重离辐照对红酵母的诱变作用

34 食 品与 发 酵工 业 Food and Fermentation Indtmtries Vol 27 No．9 重离子辐照对红酵母的诱变作用 李红玉 李成华 丁新春 王菊芳 周光明 颉红梅 李 强 党秉荣 温小琼 李文建 卫增泉 1(兰州大学生命科学学院，兰州．730000) 2(中国科学院近代物理研究所．北京．100080) 摘 要 应 用 重 离 子 加 速 器 的 50 MeV／un 重 离 子 对 胡 萝 素 生 产 菌 一 红 酵 母 (Rhodotor“ta RY Strain)进行辐 照处理．经酵母发酵实验．发现 50MeV／u 重离子对胡 萝 素生产菌—— 虹酵母具有诱变作用．并 初步筛选到产胡 萝 卜素有较大 变化 的辐 照壹异菌 株。为工业上利用重 离子对胡萝 素生产菌进行诱 变育种展现新的前景。 关键调 重 离子 红酵母 诱变作用 虽然基 因 已开始应用 于工业 微生物 育种工作，但 由于其操 作复杂，要求条件高， 所以目前在我国绝大多数工业微生物的育种 工作仍然采用常规的人工诱变育种方法。从 自然界中得到的工业微生物菌种，由于其 目 标化合物产量和质量较低而很少直接用于工 业生产，所以，一般都要经过人工诱变，以提 高产量和品质。今天我们所用的工业微生物 菌种中的绝大部分都经过了不止一次的人工 诱变。 人工诱变育种的方式包括物理诱变、化 学诱变和生物诱变。其 中物理诱变因其简单 实用 、效果明显而得到 了广泛的应用。人 们 目前普遍采用的物理诱变方法主要包括紫外 线、x射线和 射线等，由于这磐诱变源的反 复使用，导致其诱导新突变的能力减弱，老的 诱变源诱变产量的提高 已到极限，若再想使 工业微生物积 累大量新的突变，必须寻找新 的物理诱变源。 重离子辐射正是寻求新的物理诱变源的 一 种尝试。重离子和传统的物理诱变源—— x、 射线相比，具有许多独特的特性。倒如． 重 离 子 辐 射 有 能量 沉 积 效 应，有 典 型 的 Bragg峰，有较 高的生物学效应和 较小 的氧 增 比等。利用它将有可能使一些其他方法很 t第一作者 ：博士．副教授。 收稿时闻：2000一l】一30，改回时闻：20Ol一02—25 难取得诱变效果的工业微生物发生有经济意 义的突变，为工业微生物诱变育种开辟一条 新的途径，因此，本课题组从 1998年开始陆 续开展了有关 “工业微 生物重离子辐射诱变 育种”的研 究工作_lj．本文是这 一研 究工 作 的延续．初步报道 了重离子对胡萝 素生产 菌——红酵母(Rhodotorula RY Strain)的诱 变作用。 l 材料 与方法 1．1 出发菌株选育 野生型菌株的平板划线纯化培养(28℃， 3d)一 挑取 单菌落进行 种子液培 养(28℃， 120 r／min．24 h)一 平 板 筛选 培 养基 初 筛 (28℃．3 d)一平板初筛所得菌株的种子液培 养(28℃。120 r／min．24 h)一接 5％的种子液 于发酵培养基中培养(28℃．120 r／min．72 h) 一色素产量测定．筛选 出用于诱变育种的出 发 菌株 。 1．2 重离子辐射诱变处理 1．2．1 重离子辐照前的准奋 将培养好的工业微生物用无菌水稀释至 10 个／mL，然后用微量 移液器将 100 L菌 液滴加在特制辐照盒中的滤纸上，加盖，然后 将其安装在辐照盘上，将辐照盘置于辐照 口 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 27卷 第 9期 李红玉等：重离子辐照对红酵母 的诱变 作用 35 的同步马达上备用。 1．2 2 重 离子辐射 诱 变处理 将辐照盘的辐照盒依次对照辐照 口，按 照不同的辐照剂量对工业微 生物进行辐照， 辐照完毕后，取下辐 照盘，将其 中的滤纸 取 出，放入含无菌水的试管中．放入 4"C冰箱备 用 1．3 色素的测定 基本参照扬文的方法进行_2j。 1．3．1 干细胞获得 将发酵后的红酵母悬浮液离心(4 000 r／ rain，10 rain)，去除上清液，用蒸馏水洗涤 沉 淀部分 2～3次，最后将获得的细胞泥置于低 温下干燥至恒重。 1．3．2 酸 一热处理 用 3mo]／L的盐 酸浸泡干 细胞 ，一定 时 间后于沸水中放置 4 rain，迅速冷却，再离心， 洗涤沉淀部分，除去上清液，即得细胞碎片。 1．3．3 色素浸提 在上述细胞碎 片中加入适 量的丙酮溶 液，搅拌、振动后离心(4 000 r／min，20 min)， 上清液即为色素浸提液。 1．3 4 胡 萝 素含 量的计算 色素浸提液于波长 475 nm下测得其 吸 光度，按下列公式计算胡萝 素的含量 ： A ·D ·V 色素含量(旭／g干细胞) 1高 —__ 式 中， A ：最大吸收波长 475 nm 下的吸光 度 D：浸提液稀释倍数 v：浸提所用的有机溶剂的总体积／mL w ：干细胞重量／g 0．16：胡萝 素的消光系数 1．4突变体的筛选测定方法 根据平板筛选培养基上菌落的大小、形 状 、颜色进行筛选。 2 实验结果 2．1 s0 MeV／Ⅱl I离子辐照对工业微生 物的存活率和致死率 一 般 而言，存 活率小于 10％的照 射剂 量，常用作诱变育种的参考 剂量_4 J。从表 1 可以看 出，辐照剂量在 4．70～235．05Gy的 范 围内，红酵母的存活率小于 10％，因此，突 变菌株的筛选应主要在 4．70～235．05Gy照 射剂量范 围内筛选。但令人 出乎意料的是， 在存活率大于 10％的重离子辐照的红酵母 中，同样存在较多的诱变菌株(见表 2)，这一 特性似乎显示重离子辐照的诱变效果可能要 高于其他物理辐照形式。 衰 1 不 同剂量 $OMeV／u1 c‘ I离子 辐恩工业微生物后的存活率 2．2 突变菌株的初步筛选 辐照后的菌株经培养后，使每个培养皿 中红酵母的菌落数量约为 50个左右，每个剂 量有 3个培养皿，共计菌落数量约为 150个 左右，然后根据培养基上菌落的大小、形状、 颜色进行筛选从中挑选 6个差异性较大的菌 落。然后分别培养，连续传代 3代后测定其胡 萝 素的含量，并观察其形态变异情况，具体 的数据请看表 2。 从表 2可 以看 出，在 50Mev／u 的 各个辐照剂量区都存在变异菌株。无论是在 形态上，还是在胡萝 t-素产量上，辐照菌株都 发生了很大的变异。表现在菌落形态上的变 化主要是其形状 由圆形变成不规则形；在菌 落颜色上的变化有 2种，一种是 由对照的粉 红色向深红色变化，一种是 由对 照的粉红色 向浅红色直至 白色；经重离子辐照的酵母菌 苗落大小无显著的增大现象，有一些菌落却 明显反而缩小。胡萝 素含量的变化很大， 尤其是 B3—4、133—5、B3—6 3个菌株，其胡 萝 t-素的含量较对照增加近 2倍，但是，在颜 维普资讯 http://www.cqvip.com 36 食品与发酵工 业 Food and ml衄t如 Indu虻 荡 voI．27 No．9 色变至 白色的菌落 中，其其胡萝 b素的含量 较对下降了近 70％。在 50Mev／U12C6 辐照 的高剂量区中，负突变 明显高于正 突变。因 此，要从重离子辐照菌株中中筛选出一个各 个方面都适合要求的突变菌株也是 不容易 的，不能照搬过去的老经验。 衰 2 初步筛选出来的突变菌株的形态 特制殛其各突变曹株 的胡萝 卜tlP'lt,．~g-L’ B3 B3 B3 B3 B3 B3 不规则 形 +++++++++ o 76 o 56 o 76 2．15 1．94 1．98 类胡萝 素是一类有广泛应用价值的天 然色素。细菌、霉菌和酵母菌形 成类胡萝 素都有报道 ，但其中以酵母菌生产类胡萝 素有许多其 他工业微生物无法 比拟 的优点． 它不但发酵周期短，产量高 ；并且苗体含有丰 富的蛋 白质、氨基酸和维生素等，色素提取 后，其苗体下脚料还可作为饵料、饲料加 综 合利用。因此，许多国家都在竞相开发研究。 酵母苗形成类胡萝 素的种类、产量随菌种 种类的变化有很大差异，因此，挖掘优 良菌种 资源对于类胡萝 素的开发研究很有意义b】。 将重离子辐照应用于工业微生物诱变育 种，为我们筛选优质高产的工业微生物提供 了一 条 新 的 途 径。我 们 的 实 验 显 示．5O MeW U12 辐照产生胡萝 素的红酵母后， 在其各个辐照剂量区都存在变异菌株，而其 他物理诱变源所诱导的微生物变异则主要出 现在存活率小于 10％的照射剂量内。重离子 诱变菌株的的选择范围要远远高于其他物理 诱变源。这不但为工业上利用重离子对胡萝 b素生产苗进行诱变 育种展现出新的前景． 而且也同样为工业上利用重离子对其他工业 微生物进行诱变育种展现出新的前景。 参 考 文 献 1 颉红梅，卫增泉 ，李文 建 中国抗生素杂志， 1998．23：462～ 463 2 扬文 ，古春 明 微生物学通报 ，1995，22：58 ～ 59 3 F．奥斯 伯等 ．精编 分子生 物学实验 指南 ． 颜子颖 、王海 林译 ，垒冬 雁校 ．北 京：科 学出版 社， 1998 483——484 4 彭 仁 旺．管考梅，黄 秀梨 微 生物 学通 报， 1995．22：197～ 199 5 张 晓 君，白玲，马 晓 军 微 生 物 学通 报 1998．25：82～ 84 欢迎订阅<食品研究与开发》 ‘食品研究与开发)是全国公开发行的双月刊 ．统一刊号：CN12—1231／TS ISSN 1005—6521。内容包括 ；食品 营养基础理论研究、食品营养科昔知识 、食品工艺研究、名特优新食品工艺介绍、食品机械、新产品开发、食品文摘和食 品检 测等。 该刊 2o02年为太 l6开本 ．64页，每期定价 6 50元．垒年定价 45元。欢迎订阅、投稿、措谈广告业务。邮汇 ：天津 市食品研究所‘食品研究与开发)编辑部 地址 ：天津市南开 区卫津 甫路 36号 邮编：300381 电话 ：022— 23944872 23015659 银行亍[教；天津市河西区平山遭天津市商业银行天马支行。 帐号 ：1063g120109(~48704 } + + + 十 + ¨ ¨} } } + + + + + ¨} } 十 + 形 形 形 形 形 则 则 圆 圆 圆 规 规 1÷ 1÷ 加 4 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 27卷 第 9期 李红玉等 ：重离 子辐照对红酵母 的诱变作甩 37 M atagensis on Rhodotorula RY Strain Irradiated by Heavy Ion Li Hongyu Li Chenghua Ding Xinchun W ang Jufang Zhou Guangming。 Xie Hongmei Li Qiang Dang Bingrong Wen Xiaoqiong Li W enjian Wei Zengquan 1(Dept Biochemistry and Molecular Biology， School of Life Science，Lanzhou University Lanzhou，730000) 2(Institute of Modern Physics，Academia Siniea，Beijing，100080) ABSTRAcT The red yeast(Rhodotorula RY strain)，carotene producing strain，was irradiated bv 50 MeV／ul0C6 heavy ion from heavy ion accelerator The results showed that 50 Mev／U“ c6 heavv ion can give raise to mutagensis effect．Several mutants were screened that produeed carotene ahnormally．This wil1 present a new propeet for the application of heavy ion mutuger~is in industrial microbiology breeding． Key words heavy ion，Rhedotorula ，m utagenesis effect §澹§毫藩霉囊 日本发明果蔬保鲜新方法 日本庆应大学 白鸟世明教授等利用从竹子中提取的物质，开发了一种水果和蔬菜保鲜新方棰。研 究人员 竹子表皮提取出乙烯氧化酶，并使用脱乙酰壳多糖制成壳质凝腔．潦敷在发泡塑料嚷上对蔬菜和水果进 行保群。用这种方棰制作出的新型保鲜嗅已经 投 放市场。 据介绍．乙烯氧 化酶是一 种天然 的埴物 性 物质 ，因此安全 性高。迄今 为止的试验 结果证 明，使用这种物质 ，可使苹 果的保鲜 期延长到 1 个月以上．芹菜可达 2周 上。据称 ．把乙烯氧 化酶液加以稀释，直接垛抹在 水果 表面 ．也能够 起到保蛘作用。 笆 开发出可杀菌吸水的食品 俄罗斯实用生物技术研究院最近开发 出了 可吸水杀菌并能多敬使用的食品包装 袋。据俄 (科学与生活)杂志报道．为使 奶酪 、香肠等容 易 变质的食品能保存得时 间长一些。俄 专家在食 品包装材料 的聚 合物 中器 加了脱水 的酸化物 、 多种矿物盐和酶等物质。富含这些 物质的包装 袋内表面可吸收多余水分．杀 灭细菌，从而改善 了包装袋的内部环境 。添加物 中的酶还能调节 食物的气味。 在研制上述 包装袋的过程 中．还必 须解决 一 个重要问题。即防止包装 材料中 的舔加物 进 人食物成分。俄专家运用多敬玲 冻和解球 的技 术解决了这一问题 为使新型包装袋能够被反 复使用 ．科研 人 员还 向包装料 中蘼加了 胃蛋 白 酶 。用 这种材料制成的包装袋可 在一个特定 工序中反复使用 9欢，从而减 少了包装袋 的耗 费 。降低了生产成本。 全国中文核心期刊 轻工行业优秀期刊 食品工业科技 杂志 1979年创刊，是 北京市食品工业研究所主办，国内外公开发行 的综合性食品科技一级期刊 《食品工业科 技 既是反映当前国内外食品工业技术水平的 窗口，又是新技术应用推广的桥梁，面向科研、 生产 ，满足各层次需求 《食品工业科技 杂 志特点：影响大，范围广，技术新，内容实， 信息快 。 为了加速科技信息传递 ，满足广大读者的 要求，“食品工业科技*2002年改为月刊。 0 大 l6开．180页；单价：8元，垒年：96 元； 刊号：ISSN1002-0306tCN11-1759／TS， 邮发代号：2-399：可通过邮局订阅，或直接 I汇款至本刊编辑部订阅。 t~1t12：100075北京市永外沙子口路70号 电话：010-67215557转3026或3065 ：1 传真：010-87287944 一技 一科 一业 一工 一品 一食 维普资讯 http://www.cqvip.com