利用WL营养培养基鉴定葡萄酒中的相关酵母菌

利用WL营养培养基鉴定葡萄酒中的相关酵母菌 利用WL营养培养基鉴定葡萄酒中的相关 酵母菌 利用WL营养培养基 鉴定葡萄酒中的相关酵母菌 杨雪峰,苏龙.,刘树文: (1.中粮华夏长城葡萄酒有限公司,河北昌黎066600;2.西北农林科技大学葡萄酒学 院,陕西杨凌712100) 摘要:采用wL营养培养基对自然发酵前,中,后期出现的酵母菌进行了初步的分类 鉴定.产膜的 假丝酵母,葡萄汁有孢汉逊酵母及酿酒酵母在自然发酵初期占据主导地位,主要来 自葡萄浆果表面;发酵中 期主要为毕赤氏酵母;后期则全部为酵母属的酿酒酵母.wL营养培养基对于监测 葡萄酒发酵过程中酵母菌 群的变化十分有力,可以作为葡萄酒相关酵母鉴定的辅助手段. 关键词:wL营养培养基;自然发酵;葡萄酒酵母筛选:鉴定 中图分类号:TS261.11文献标识码:A UsingWLmediumtoidentifyrelatedyeastsinwinefermentationperiod YangXuefeng',SuLong,LiuShuwen (1.HuaxiaGreatWallWineryCo.,Ltd,Changli,Hebei066600) (2.CollegeofEnology,NorthwestSci— TechA&FUniversity,Yangling,Shanxi712100) AbstractYeastcoloniesisolatedfromprophase,metaphaseandanaphaseofspontaneousfer mentationwereidentifiedprimarily onWallersteinLaboratoryNutrientAgar(WLagar)Candida,HanseniasporaandSaccharom yceswerepredominantinprophaseof winefermentationandPichiainthemetaphaseoffermentation.ButonlySaccharomycescere visiaeexistedintheanaphaseof fermentation.WLmediumwasfitformonitoringthechangeofyeastsinwinefermentationan dusefulintheidentificationofwineyeasts Keywords:WLnutrientagar;spontaneousfermentation;wineyeastisolation;identification 葡萄酒酿造是一个复杂的生 态学及生物化学过程,包含了各种 不同的酵母菌种的顺序变化.这些 酵母菌主要来源于葡萄浆果表面 及酒厂设备?].大多数研究表明, 在葡萄浆果表面占据主导地位的 酵母菌主要是葡萄汁有孢汉逊酵 母,假丝酵母,红酵母及克鲁维酵 母.非酵母属的酵母在发酵初期生 长良好,随后被耐酒精能力更强及 收稿日期:2006—07—13 在高糖环境中更具竞争力的酵母 属酵母所代替.本文利用了wL 营养培养基来监测葡萄酒自然发 酵过程中酵母菌群的动态变化过 程.筛选到的酵母菌根据其在wL 营养培养基上培养所形成的菌落 颜色和形态来区别. 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1菌种来源 东北山葡萄酒产区长白山酒 厂自然发酵酒样(2005年). 1.1.2培养基及试剂 (1)YEPD培养基:酵母浸粉 1.0%;蛋白胨2.0%;葡萄糖2.0 琼脂2.0%.为了在筛选过程中排 除细菌的干扰,在YEPD培养基中 外加100mg/L的氯霉素. (2)wL营养培养基,成分含 量见表1. 表1WL营养培养基 的成分含量(g/L) 酵母浸粉 胰蛋白胨 葡萄糖 磷酸二氢钾 氯化钾 氯化钙 硫酸镁 氯化铁 硫酸锰 琼脂 溴甲酚绿 1.2试验方法 1_2.1酵母菌的分离及纯化 取发酵车间未接入活性干酵 母的葡萄醪,置于预先灭菌的容器 中,并加入40mg/L的SO,在发酵 车『白J进行自然发酵,分别于发酵的 前,中,后期取样,梯度稀释涂 YEPD平板,28?下培养.3d后随 机选取l0,l5个菌落保藏. 1_2.1酵母菌的初步分类鉴定 将保藏的菌种活化,划线接种 于WL营养培养基,于霉菌培养箱 (28~C)中培养5d后观察,记录菌 落颜色和形态. 2结果与讨论 WL营养琼脂是被设计用来监 测饮料发酵过程中的微生物类群 的1.Cavazza等I1研究表明,在葡 萄酒自然发酵过程中出现的火多 数典型的酵母菌种都可以用wL 营养培养基进行区分,主要基于菌 落颜色及菌落形态.主要的葡萄酒 相关酵母菌在WL营养培养基卜 生长的菌落颜色及其形态,见表2. 2.1自然发酵前期葡萄酒相关酵母 本试验中所筛选到的自然发 酵前期的葡萄酒相关酵母在wL 营养培养基上培养所形成的菌落 表2WL营养培养基对葡萄酒相关酵母菌的鉴别(Cavazza等,1992) 仙如一一一一一一 表3自然发酵前期的葡萄酒相关酵母在wL营养培养基上的生长记录 颜色和形态,见表3. 与表2中菌落颜色和形态对照 可知,自然发酵前期所筛选到的21 株野生酵母菌株中,2—1-1,2.1-9, 2-1-10,2-1-11,2-1-17b为假丝酵 母.假丝酵母经常出现在葡萄浆果 表面,自然发酵的葡萄汁开始发酵 时有大量假丝酵母的存在.菌株2- 1-3,2.1-8,2-l-13,2-1.14,2.1. 18为酿酒酵母,葡萄酒生产中最主 要的酵母菌一酿酒酵母在浆果表 面及自然发酵前期并不普遍存在. 一 10cfu/g,在 般其数量小于lO, 选育过程中最好用富集培养基而非 直接铺平板l5l.一些研究者并没有 从健康,成熟的葡萄浆果表面分离 筛选到酿酒酵母_6】,所以现在对自 然发酵中酿酒酵母的来源产生r争 论.本试验筛选到了酿酒酵母,而 且所占比例较高(24%),可能是因 为自然发酵在发酵车间进行,而一 般在酒厂环境中会存在大量的酿酒 酵母.其余的菌株均为葡萄汁有孢 汉逊酵母,它是葡萄采收时浆果表 面的主导自然酵母菌群,不耐酒 精,只能在酒精发酵启动前活动. 2.2自然发酵中期葡萄酒相关酵母 本试验中所筛选到的自然发 酵rI,期的葡萄洒相关酵母在WL 营养培养基卜培养所形成的菌落 颜色和形态,见表4. 自然发酵中期所筛选到的11 株酵母菌,2.2.1,2-2.4a,2.2.7为 葡萄汁有孢汉逊酵母;2-2-3,2-2- 4b为酿酒酵母;2-2-2,2-2.5,2-2- 8,2-2-9,2-2-10为克鲁维毕赤氏 酵母,毕赤氏酵母为非常典型的产 膜酵母,对酒精的耐受力一般较 弱,通常能够生长在酒精含量低于 10%(v/v)的葡萄酒中.在发酵cII 期筛选到了大量的毕赤氏酵母可 能足因为发酵过程[f1葡萄醪与氧 气接触过多所致. 2.3自然发酵后期葡萄酒相关酵母 自然发酵后期所筛选到的菌 株均为酿酒酵母.存WL营养培养 基上培养所形成的菌落颜色均为 奶油色带绿色,菌落形态为球形突 起,表而光滑,不透明,奶油状. 主要是因为各种酵母菌在生长繁 殖过程中会逐渐利用完基质{1的 氧和营养物质并产生酒精,此后绝 大部分酵母死亡.这时酿酒酵母开 始占据主导地位(10,10cfu/g), 使发酵继续,直至完成. 3结论 近年来,葡萄酒发酵过程中的 酵母菌生态研究取得了很大的进 展,葡萄汁的发酵是多个酵母菌种 及菌株互作生长和发展变化的复 杂体系.这些酵母菌的来源有:? 葡萄浆果的土着菌群.?酿酒设备 和酒厂环境中的着菌群.?接种 的人工酵母.一般有孢汉逊酵母 属,克勒克酵母属,假丝酵母属, 试验研究 表4自然发酵中期的葡萄酒相关酵母在wL营养培养基上的生长记录 investigationin 梅奇酵母属的酵母启动发酵,大部 分来源于浆果,数量可达10, 10cfu/g,发酵中期,逐步死亡和减 少.然后,酿酒酵母开始占据主导 地位(10,10cfu/g),使发酵继 续,直至完成.发酵过程除了菌种 间的顺序变化以外,通常还包含有 一 个种内的不同菌株的发展变化, 这主要得益于利用了分子生物学 手段可以区分不同的菌株【71,例 如,在一个发酵过程中同时发现了 酿酒酵母5个以上的菌株m1.本试 验利用wL营养培养基对自然发 酵过程中的土着酵母菌群进行了 初步的分类和鉴定.可知在东北山 葡萄酒产区葡萄醪的自然发酵过 程中有假丝酵母,葡萄汁有孢汉逊 酵母,酿酒酵母,克鲁维毕赤氏酵 母出现.但有一株代号为2-2.6的 菌株,由于其在wL营养培养基上 生长所形成的菌落形态及颜色没 有相关的记录所以无法鉴定.结 果表明,WL营养培养基对葡萄汁 自然发酵过程中出现的大多数菌 株具有很好的鉴别力,可以用于监 测接种发酵可能的杂菌污染及作 为酵母菌鉴定的辅助手段. 参考文献 【1】FleetGH,HeardGM.Yeasts: growthduringfermentation[M】.In: FleetGHfed1?ineMicrobiologyand Biotechnology.Harwood,Chur,1993, 27.54 【2】AmerineMA,BergHW,Kunkee RE,eta1.TheFechnologyofWine Making[M],4thedn.AVIPublishin Company,Westport,1982 【3】GreenSR.,(3rayPP.Adifferential procedureapplicabletobacteriological Comm.,1950, brewing[J].Wallerstein 13:357.366 【4】CavazzaA,GrandoMS,ZiniC. 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