真养产碱杆菌发酵生产聚β—羟基丁酸（PHB）的研究

． 25巷 第 3期 橱 明等：真养产碱 菌发酵牛 聚 译摹 j 酸fPHI3)的 究 真养产碱杆菌发酵生产聚 口一羟基丁酸(PHB)的研究 一 一 引 0008 4) 被 耀 f ’ ，专≥ 摘 要 对真荞 碱矸菌(Alcaligenes eutroph )NC1MB11599在 101 发酵罐中年 葡茸 砖仁为唯一碳源发酵兰声襄 弪基丁酸(PHB)昀发酵过程进卢 了研究。往 葡萄糖为唯一瑞 律进行了研究。买验明．氧和磷在营体生长及 PHB崎霉累过程 中起着重要埠I号。缺氧 刮 于营体呈长厦积累 PHB；在一定程曼上 瓣 ]溶解 -5,j=J可促进 PHB的稿累}在供氧 是 ．限 碡有利于 PHB 量积累； 限礴和缺蓑务件下副 曹体生长甸 PHB积累 采明限砖 主赏 聚 【}羟基丁酸酯(PHB)是微生物在不 平衡生长条件下作为储能物质而贮存于细胞 内的一种高分子聚合物 1 9_P5年法国巴 斯德研 究所 1．emoigne在 巨大 芽孢杆菌 中首 次发现，并于 1927年从 细胞 中分离 出来。 PHB不仅具有与化学合成塑料 (如聚丙烯 ) 相似的性质，而且还具有化学合成塑料所没 有的特殊性能．如生物降解性 、生物相容性 、 光学活性以及可利用再生资源进行生物合成 等。“～ 近 1 0年来，随着化学合成塑料对环 境造成日趋严重的“白色污染”，可生物降解 的研究受到人们的广泛重视 人们期待 一 种新型可生物降解塑料替代现有的石化台 成材料 其中．聚 羟基丁酸(PHB)最 为引人 注 目。英国 ICI公司经过 l 5年努力．率先于 1 990年采用真 养产碱杆菌(Alcaligenes trophus)小批量生产出了商品名为“Biopol” 的生物可降解塑料并继续对其进行研究开 发 目前 ．其生产规模已达年产 1 0001左右 的水平井扩大生产规模 目前 PHB大规模工业生产的最大障碍 是成本较高 。造成 PHB生产成本高的主要原 固是原料成本和回收成本高，因此可以通过 。 蒿 皆囊芷霉{ 鹫 。。 。 。。， 收墒 时间 ：1 998 09 12 (1)开发优 良的菌种以提高 PHB产量和 一 率 ：f 2)利用廉 价的原料 ；(3)优 化发酵生 产 PHB的过 程：(4)开发合适的提取 工=艺来 降 低成本 本文利用 l0I 发酵罐 。以真养产碱 杆菌 为菌种．研究 r在 以葡萄糖为唯 碳源 时各种条件下 PHB合成的规律 。 期通过高 密度发酵生产PHB进一步降低 PHB的生产 成本 1 青 丧与靖料 1．1 菌 株 真 养产碱杆菌 (Alcaligenes el*t*‘oph“ NCIM B 11 599 1 2 分析 菌体浓度(DCW)测定，采用细盹下重称 量 法 ；PHB含 量测 定，采 用浓 H：SO 降 解 法 ；葡萄糖含量测定，采用 3，5 硝基水畅 酸 法 ]；磷 酸 盐含 量测 定 ．采 用 钼 蓝 比色 法 ；(NH )：SO 含量测定 。采 嗣靛 定酚 蓝 比 色法 。 2 结果 与于论 2．1 缺氧条件对发酵合成 PHB的影响 D9 H 册 瑚 氧 孤 限 胞了睦 一 豫 声 重 词 生 干 键 酵 胞 关 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工 业 Food and Fe rmentation Indust ries Vo]．25 No 3 真养产碱杆菌属革兰氏阴性好 氧杆菌． 溶氧对该菌体的生长具有非常重要 的怍啊。 发酵 中 采 用较 低 的 搅 拌 速 度 (低 于 300 r／rain)，低通气量，使发酵液处于溶解氧很低 的状态下进行菌体培养。实验表明．接种后菌 体生长比较缓慢 进入菌体生长阶段 ，由于溶 解氧一直保持在很低的水平(DO<10 )．菌 PH B ^ 9 体生长受到很大影响，因此发酵液始终比较 澄清．并发现有菌体结团沉积于发酵罐底部 的现象。同时，发酵液产生刺鼻的酸味．且葡 萄糖消耗及菌体生长均十分缓慢 采用低溶 解 氧培 养，菌 体 发 酵后 期 菌 体 干 重仅 为 3．6g／l ，PHB浓度为 1．3g／I ．占菌体干重 36．9 葡萄糖 兰!竺鱼 丙酮酸— — 乙酰辅酶 A— —一三羧酸循环 + 1 乙 醚 图 1 真养产碱杆菌的葡萄糖代谢遗径 真养产碱杆菌生长代谢途径见图 1l_ 。 NH 存在，因此可以确定也非限氮方式积累 从图 l可知，真养产碱杆菌代谢过程主要有 PHB 由此可以确定 PHB是在限氧的情况 F _二个途径 ．其中．氧对发酵过程起着重要作 开始大量积累的。进入限氧阶段后，菌体净生 用。在缺氧条件下 ．真养产碱杆菌将沿途径 L 物量几乎不变．但 PHB占细胞干重 的百分舍 进行代谢产生乙酸。乙酸的产生对细胞有毒 量随时间逐渐增大 发酵最终结果：菌体细胞 害作用，大量 的乙酸将抑制菌 体的生 长和 干重 69．0 g／L．PHB浓度 55．1 g／l ，PHB占 PHB的积累 ．困此发酵过程中要维持适当的 细胞干重 79．8 。上述买验表明：当发酵液 溶解氧 在氧充足的情况下 ，菌体的葡萄糖代 中菌体浓度达到一 定值时．可以通过限氧的 谢沿途径 3进入三羧酸循环．为菌体生长提 方式使菌体大量积累 PHB 供能量 若使菌体处于非平衡生长的情况下． 如限磷、氮、硫、镁等，则葡萄糖的代谢沿途径 2进 行，生成 PHB。 2．2 限氧条件对发酵合成 PHB的影响 在发酵初期通 过提高搅拌速度和通气 量，甚至通入纯氧的方法，使发酵液中溶解氧 保持充足．发酵渣溶解氧维持在 1 5 以上 当菌体达到一定浓度时 (此时溶液中的磷源 还未耗完)．降低发酵液中的溶解氧值，使发 酵液溶解氧保持在 3 ～5 ，得到菌体生长 曲线如图 2所示。由于初期溶解氧供应比较 充足．因此菌体干重在前 20h之内上升很快， 在 2oh后，当菌体处于一个生长非常旺盛的 阶段时，维持溶解氧处于较低水平 ．达到限氧 的目的。由生长曲线可以看出．此时 PHB开 始大量积累。由于磷源在发酵过程中维持一 定浓度 ．因此 PHB的积累不是 由于磷源 的限 制造 成 的 。同 时 由 于发 酵 过 程 中 断 补 加 NH。·H：O 以调节 pH值，发酵液中始终有 2．3 限磷条件对发酵合成 PHB的影响 由图 1的代谢曲线可知，PHB的合成途 径受 (’、N、P、S、Mg 一、O!等因素的影响。肖 上述因素中的 一种或几种消耗完毕后．菌体 将沿途径 2合成 PHB 我们通过实验对限磷 法发酵 生产 PHB进 行 了研 究 在 发醇过 程 中．通过提高转速 、通气量和通纯氧的方法． 保持溶解氯>1 5 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 2j卷 第 3期 柄 明等 ：真养产碱杆菌发酵生产聚 一羟基丁酸(PHB)的研究 在菌体的生长阶段，充足的供氧使菌体 以比较高的速度生长，葡萄糖 消耗的速度很 快 ，发酵液中菌量呈直线上升的趋势 当发酵 液中的磷源消耗至接近完毕时，发酵过程进 人限磷阶段，此后菌体净生物量的变化很小． 菌体开始大量积累PHB，如图 3所示，实验表 明：在氧、氯充足时，采用限磷法 ，可以达到积 累 PHB的目的。发酵最终结果：菌体细胞干 重 1 38．2 g儿 ．PHB浓度 1]1．8 g／I ，PHB占 菌体细胞干重 80．9 时间，h 图 3 限磷条件下发酵合成 PHB的菌体牛圭乏曲线 2．4 限磷和缺氧条件对发酵合成 PHB的影 响 时间，h 【墨『4 限磷和踺氧条件下发酵台成 PHB 的菌{丰l牛长曲线 为 r研究氧、磷两 素同时作用对生产 PHB的影响，实验 中．当发酵液 中磷消耗完 毕时．停止通气．使菌体处于限磷和缺氧的陌 况 ，得到如图 4所示的菌体生长曲线 由图上可 看出．在发酵进行的前 3Z h， 菌体处于快速生长阶段，生长情况 与限磷条 件下相 同 32 h后 ，发酵液中磷源消耗完毕， 这时 ，阡始进人 PHB积累阶段 。积 累 6 h旨， 停 止供氧 1 5rain，这时菌体生长，PHB积累 均受到抑制 ．发酵液产生刺鼻的酸味，说明限 磷条件下供氧停止时将产生大量的乙酸。以 后即使通过恢复搅拌及提高转速的方法使溶 解氧达到很高 的水平 ，PHB含量亦 不再增 加，说明限磷 同时缺氧的条件对产生 PHB十 分 不 利。发 酵 结 束 后，菌 体 细 胞 干 重 60．6g／L，PHB浓度 29．5g／L，只占细胞干重 的 48．6 ，并且在停氧后一直保持不变， 通 过对 真 养产 碱杆菌 发酵 生 产 PHB的 过程进行的研究可以看出： (1)菌体代谢过程可分为两个过程 ：前期 为菌体生长期，主要为菌体净生物量的增加； 后期为 PHB积累期 ，主要是 PHB积累的过 程。在苗体生长期．各种营养物质包括溶氧在 内都应保证供应充足，这洋可以使菌体快速 生长，缩短发酵周期 ．同时为后期 PHB积累 打 好基 础 。 (2)由于 PHB是细菌在非平衡生 长的条 件下的产物，因此在发酵后期当 c、N、P、S、 Mg 、O 等营养物质中的一种或几种缺乏时 细菌将大量积累 PHB。实验表明，无论是后 期限氧还是限磷都可以达到这一目的 (3)憋酵过程在缺氧条件下进行．菌体代 谢沿产己酸途径进行．影响菌体的生存和生 长 ．不宜采 用 (4 J限磷和敏氧条件下的发酵实验表明． 当磷源消耗完毕后再停止供氧培养则菌体沿 产乙酸途径进干『代谢 ，不利于 PHB积累 参 考 文 献 1 S Later S C et at J Bacterio1．1 988．17O (iD) 4431～ 4436 2 Anderson A J，Dawes E A． M icrobio1． Rev．．1 990，54 450～ 472 3 乔 宝 义．生物 T程进 展 ．1 990．1 0(6)：43～46 4 李铁骑 ，齐昆．现代化 I ，1994．9：1 ～1 7 5 曹为超 ．化 工新 型材 料 ．1 9s,4．9：】6～1 9 R 张立新， 镜平，郭秀君等．微生物学杂志 ． 1 900 1 3 c】 ：30～ 33 7 胡 承曦 ．化工新 型材 料 ．1 996．1：l～j 维普资讯 http://www.cqvip.com _矗 与发酵工业 Food and Eerme~lation Indu sl ric．s V6i 25 No 3 8 Ward A C．Dawes E A．Ana1．Biochem．． 育出版 l}十．1 981 1 973．52：607～ 51 3 ]0 Sang Yup 9 张龙翔 生物实验方法和技术．J 京：高等教 1996．49：I～]4 Production of Poly([3_hydr0xybutyrate)from Glucose by Alcaligenes eutrophus Yang M ing Li Hongqi Zhao Huanzhu Zhang Yinliang (D~-parl rnent of Chemical Engineering Shen Zhongyao Tsinghua University，Beijing．]00084) ABSTRACT Production of poly一3一hydr。xybutyrate(PHB by A&aligenes eutrophtts NCIMB 11599 tn a 10一liter[ermem or was jnvestigated．Glucose was used as sole carbon source in the fermentation process．In the process．the rules of ceil growing and PHB accumulating were examined in {our different conditions：oxygen deficiency．oxygen inhibition．phosphorus in hihition，phosphorus inhibition and oxygen deficiency,． By,cont rasting the experimem a[re suits．it is found that both phosphorus inhibition and oxygen inhibition Cat'1 induce be pro ductlon of PHB． In the phosphorus inhibition process．cell concentration(1 38．2g,"I )，PHB concentrat【on(111．8g／'l )and PHB content(8 c)．9 )were ohtained． Key words Alcah'genes eutrophus。PHB，fermentalton，oxygen inhibition·phosphorus inhl bjtjOn 汕 头 市 金 砂 企 业 (集 团 )金 砂 化 工 j--- 生 产 _i土可 证 XK13--201 0049 化学纯级乙二胺四乙酸~ (EDTA二钠) 价格 ：24 500 ／t 分析纯级磷酸二氢钠 分析纯级磷酸氢二钠 价格 ：7 500元／t 价格 ：4 500元／t 分析纯级磷酸三钠 价格：5 500元／t 分析纯级磷酸二氢钾 价格：13 500元／t 广址 ：广东 1．头市金囝_横 4号 联 系人 ：昌本杰 吕焕 伦 开户：汕头 商行汕樟支行 驯． 办电话 ：(021)58348222 驻沈 舟 电话 ：(024)23214360 电话：(0754)825．1 557(H) 传真 ：(0754)8235985 帐号 ：0206—02450526-- 8,71 BB ：1 28× 36858,9 BB ：999656 1 8 8569276【嗖 ) 邮编 ：51j0 1 联系人 ：潘晓华 联 系^ ：何 琦 维普资讯 http://www.cqvip.com