RP-HPLC法同时测定连翘败毒片中

RP-HPLC法同时测定连翘败毒片中 RP-HPLC法同时测定连翘败毒片中 大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素的含量 *唐传禹，郝美玲 (内蒙古食品药品检验所，呼和浩特 010020) 摘要 目的:建立连翘败毒片中大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素的含量测定方法。方法:采用高效液相色谱法对连翘败毒片中大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素进行了含量测定实验研究。结果:大黄素线性范围为0.03225μg,0.3225 62μg，回归方程为Y = 3.95×10X - 2631,R=1.000，平均回收率为97.28%(RSD=0.99%); 62大黄酚线性范围为0.03278μg,0.3278μg，回归方程为Y = 6.03×10X – 3416，R=1.000，平均回收率为96.69%(RSD=0.83%);大黄酸线性范围为0.033472μg,0.33472μg ，回归 62方程为Y = 4.27×10X – 3639，R=1.000，平均回收率为94.33%(RSD=1.61%);大黄素甲 62醚线性范围为0.03596μg,0.3596μg，回归方程为Y = 2.31×10X – 4079，R=1.000，平均回收率为95.13%(RSD=1.01%);芦荟大黄素线性范围为0.03072μg,0.3072μg，回归方 62程为Y = 4.62×10X – 3381，R=1.000，平均回收率为94.05%(RSD=1.88%)。结论:本方法可作为连翘败毒片中大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素含量测定的一种准确、灵敏、可行的方法。 关键词:连翘败毒片;大黄;大黄素;大黄酚;大黄酸;大黄素甲醚;芦荟大黄素;高效液相色谱法 RP-HPLC determination of Emodin、Chrysophanol、Rhein、 Physcion and Aloe-emodin in Lianqiaobaidu Tablet *TANG Chuan-yu，HAO Mei-ling (Inter Mongolilian institute for food and drug control，huhhot 010020) Abstract Objective: To establish a method for determination of Emodin、Chrysophanol、Rhein、Physcion and Aloe-emodin in Liaoqiaobaidu Tablet. Methods: RP- HPLC was applied for quantitave analysis Emodin、Chrysophanol、Rhein、Physcion and Aloe-emodin in Liaoqiaobaidu Tablet. Results: The Emodin linear range was 0.03225μg,0.3225μg 2(R=1.000),the average recovery rate was 97.28%(RSD=0.99%); The Chrysophanol linear 2range was0.03278μg,0.3278μg(R=1.000),the average recovery rate was 96.69% 2(RSD=0.83%);The Rhein linear range was 0.03347μg,0.3347μg (R=1.000),the average recovery rate was 94.33%(RSD=1.61%);The Physcion linear range was0.03596μg, 20.3596μg(R=1.000),the average recovery rate was 95.13%(RSD=1.01%); The Aloe-emodin 2linear range was 0.03072μg,0.3072μg(R=1.000),the average recovery rate was 94.05% can be used to determine (RSD=1.88%).Conclusion: The method is accurate, sensitive and the content of Emodin、Chrysophanol、Rhein、Physcion and Aloe-emodin in Liaoqiaobaidu Tablet. Key words: Lianqiaobaidu tablet; Rhubarb;Emodin;Chrysophanol;Rhein;Physcion ; Aloe-emodin; RP-HPLC 连翘败毒片由桔梗、白芷、大黄、浙贝母、连翘等十八味中药组成。具有清 热解毒，消肿止痛的功效。方中大黄为蓼科科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、 唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill. ,,1的干燥根及根茎，收载于《中国药典》2005年版一部。大黄具有泻热通肠、 [2]凉血解毒、逐瘀通经等功效。据文献报导，大黄素、总葸醌、游离蒽醌等的含 ,,,,,,,,1345量与抗炎作用呈正相关。参照《中国药典》2005年版一部及相关文献 项下方法，建立高效液相色谱法测定其含量。方法学试验证明，该方法结果满意、 灵敏、准确、重复性好。可作为该药内在质量的监控指标。 1 仪器与试药 日本岛津LC-20A 高效液相色谱仪、DAD检测器，SartoriusME5百万分HT 之一电子天平、METTLER AE100万分之一天平、奥泰Alltima-C色谱柱18 (4.6mmx250mm，5μm)。大黄素对照品(批号:110756-200110，供含量测定 用);大黄酚对照品(批号:110796-200716，供含量测定用);大黄酸对照品(批 号:110757-200206，供含量测定用);大黄素甲醚对照品(批号:110758-200610， 供含量测定用);芦荟大黄素对照品(批号:110795-200806，供含量测定用)， 1 以上对照品均由中国药品生物制品检定所提供。样品:由吉林东丰制药有限公司(批号:20090902、20090902、20090801)提供。甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为纯。 2 色谱条件 色谱柱:奥泰ALLTIMA-C色谱柱(4.6mmx250mm，5μm),检测波长254nm;18 以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱[0 ~ 10min，甲醇为65%;10 ~ 25min， o甲醇从65%?80%;25 ~ 45min，甲醇为80%];流速:1.0ml/min;柱温:30C;进样量:5~10μl。 3 溶液的配制 3.1 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄酸对照品、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照品适量，加甲醇制成每1ml各含100μg的对照储备液;精密量取上述各对照储备液4ml，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1ml各含16μg的混合对照使用液，混匀，即得。 3.2 供试品溶液的制备 取本品20片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取 约1.5g精密称定，置250ml烧瓶中，精密加入乙醇50ml，称定重量，加热回流提取1小时，放冷，加乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取滤液10ml，置锥形瓶中，蒸干，加入30%乙醇-盐酸(10:1)的溶液15ml，加热回流1小时，立即冷却，用三氯甲烷提取4次，每次15ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇使溶解至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 3.3 阴性对照试验 阴性空白溶液的制备 取大黄空白对照品，同供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，即得。 4 方法与结果 4.1 系统适应性试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按上述色谱条件分别进样5~10μl测定，结果见图1。样品中大黄中各成分与杂质分离完全，分离度佳。 2 A B C 图1 阴性供试品(A)、混合对照品(B)、供试品(C)HPLC图 Fig 1 The samples tested negative (A)、HPLC chromatograms of mixed reference substance (B) and The sample was (C) 1. Aloe-emodin 2. Rhein 3. Emodin 4. Chrysophanol 5. Physcion 3 4.2 线性关系考察 精密量取混合对照品，精密吸取2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、15μl，20μl分别注入液相色谱仪，测定峰面积值。以峰面积积分值(Y)对进样量(X)进行回归分析，得回归方程，结果见1。 表1 大黄各成分标准曲线 Tab.1 Standard curves of Rhubarb Reference substances Calibration curves R Linear range/μg 6Aloe-emodin 0.999 Y = 4.62×10X - 3381 0.03072,0.3072 6 0.999Rhein Y = 4.27×10X - 3639 0.03347,0.3347 6 0.999Emodin Y = 3.95×10X - 2631 0.03225,0.3225 6 0.999Chrysophanol Y = 6.03×10X - 3416 0.03278,0.3278 6 0.999Physcion Y = 2.31×10X - 4079 0.03596,0.3596 4.3 精密度试验 精密吸取供试品溶液(批号:20090902)10μl，重复进样6次，测定供试品中以大黄素峰面积积分值计算的RSD(n=6)为0.91%。 4.4 重复性试验 取同一批号样品(批号:20090902)，分别按“3.2”项下方法制得供试品溶液，进样10μl，结果以大黄素峰面积积分值计算的RSD(n=6)为RSD=1.08%。 4.5 稳定性试验 取同一批号样品(批号:20090902)供试品溶液，精密吸取10μl，分别在0、3、6、9、12小时进样，测定供试品中以大黄素峰的峰面积积分值计算的RSD为1.18%。表明供试品在12小时内较稳定。 4.6加样回收率试验 精密称取已知含量的样品(批号: 20090902)6份，精密称取0.75g，按“3.2”项下方法制备溶液，进样10μl，计算回收率(n=6)和RSD。结果见表2 表2 样品中加样回收率 Tab.2 Recovery of sucrose in sample Average Content in sample Spiked content RSD Reference substances Recovery -1/ mg /% / mg?g /% Aloe-emodin 1.8409 1.3807 94.05% 1.88% Rhein 1.2329 0.9247 94.33% 1.61% 4 Emodin 6.9666 5.2249 97.28% 0.99% -1Chrysophanol 3.6377mg 96.69% 0.83% 4.8503 mg?g -1Physcion 2.5305mg 95.13% 1.01% 3.3740 mg?g 4.7 样品含量测定 取样品3批次，按“3.2”项下方法制备溶液，精密吸取混合对照品溶液5μl和样品(20090902、20090902、20090801)10μl分别注入高效 -1-1液相色谱仪，以外标法计算，样品含量分别为18.26 mg?g，18.53 mg?g，17.88 -1mg?g。 5 小结与讨论 5.1 目前文献报道的成药中大黄的含量测定多采用测定大黄素和大黄酚的总量，不能完全反映成药中大黄的整体质量水平。所以，建立直接测定其所含多种蒽醌的定量方法对控制相关制剂的质量是十分必要的。 [4]5.2 据文献报道，大黄药材用70%乙醇直接超声处理后进行测定，但此方法用于成药测定干扰组分很大，分离效果不好。实验证明，经酸水解后由三氯甲烷多步萃取后制备的供试品溶液，则有效地排除了大部分的杂质，HPLC测定中的干扰峰少，分离效果好，重复性好。 5.3 本方法采用RP-HPLC法梯度洗脱同时测定成药中大黄5种成分的含量。结果显示，该方法操作简便，测定结果准确，重复性好，回收率高，可用于大黄药材及其制剂的检测提供方法参考。 REFERENCES [1] Ch.P,2005,Vol ?(中国药典2005年版一部)[S].:17-18 [2] Wei G，Fang Y Q，Huang K E，Double Yantongxiao spray active ingredients (anthraquinone) content and the efficacy of the correlation analysis Chinese Traditional Patent Medicine[J](中成药), 2000,Vol.22 No.2:151-153 [3] Liu C L，Liu D H，Huang Y C，et al.Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology[J](中药新药与临床药理),2009 September,Vol.20 No.5 [4] Liu H Y，Zhao C X，Liang Y Z,et al.Lishizhen Medicine And Material Medica Research (时珍国医国药)，2009,Vol.10 No.10 5 [5] Liiu X，Hu F D，Feng S L，et al. Fingerprints of Radix et Analysis And Testing Technolgy And Instrments(分析测试技术与仪器)，2004，10(3):140—144( 作者简介:唐传禹，男，药师 研究方向:食品、药物分析 通讯作者:郝美玲，女，主任药师 研究方向 :中药质量标准及安全性研究 Tel:(0471)6969644 6969644 Fax:(0471) E-mail:hml_zy@126.com 6