4．0 l5 5 2l 53 7 2 1 0 l8 23 5 8 7 1 2 O 1 5 l0 20 33 9 7 2 | 0 l7 2．5 20 97 】l 76．63 75 1【 65 77 72 ld Il 76．-．2 d 75 】7 76．O0 72 86 17．92 _l 65．05 67 6 4 76 l5 72 92 P = 5276 5 7 Ql 5305 0 5289 07 5300．17 5276．70 S 28．83 l2．50 23 60 O．13 ：ll— IR1一 IR2+ IR I 1一 IR4+ IR IR _l— IRz+ lR + lR9 I 2 lR1+ IR4+ 】R _2一 lR2+lRB+ lRa I 2=IR 3一 IR6+ lR目 lP ⋯ 一 。 q 一了1(】 + J ． + I ) s-=oI P,P=可1( 从表 6可知，初始 pit、CaCOs含量及菌 龄对发酵产肌苷的影响较大 ，而接种量影响 不大 ，如此可确定最佳条件为：初始 pit6．7～ 7．0，CaCOa含量 1．0～2．0 ．菌龄 17～18h， 接种量 5 。 7．温度对产苷的影响 为了摸索出发酵产苷 的最佳温控方式， 设计了几种不同温控方法进行摇瓶发酵 ，结 果 见表 7。 由表 7可知 ，肌苷发酵过程中采用逐步 升温的方法对肌苷积累有利。发酵前期是长 菌阶段 ，应满足菌体生长的最适温度 ，可控制 在较低 的温度；发酵中、后期适当提高温度 ， 可促进菌体代谢 ，加快酶促反应，促进肌苷积 累。但温度不易过高，否则菌体容易衰老，影 响产苷。 袭 7 沮度对发酵产苷的髟响 O～24 24～48 48～ 72 产 昔 (h) (h) (h) (rag／m1) I 34℃ 34℃ 3{C 26 97 2 32 34 36 27 63 3 34 34 36 27．40 4 32 36 36 26．O6 8．稳定性及稳产试验 (1)稳定性测定 将 目的转化子 TSXB29在完全培养基斜 面上连续传化 l5次，再进行摇瓶传代 10次 ， 测定其遗传标记与产肌苷情况，结果如表 8 所示 。 表 8．目的转化于 TBXB2~的蕾定性测定 斜 面 3 l 3 传代数 遗 传 + ’ + + } + + 标记 I 产苷 27 ． 86 27 97 27 82 27．62 28．05 27．7 d 27 92 (mg／m]) 摇瓶 a lO 传代数 遗传 + + + 标 记 产苷 26 ． 98 27．38 27 76 27．5l (mg／m1) 拄：“十”表示遗传标记为： Ade十 ltis +X一 8-AC,t+ 6-MP+ SG (2)稳产试验 对 目的转化子 TSXB29进行 ]0批稳产 维普资讯 http://www.cqvip.com 测定 ，结果如表 9所示。 衰 9． 1 0批稳产蔫定结果 批 农 1 均产苷 27 9l 27 7 (ms／m r) 批 攻 1O f均产昔 27 ． 8O 27 j5 (mg／m1) 由表 8，表 9可知，该转化子是稳定 的 完全可用于工业生产中。 主 要 参 考 文 献 It]邓祟亮等；微生物学报．1088．3，98～100 E2]张克旭 ；《微生物发酵 的代谢 与控制 3，轻工 业 出版社 ．1081 [3]张克旭等；《核酸发酵 》，轻工业出版社 ．1988 [4]王岳王 等；《微生物遗 传学 与实验技 术》．南 开大学出版社 ．1089 Is]钱存柔等；《微 生物学实验 ，北京大学出版 社 ．1985 [6]张龙翔等；《生化实验方法和技术 》，凡民教 育 出版 社 ，1985 [7]Aokl R．et a]{J Gen．A0pl Microbio1．，l963， 9(4)．387～ 896 L 8 Kawamura ct al；J．Gen．App1．M Jcrobio1．． 1980．26．345 l 9lKawamura et a】 J Viro]．．1981．37，1099 [1 0]方开泰；应用数学学报 ，1980，4．363--372 Transformation of High Inosine—producing Strain and Application of Uniform—design in Shaking Culture Zhang Kexu Chen Ning Sun Zhenhuan Liu Yongsheng Chang Jiachun Zheng Shengxi Zhaohua (Department of Food Engineering，Tlanjin Institute of Light Industry，Tianjin) ABSTRACT W ith the m ethod of com petent eels transform ation，a transform an t+which has characteristics of adenine—requiring(Ade)，histidine—requiring(His)，xanthine—requiring(Xan)，and of 8-azaguanine．6 meterapurine and sulfurguanine resistancces(8一AG ，6-M【Dr，SG )and is both high in inosine oroduc tion and high stability，Was successfully gained from TSA19 transformed with DNA donorcd by TX2． Applying the theory of uniform design and computer dealing with expe riment data ，optimal condition Was found for fermentation，under which transformant TSXB29 accumulates an average of 27．85mg／ m1 of inosine．maximal of 29．67mg／ml TSXB29 has been found t0 be stable after 15 generations on slants and l0 generations in shaking flask．Ten times of fermentation had an average of 27．38mg／ml of inosine，which illustrates tha t the strain TSXB29 is valuable in industrial application． Key words{Inosine，Transformation，Uniform design · 38 · 维普资讯 http://www.cqvip.com