【doc】头孢西丁和拉氧头孢纸片扩散法检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的方法比较

【doc】头孢西丁和拉氧头孢纸片扩散法检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的方法比较 头孢西丁和拉氧头孢纸片扩散法检测耐甲 氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的方法比较 蚌埠医学院2010年5月第35卷第5期513 [文章编号]1000-2200(2010)05-0513-04?检验医学? 头孢西丁和拉氧头孢纸片扩散法检测耐甲氧西林 凝固酶阴性葡萄球菌的方法比较 茆海丰,秦岭,杨晋,赵勇.营丽娟 [摘要]目的:采用头孢西丁和拉氧头孢30纸片扩散法检测耐甲氧西林凝固酶阴性 葡萄球菌(MRCoNS),并进行比较. 方法:分别采用纸片扩散法检测头孢西丁(cefoxitin,FOX)和拉氧头孢 (moxalactam,MOX)对临床分离的214株凝固酶阴性葡 萄球菌(CoNS)的敏感性,并将检测结果与PCR法和青霉素结合蛋白(PBP2a)乳胶 凝集试验检测结果进行比较.结果:经PCR 法和PBP2a乳胶凝集试验检测,214株CoNS检出MRCoNS186株.头孢西丁,拉氧 头孢纸片扩散法检测MRCoNS的敏感性和 特异性分别为100.0%,100.0%和87.1%,90.3%.两者总符合率为99.4%.结论:拉氧头 孢纸片扩散法用于批量检测 MRCoNS与头孢西丁纸片扩散法一样有着很高的敏感性和相似的特异性,两者之 间有很好的符合率. [关键词]葡萄球菌;头孢西丁;拉氧头孢;纸片扩散法;mecA基因 [中国图书分类法分类号]R378.11[文献标识码]A Comparisonofcefoxitinandmoxalactamdiscdiffusionmethodsfordetectionof methicillinresistanceincoagulase-negativestaphylococci MAOHai—feng,QINLing,YANGJin,ZHANOYong,YINGLi-juan (1.DepartmentofClinicalLaboratories,TheFirstPeopleSHospitalofLianyungang,Lianyu gangJiangsu222002; 2.FacultyofLaboratoryMedical,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030,China) [Abstract]Objective:Tocomparecefoxitinandmoxalactam30txgdiscdiffusion(DD)methodsindetectingmethicillin-resistancein coagulase— negativestaphylococci(MRCoNS).Methods:Twohundredandfourteenstrainsofclinicallyisolatedcoagulase—negative staphylococci(CoNS)weretestedbycefoxitiandmoxalactam30gDDmethods,andtheresultwascomparedwiththatbypenicillin- bindingprotein(PBP2a)andpolymerasechainreaction(PCR)detection.Results:Onehundredandeighty—sixstrainsofMRCoNSwere identificatedbyPCRandPBP2a)latexagglutinationtest.Thesensitivity/specificityofcefoxitinandmoxalactamwere100.O%/100. 0%and90.3%/87.1%.respectively.Theresultsoftwotestswereconsistentin99.4%oftheisolates.Conclusions:Moxalactam30 IxgDDmethodhasthesamesensitivityandsimilarspecificitywithcefoxitinDDmethodindetectingCoNS.TwoDDmethodsshowa similarintrinsicperformanceindetectingmethicillinresistanceinCoNS. [Keywords]staphylococci;cefoxitin;moxalactam;discdiffusionmethod;mecAgene 近年来,由于广谱及超广谱抗生素等在临床上 的广泛使用,耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌 (methicillin—resistantcoagulase—negativestaphylococci, MRCoNS)已成为医院感染的重要病原菌?J.与甲氧 西林敏感的葡萄球菌(methicillin-susceptive coagulase—negativestaphylococci,MSCoNS)卡目比, MRCoNS耐药菌谱更广,治疗更为困难.因此,对 MRCoNS进行快速准确检测,对临床上MRCoNS引 起感染的防治有着非常重要的意义.由于介导耐药 的mecA基因经常呈异质性表达,因此在凝固酶阴 性的葡萄球菌(CoNS)中检测甲氧西林耐药的表型 相对困难.目前国内临床常规检测MRCoNS的方 法均采用美国临床和实验室研究院(NCCLS/ [收稿日期]2009-01-07 [作者单位]1.江苏省连云港市第一人民医院检验科,222002;2.蚌 埠医学院医学检验系,安徽蚌埠233030 [作者简介]茆海丰(1969一),男,副主任检验师. CLSI)抗菌药物敏感性标准推荐的头孢西丁纸片扩 散法.法国生物学会(CASFM)推荐头孢西丁和 (或)拉氧头孢3Og低密度菌落法检测MRCoNS. 为了研究拉氧头孢在CLSI推荐的条件下检测 MRCoNS的可行性,我们对临床分离的214株CoNS 分别用头孢西丁和拉氧头孢进行MRCoNS检测,并 将检测结果与PCR法和青霉素结合蛋白(PBP2a) 乳胶凝集试验检测结果进行比较.现作报道. 1与方法 1.1材料 1.1.1菌株214株CoNS均分离自2005年7月 至2008年1月连云港市第一人民医院微生物实验 室的各类临床标本,其中表皮葡萄球菌73株,松鼠 葡萄球菌1株,溶血葡萄球菌78株,人型葡萄球菌 26株,模仿葡萄球菌10株,孔氏葡萄球菌5株,华 纳葡萄球菌4株,耳葡萄球菌9株,腐生葡萄球菌 2株,里昂葡萄球菌1株,头状葡萄球菌5株.细菌 5l4 分离与鉴定程序参照《全国l临床检验操作规程》(3 版),所有菌株均经过MicroScan@WalkAway@40 型全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定,质控菌株为金 黄色葡萄球菌ATcC29213. 1.1.2试剂头孢西丁和拉氧头孢(均每片30 g)药敏纸片,购自英国Oxoid公司.水解酪蛋白 (MH)琼脂,购自杭州天和微生物有限公司.PCR 反应体系,100bpDNALaddermarker,均购自宝生 物工程(大连)有限公司,PCR所需引物根椐相关文 献嵋委托上海生工合成,上游引物PI:GCAATC GCTAAAGAACTAAG,下游引物P2:AATGGG ACCAACATAACCTA,靶基因为mecA,扩增终产 物的片段大小为224bp,琼脂糖购自上海伯奥生物 科技有限公司,Biospin细菌基因组DNA提取试剂 盒购自杭州博日公司.PBP2aTESTKIT购自英国Oxoid公司. 1.1.3仪器MICROSCANWalkAway-40全自动微 生物鉴定药敏分析仪(美国DADE-Bhring公司产 品),Microtec1524R低温超速离心机,GeneAmp~ 2700型扩增仪(美国PE公司),DH一2000型凝胶成 像仪(北京华电),恒温水浴箱,DYY—m8A稳压稳 流定时电泳仪(北京六一仪器厂)等. 1.2方法 1.2.1纸片扩散法按美国临床和实验室标准研 究院(NCCLS/CLSI)2007版(M100一$17)标准进行, 菌液配制采用挑取18,24h的单个菌落以生理盐 水校正至0.5个麦氏比浊单位,在MH琼脂平板上 接种,分别将30g头孢西丁和拉氧头孢纸片贴于 含菌琼脂表面置于35?培养箱中18h后观察结 果.头孢西丁敏感性判断根据CLSI标准(M100一 S17)(耐药<25mm,敏感?25mm),参照CLSI标 准(MIO0一S17)将拉氧头孢敏感判断标准定为抑菌 环I>23mm,而将抑菌环<23mm判定为耐药. 1.2.2乳胶凝集试验按试剂盒说明书操作,所有 菌株均按要求进行苯唑西林纸片法诱导. 1.2.3PCR法检测mecA基因模板的制备依据 Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提 取细菌DNA.PCR反应体系总体积25l,其中 PCR反应体系12.51,模板2l,上游引物1txl,下 游引物1l,ddHO8.5l.反应条件为:预变性 94?5min;循环条件为94qC30S,48?30s和 72?45s,共30个循环;循环结束后72?延伸 10min.结果判断:扩增产物经2.0%的琼脂糖凝胶 电泳后在紫外灯下观察结果,出现目的条带为mecA 基因阳性(见图1). 1.3统计学方法采用配对检验. JBenchuMedCoil,May2010,Vo1.: , 1;Inec^【丈IPcR扩增产物也泳 2结果 PCR法结果阳性和(或)PBP2a乳胶凝集试验 阳性的菌株视为MRCoNS,两者都阴性者视为 MSCoNS.头孢西丁,拉氧头孢纸片扩散法检测 MRCoNS的敏感性和特异性分别为100.0%, 100.0%和87.1%,90.3%.两者总符合率为 99.4%.两法检测结果差异无统计学意义(P> 0.05)(见表1).头孢西丁和拉氧头孢纸片扩散法 检测结果与乳胶凝集/mecA基因结果不符株数分别 为3和4,菌株分布见表2.214株CoNS的头孢西 丁和拉氧头孢纸片扩散法抑菌环直径分布见图2. 表1头孢西丁和拉氧头孢纸片扩散法检测结果比较(n) 表2头孢西丁和拉氧头孢纸片扩散法检测错误结果菌 株分布情况 3讨论 B一内酰胺类抗生素对葡萄球菌的作用机制是与 其体内的PBP2a结合,而PBP2a为葡萄球菌细胞壁 合成的一种必须酶.这种酶一旦和B-内酰胺类抗 生素结合后将失去其生物学功能,从而不能合成细 胞壁而使细菌不能存活.MRCoNS之所以表现对 B-内酰胺类抗生素耐药,主要原因在于MRCoNS携 带了mecA基因,mecA基因编码一种新型的PBP2a, 匿茎堕堂QQ主月第35卷第5期 彝 涟 与CoNS内源性的PBP2a相比,PBP2a对B.内酰胺 类抗生素亲和力很低.CoNS产生PBP2a将代替原 来的PBPS合成细胞壁,从而逃避抗生素的打击. 由于MRCoNS常常还携带其它耐药基因而表现对 临床常用抗菌药物耐药,因此MRCoNS与MSCoNS 所引起感染的治疗和防控也截然不同. MRCoNS的快速,准确检测,对MRCoNS的治疗极为 重要.PCR法检测mecA基因和PBP2a乳胶凝集试 验被认为是检测MRCoNS的金标准,但是这两种 方法因为实验条件和费用的原因很难作为临床微生 物实验室MRCoNS的常规检测方法.临床实验室 一 般用苯唑西林纸片扩散法来检测耐甲氧西林葡萄 球菌,但因为CoNS往往表现为异质性耐药以及苯 唑西林检测某些MRSCN有很多假阳性,所以 NCCLS/CLSI2004年药敏标准(M100.S14)推荐用 头孢西丁纸片法代替苯唑西林来检测MRCoNS.而 CASFM推荐头孢西丁和(或)拉氧头孢30g低密 度菌落法检测MRCoNS.Join—Lamber等用 CASFM推荐的头孢西丁,拉氧头孢低密度纸片法检 测MRCoNS,其灵敏度和特异度分别为94.4%, 100.0%和100.0%,92.4%,而用CLSI的高密度法 检测头孢西丁,拉氧头孢(折点设为20mm)的灵敏 度和特异度分别为93.7%,100.0%和100.0%, 96.9%,采用ROC曲线下面积统计法显示高,低密 度两种检测方法差异无统计学意义,但纸片扩散法 检测结果与检测PBP2a结果不相符的菌株数拉氧 头孢小于头孢西丁,差异有统计学意义(P<0.01), 在国内并未见相关报道.本实验对收集的214株 CoNS的MRCoNS检测,结果头孢西丁和拉氧头孢 纸片扩散法敏感性和特异性分别为100.0%,100. 0%和87.1%,90.3%.两者总符合率为99.4%,结 果高度相关(P=0.95).由图2看出两者抑菌环直 径分布也大致相当. 目前CLSI的药敏标准里只有拉氧头孢的葡萄 球菌常规药敏的纸片法解释标准(s:?23mm,I: 2O一22mm,R:?19ram),没有专门的拉氧头孢用 于MRCoNS的筛选标准,Join—Lamber等的方法采 515 用20mm作为折点(将I菌株作为敏感株),我们用 20mm作为折点计算敏感度和特异性为81.0%和 90.3%.而采用23mm作为折点(将I菌株作为耐 药株),特异性不变,敏感度提高到100.0%.这可 能由于地区差异原因,我们认为本地拉氧头孢纸片 法检测MRCoNS的折点应采用23mm更为合适. 两种纸片扩散法检测结果与PCR法和PBP2a检测 结果不相符的菌株数分别为4和3,均为将MSCoNS 检测为MRCoNS的假阳性结果.头孢西丁纸片法4 株不符的假阳性菌株中,3株和拉氧头孢纸片法检 测出假阳性的菌株相同,另l株头孢西丁纸片法检 测结果假阳性(抑菌环直径=6IBm),拉氧头孢纸片 法检测的结果阴性(抑菌环直径=26mm). 本实验结果显示,头孢西丁和拉氧头孢两种纸 片扩散法检测MRCoNS的特异性分别为87.1%和 90.3%,差异无统计学意义(P>0.05),但低于Join. Lamber等的报道,头孢西丁纸片扩散法特异性也 低于国内相关报道,这可能与实验所取的 MSCoNS样本太少有关;另一方面,我们观察到其中 3株MSCoNS两种方法均检测为MRCoNS的菌株中 2株为表皮葡萄球菌,1株为孔氏葡萄球菌,分析其 药敏结果均对大多数非B一内酰胺类抗菌药物敏感. 这种现象在我们以前对本地区金黄色葡萄球菌的耐 药分析中也有发现,推测可能和本地区葡萄球菌 有一定比例菌株高产B一内酰胺酶有关. 拉氧头孢和头孢西丁纸片法检测MRCoNS有 较为一致的敏感度和特异性,结果总符合率达 99.4%,拉氧头孢纸片法用于实验室常规筛选 MRCoNS效果与头孢西丁相当,但本实验所检测的 菌株数较少,拉氧头孢纸片法用于实验室常规检测 MRCoNS的可行性还有待大量临床实验数据来 验证. [参考文献] [1]汪复.2007年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与 化疗杂志,2007,8(5):233—237. [2]纪冰,马筱玲,蔡朝阳,等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 SCCmec基因分型与耐药性分析[J].1临床检验杂志,2007,25 (3):204—206. f 两 孢 头 f一__._l_?:+:?加彻 避遵 516 [文章编号】1000—2200(2010)05-0516-02 JBengbuMedCoil,May2010,Vo1.35,No.5 外周血异型淋巴细胞检测的临床意义 郑岚 ? 检验医学? [摘要】目的:探讨外周血异型淋巴细胞增高的临床意义.方法:选择血涂片经瑞氏 染色镜检确认有异型淋巴细胞且比例> 0.05的患者76例.结果:39例(swo)检出异型淋巴细胞>0.1;人类疱疹病毒,巨细 胞病毒感染引起的异型淋巴细胞所占比 例明显增高.结论:外周血异型淋巴细胞增高与某些疾病密切相关,不同疾病出现 异型淋巴细胞数量有很大的差异性. [关键词】淋巴细胞;病毒感染 [中国图书资料分类法分类号]R329.24[文献标识码]A Clinicalsignificanceofdetectingheterotypiclymphocyteinperipheralblood ZHENGLan (DepartmentofClinicalLaboratories,BengbuThirdPeoplesHospital,BengbuAnhui23300 0,China) [Abstract]Objective:Toexploretheclinicalsignificanceoftheincreaseofheterotypiclymph ocyteinperipheralblood.Methods:A totalof76peripheralbloodsmearswhichcontainedmorethan0.05heterotypiclymphocyteaf firmedbymicroscopyafterWrights stainingwerecollected.Results:Theheterotypiclymphocyteexceeding0.1weredetectedint hirty—nineofthesamples(51%).Theratio ofheterotypielymphocyteinfectedbyEpstein—barrvirusandcytomegalovirusincreasedobviously.Conclusions:Thereisanintimate relationbetweentheratioincreaseofheterotypiclymphocyteinperipheralbloodandsomedis eases.Differentdiseasespresentsignificant differencesinthenumberofheterotypiclymphocyteinperipheralblood. [Keywords]lymphocyte;virusinfection 异型淋巴细胞又称病毒细胞,非典型淋巴细胞, 传染性单核细胞,刺激性淋巴细胞等』.细胞特点 是胞体较大,胞质有很强的嗜碱性,核大,染色质疏 松,甚至会出现模糊的核仁或核分裂象.胸腺嘧啶 标记技术研究发现,细胞处于s期,电镜观察发现胞 质内有大量的核糖体和扩张的内质网.正常人群的 血液中偶见异型淋巴细胞,只有当大量病毒感染或 某些原因时才会升高,一般大于0.05即有临床意 义,当升高幅度大于0.1—0.2时,对诊断更有价 值.笔者观察76例患者外周血异型淋巴细胞数 量及所占比例,探讨异型淋巴细胞增高与某些疾病 的相互关系,现作报道. [收稿日期]2009-09-07 [作者单位]安徽省蚌埠市第三人民医院检验科,233000 [作者简介]郑岚(1978一),女,检验师. 1资料与方法 1.1一般资料选自2008年在我院住院的76例 患者,男49例,女27例;年龄2,67岁.76例均经 血涂片证实外周血异型淋巴细胞>0.05,最高达 0.39(中位数为0.12). 1.2检测方法患者血液常规涂片,经瑞氏染色 后,应用双目光学显微镜油镜镜检分类,对异型淋巴 细胞数量>0.05以上者进行分析. 2结果 各种疾病异型淋巴细胞检出率(见表1). 3讨论 异型淋巴细胞是母细胞化的淋巴细胞,即成熟 淋巴细胞向幼稚阶段转化,在转化过程中形成多变 再次遇到抗原刺激时,被激活开始母细胞化,参与免 [3]PredanSC,LigozziM,FontanaR.Genotypicidentificationof methicillin--resistantcoagulase?-negativestaphylococciby polymerasechainreaction[Jj.AntimicrobAgentsChemother, 1991,35(12):2568—2573. [4]Join-LamberOF,ClauserS,GuilletC,eta1.Comparisonof cefoxitinandmoxalactam30/xgdiscdiffusionmethodsfor detectionofmethicillinresistanceincoagulase—negative staphylococci[J].JAntimicrobAgentsChemother,2007,59(4): 763—766. [5]杨广宇,吕火祥,胡庆丰,等.头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧 西林溶血葡萄球菌[J].中国微生态学杂志,2006,18(4): 319—321. [6]刘庆中,王赛芳,周铁丽,等.苯唑西林和头孢西丁纸片扩散法 现行耐药折点判断凝固酶阴性葡萄球菌甲氧西林耐药性的评 价[J].中国抗生素杂志,2006,3l(7):425—428. [7]茆海丰,刘洪书,赵勇,等.医院感染的金黄色葡萄球菌耐药性 与耐药基因检测[J].中华医院感染学杂志,2007,17(7): 790—792