细胞凋亡检测

细胞凋亡检测 第一节 细胞凋亡的基础 一、 细胞凋亡的概念 (一) 细胞凋亡概念的提出 细胞凋亡(apoptosis)或称程序化细胞死亡，是多细胞有机体为调控机体发育，维持内环境稳定，由基因调控的细胞主动死亡过程。对凋亡概念的认识和研究可划分为形态、生化和基因3个阶段。本世纪六十年代，Kerr在形态学上描述了在结扎肝静脉后增生的肝实质发生退行性变时一种明显的细胞死亡方式，这种死亡细胞变圆固缩，散在分布。由于当时细胞死亡与坏死是同义词，Kerr将这种细胞死亡方式命名为固缩坏死(shrinkage necrosis)。然而，固缩坏死常发生在有生物学意义的背景中，并在形态学上与坏死明显不同。因此，1972年，Kerr等提出了细胞凋亡的概念。经过后来诸多学者的研究，对细胞凋亡的意义有更深入的认识，认为细胞凋亡是生物体普遍存在的现象，广泛发生于胚胎形成、器官发育、组织更新、受损和衰老细胞的清除、维持组织器官中细胞数目的恒定等生理和病理过程。 (二) 细胞凋亡的生物学意义 细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必须的，具有重要的生理学意义，主要现在:? 细胞凋亡在生物界普遍存在;? 细胞凋亡是多细胞生物生命活动中不可缺少的，贯穿于全部寿命周期中;? 细胞凋亡是生物在进化过程中形成的死亡方式。 细胞凋亡的生物学作用主要有:? 清除无用的细胞;? 清除发育不正常的细胞;? 清除已完成任务的细胞;? 清除有害的细胞。 二、 细胞凋亡的特征 (一) 形态学特征 1. 细胞核的变化 (1) 染色质凝聚: 核DNA在核小体连接处断裂成核小体片段，并向核膜下或中央部异染色质区聚集，形成浓缩的染色质块。凋亡细胞中染色质块聚集于核膜下，称边集;或聚集于核中央部，称中集。染色质聚集部以外的低电子密度区为透明区，是由于核孔变大从而导致其通透性增大，细胞质中水分不断渗入而造成。 (2) 核碎片: 核碎片发生的过程有以下几个步骤，首先是透明区不断扩大， 然后是染色质进一步凝聚，核膜在核孔处断裂;随后核膜包裹分割染色质，形成核碎片 2. 细胞质的变化 (1) 胞质浓缩:细胞脱水，细胞质明显浓缩，凋亡细胞体积为原细胞体积的70%左右。 (2) 细胞器:凋亡过程中，细胞器出现不同程度的改变。主要包括: ? 线粒体:凋亡早期细胞内线粒体增殖，接着增殖线粒体空泡化。细胞色素c向胞质逸出是细胞凋亡早期常发生的一种现象，并认为细胞色素c逸出与细胞凋亡有密切关系。 ? 内质网:凋亡细胞内的内质网腔多数呈现扩大。增殖的内质网在凋亡细胞形成自噬体过程中提供包裹膜。 ? 细胞骨架:疏松有序的结构变得致密紊乱，主要成分肌球蛋白和肌凝蛋白的表达受到显著抑制，含量明显减少。 ? 细胞膜 凋亡的细胞失去原有的特定形状，如微绒毛、细胞突起及细胞表面皱褶的消失，细胞表面出泡;细胞膜电位下降，膜流动性降低;细胞膜上新出现一些生物大分子，如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)，这些生物分子的出现与凋亡细胞的清除有关。另一方面，某些生物大分子则从凋亡细胞的膜上消失，如与细胞间连接有关的蛋白质。 ? 凋亡小体形成 凋亡小体的形成可以通过两种方式。 (1) 通过发芽脱落机制:凋亡细胞内聚集的染色质块，经核碎裂形成大小不等的染色质块，然后整个细胞通过发芽、起泡等方式形成一个球形的膜包小体，内含胞质、细胞器和核碎片，脱落形成凋亡小体。 (2) 通过自噬体形成机制:凋亡细胞内线粒体、内质网等细胞器和其它胞质成分一起被内质网膜包裹形成自噬体，与凋亡细胞膜融合后，自噬体排出细胞外成为凋亡小体。 (二) 生化特征 1(染色质片段化 内源性核酸内切酶将核小体间的连接DNA降解，形成长度为180~200bp整倍数的寡核苷酸片段，组蛋白和其它核内蛋白质不降解，核 基质也不改变，凝胶电泳呈现“梯状”条带。形成梯状条带的内源性核酸内切酶有多种，常见的有核酸内切酶?(DNase?)、核酸内切酶?(DNase?)、Nuc-18等。细胞凋亡的染色质片段化有以下几个特点:? 染色质DNA的降解是在细胞凋亡的早期，由于内源性核酸内切酶的活化与表达而造成;? 细胞凋亡时，染色质DNA的片段大小是有规律的，形成长度为180~200bp整倍数的寡核苷酸片段，凝胶电泳呈现“梯状”条带;? 染色质的断裂大多是链断裂，内源性核酸酶仅在一个位点上切割单链，很少有一个位点上切割双链的情况。? 染色质DNA断裂的位置，大部分位于核小体间的连接部位，因此容易造成核小体间散布着一系列的单链缺口。 2+ 2+2+2(胞浆Ca浓度变化 胞浆Ca与细胞凋亡关系密切。胞浆Ca可能通 2+2+2+过以下途径诱导细胞凋亡，一是胞内Ca库释放，胞外Ca内流促使胞浆Ca 浓 2+度持续升高，从而启动细胞凋亡;二是Ca的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。 (胞浆pH变化 胞浆pH([pH]i)的变化影响细胞凋亡。细胞凋亡伴随胞浆3 pH降低，胞浆酸化。胞浆酸化主要是激活酸性DNase?，启动细胞凋亡。pH降低也增强了一些酸性功能蛋白，如谷氨酰胺转移酶、酸性鞘磷脂酶等在细胞凋亡中的作用。 (三) 细胞凋亡与坏死的比较 细胞凋亡与坏死的主要特征比较见表8-1。 表8-1 细胞凋亡与坏死的特征比较 特征 凋亡 坏死 由于病理性损伤发生的被动死亡过定义 细胞受内在基因调控发生的主动性自杀过程 程 诱导因素 生理性或病理性 病理性 形态特征 出泡 有(泡内有细胞器) 有(泡内无细胞器) 质膜完整性 保存 破坏 细胞大小 变小，细胞固缩形成凋亡小体 变大，细胞肿胀、溶解 炎症反应 无 有 内容物释放 无 有 生化特征 蛋白质合成 在某些情况下需要 不需要 基因转录 在某些情况下需要 不需要 DNA断裂 裂为180~200bp核苷酸片段 随意不规则断裂 凝胶电泳 阶梯状条带 拖带 调节 受高度调节 不受调节 尽管典型的凋亡细胞有其显著的形态学特征，但在组织学上要清楚地识别凋亡并非易事，主要是因为:? 凋亡细胞常散在单个分布;? 大多数凋亡小体体积很小，光学显微镜下不易辨别;? 凋亡小体常迅速被巨噬细胞清除;? 相邻的细胞缺乏炎症反应;? 细胞死亡的组织学，如固缩和核碎裂都可以在凋亡和坏死的某阶段中出现，使凋亡和坏死有时难以区分。因此判断凋亡的存在除根据形态特征外，常需结合一些生化检测手段。 三、 细胞凋亡的检测方法 (一) 形态学检测 1.普通光学显微镜 (1) 苏木素-伊红染色(HE染色法):苏木素(hematoxylin)为碱性染料，可使细胞内嗜碱性的核染色质和核蛋白体染成蓝紫色:伊红(eosin)为酸性染料，可使胞质内嗜酸性的普通蛋白 和胶原纤维等物质染成粉红色。因此在普通光镜下细胞核呈蓝紫色，胞浆呈红色。凋亡细胞在组织中呈现单个散在分布。表现为核染色质致密、核碎裂。而细胞坏死时由于细胞膜通透性增加，细胞膜破裂，因此细胞不完整，溶酶体膜破裂，使周围组织坏死，呈均质红染的无结构物质，核染色 消失。 (2) 甲基绿-派诺宁染色法:细胞凋亡和坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态，但两者发生机制不同。细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。而坏死则是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA损失。根据这一特点，可利用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染(呈绿色)。如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色(呈现红紫色)者为凋亡细胞，呈现阴性染色者为坏死细胞。 (3) Giemsa染色法:一般用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞的染色。正常细胞核染成蓝色或蓝紫色，色泽均一;凋亡细胞可见核固缩、边集或碎裂，染色变深;细胞膜皱折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体。 (4) 瑞氏(Wright)染色法:与Giemsa染色法相类似，多数用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞的染色。正常细胞核染成蓝色或蓝紫色，色泽均一;凋亡细胞可见核固缩、边集或碎裂，染色变深;细胞膜皱折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体。 2.电子显微镜 透射电镜可确定凋亡时细胞核的特征性变化和凋亡小体，同时可观察细胞外形和细胞器的变化。由于超微结构的变化几乎存在于凋亡的全过程，故本法既适用于组织细胞(体内)又适用于离体细胞(体外)的研究，是目前用于确定细胞凋亡最为理想的形态学方法。电镜下凋亡细胞染色质固缩常聚集于核膜下呈境界分明的、块状或新月形小体;细胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的碎片;胞质内可见基本完整的细胞器。单纯坏死也可出现核固缩，但染色质分布无规律，边界不清，没有膜包的核碎片出现，细胞浆肿胀明显，细胞器常有结构破坏(图8-1)。 B A 图8-1. 透射电子显微镜检测细胞凋亡. (A)正常细胞;(B)凋亡细胞 3.荧光显微镜 一些荧光染料对活细胞DNA具有特异亲和性，因此荧光素亦可显示凋亡细胞核的形态学特点。荧光色素是目前判别凋亡常用而简便的方法之一。所用的染料有吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、Hoechst荧光素等。也可同时用两种染料进行染色，以确定细胞核的形态学变化和细胞对活体染料的排斥能力，借以区分细胞凋亡和坏死。 (1) 吖啶橙染色法:荧光染料吖啶橙具有两种不同的染色特点，在已固定的组织它是一种异染性染料，单链核酸呈橙色荧光，双链核酸呈绿色荧光。在活细胞中它是一种pH指示剂，反映溶酶体质子泵功能，AO呈弱碱性，溶酶体内部的pH值较低，AO可透过细胞膜结构进入溶酶体内，并与其内水性水解酶结合而发橘红色荧光。有研究表明凋亡时伴有整个细胞包括细胞核的酸化。溶酶体在此过程中可能发挥了重要作用;溶酶体可能与靶核融合，释放其内容物，降低核内的pH值，促进酸性核酸内切酶的激活，并且溶酶体可能提供酸性环境，促进浓缩核的蛋白成分的分解。凋亡时溶酶体结构基本保持完整，因而可使AO染料进行累积，故凋亡时细胞核与细胞质内均可见致密浓染的橘红色荧光，甚至可见橘红色荧光碎片。而坏死细胞破坏了溶酶体的完整结构，也破坏了累积AO的能力，因而橘红色荧光很浅，甚至没有。 (2) Hoechst 33258染色法:Hoechst 33258为一种DNA活性染料，正常细胞核发出均匀蓝色荧光，而凋亡细胞的核发出的是浓染致密块状的黄色荧光。 (二) 生化特征检测 1.琼脂糖凝胶电泳 细胞凋亡时染色体断裂为180~200bp的寡核苷酸片段， 呈现特征性的“阶梯状条带”(图8-2)。 图8-2 凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳(Lane 3呈现阶梯状条带) 2.原位末端标记技术 细胞凋亡时DNA断裂，产生游离的3′OH末端，在酶的作用下，将外源性带有生物素或地高辛标记的游离核苷酸参入DNA断链末端。 3(ELISA检测 细胞凋亡时在胞膜破裂之前，其胞浆中有大量的单或寡核苷酸片段，用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。 (三) 流式细胞仪检测 流式细胞仪可根据细胞体积大小以及胞浆均匀程度(即颗粒的多少)的不同而发出不同散射光的特点对细胞进行。前向光散射(forward scatter)与细胞体积大小有关，侧向光散射(side scatter)与细胞内颗粒化有关。细胞凋亡与坏死时，细胞内颗粒化均增高故侧向光散射均高于正常。即细胞凋亡时出现低于正常的前向光散射和高于正常的侧向光散射，坏死时出现较高的前向光散射和侧向光散射。 1(PI单染法:用于流式细胞仪检测细胞凋亡的荧光染料很多，主要使用的是核DNA结合染料，最常用的是碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色。可以根据染料的激发光谱和发射光谱的特征，选择适当的荧光染料，进行单参数或多参数流式细胞仪检测。在DNA直方图上，凋亡时二倍体峰(GI期细胞)减少，而在GI峰左侧出现一个不连续的亚二倍体细胞群的峰型。而坏死时各周期中的细胞均出现不同程度的减少(见图8-3)。 a b c d 图8-3 PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡。 a:正常对照组;b,c与d:细胞凋亡 2+ 组2. AnnexinV/PI双染法:annexin-V是一种具有抗凝活性、Ca依赖性的磷脂 结合蛋白。在一定条件下与带负电荷的磷脂具有选择性的亲和性。一般说来，细胞膜脂双层的内外两层中的磷脂分子有很大差异，即具有不对称性分布。如正常的血细胞、血管内皮细胞等。鞘磷脂和大多数磷脂酰胆碱分布于脂双层的外层、而磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺主要分布于脂双层的内层。有研究表明，一些细胞发生凋亡时，在其早期阶段细胞膜磷脂分布的不对称性会发生改变。位于内层的磷脂酰丝氨酸会暴露于膜的外面。这样就可以利用异硫氰酸荧光素FITC标记的annexin-V检测暴露于凋亡细胞膜外表面的磷脂酰丝氨酸来判别凋亡细胞。FITC标记的annexin-V检测的阳性凋亡细胞在荧光显微镜下发绿色荧光，而正常细胞由于细胞膜磷脂分布的不对称性没有变化，因而结果为阴性。FITC标记的annexin-V还可以与细胞核特异性荧光染料如PI等一起染色，一方面可观察细胞膜的变化，另一方面还可观察细胞核的变化，还可在流式细胞仪中进行分析。 (四) 细胞凋亡研究方法的选择 1(根据方法的定性与定量特性分类 (1) 定性的方法:形态学观察、常规琼脂糖凝胶电泳。 (2) 定量或半定量方法:流式细胞仪、ELISA、定量琼脂糖凝胶电泳。 2(根据是否将凋亡与坏死分开 (1) 可将凋亡与坏死分开 形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、annexinV/PI双染法流式细胞仪检测。 (2) 不能将凋亡与坏死分开 PI单染法流式细胞仪检测。 3. 根据样品来源不同 (1) 组织 HE染色、透射电镜、石蜡包埋组织切片原位末端标记、琼脂糖凝胶电泳。 (2) 培养细胞 所用方法皆适用。