玉米花粉多糖对鸡新城疫弱毒疫苗免疫应答的影响

玉米花粉多糖对鸡新城疫弱毒疫苗免疫应答的影响 玉米花粉多糖对鸡新城疫弱毒疫苗免疫应 答的影响 7一7毛幸花拓琴挈中国兽医杂总1998年(第2卷)第1朝 只皈 应用前景上,受到人们普遍的关注.陈诗芸,陈 德芳等研究破壁或未破壁花粉是防治病毒性疾病有 效药物的增效荆.主要是花粉中的免疫多糖”影响 机体网状内皮系统巨噬细胞,琳巴细胞,白细胞, RNA,DNA,蛋白质的台成,抗体的生成,cAMP与 cGMP一的音量,补体的生成以及对干扰索的诱生作 用,它使机体巨噬细胞和吞噬功能剧增.从而使有救 药物达到相乘或平方,立方倍增的作用州].花粉多 糖作为免疫增强荆应用在畜牧兽医上.有它发展的 潜力.新城疫是危害鸡群的急性传染病,在生产实践 中一些免疫增强荆普遍应用于灭活疫苗,而应用于 弱毒疫苗的免疫增强剂尚未见报道.本研究依据花 粉多糖的生物活性和药理作用.以厦玉米花粉中多 糖含量较高的文献报道].按照不同剂量配合新城 疫弱毒疫苗共同免疫.从中筛选最佳剂量寻找理想 的免疫增强荆,为应用提供理论依据.报道如下. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1ND浓缩抗原与新城痤克隆30弱毒疫苗均 由中国农业大学实验动物研究所提供.抗原血凝效 价为1t1024. 1.1.2磷酸缓冲液pH7.2,l鸡红细胞液,5枸 橼酸钠,0.06台盼蓝溶液均由自己配制. 1.1.3细胞增殖ELISABrdu显色试荆盒,赌于 东方科技公司籀国宝灵曼. 1.1.4植物血球凝集素(PHA),~I1640培养 基,均赌于中国农业大学供应科. 1-1.5玉米花粉赌于北京市蜂业公司,玉,哦粉多 糖由自己提取,配制成5多糖水溶液,经巴氏灭曹 后供实验用. 1.1.696孔.V”型血凝板,96孔组织培养扳均胸于 格瑞恩公司. 1.1.7酶标分析仪511型,DG3022型. 1.1.8可调微量移液器. 1.1.9高教液相色谱仪LKB,瑞典,中国农业大学 食品检测中心 1.1.10ZFQ85型旋转蒸发器,上海医械专机厂生 产. 1.1.11透析带,~75DM,赌于北京百泰生化技术公 X国家自然科学基金资助项目.39470532号 ?北京养猪育种中心.海淀100085 @中国农业大学动物医学院.北京梅淀100094 @北京养猪育种中心原种猪场.昌平102202 固黑龙江省富裕县畜牧局.161200 1.1.3实验动物.伊莎雏鸡.500只.雄性,1日龄. 1.2方法 1.2.1多糖的测定由中国农业大学食品监测中 心.应用高教液相色谱仪测得玉米花粉多糖古量为 73.分子量太于4万. 1.2.2实验设计 1.2.2.1免疫途径新城疫克隆3o弱毒疫苗皮下 注射,玉米花粉多糖溶液胸肌注射. 1.2.2.2实验分组将依莎雏鸡分为5组.7日龄 时进行首免,处理组同时用玉米花粉多糖溶{蓖胸肌 注射.对照组用蒸馏水胸肌注射.分组如下. A组(5玉米花粉多糖组):At0,2ml/只 (10rag),疫苗皮下注射0.1ml/只,4O只A2:0.1ml/ 只(5mg).疫苗皮下注射o.1ml/只,4o只;A$:0. tral/只(5rag),疫苗皮下注射O.05m[/其,4o只;A’l 5多糖溶液代疫苗,稀释液o.1ml/只皮下洼射,Io 只.B组(对照组),蒸馏水0.1ml/其胸肌注射,疫苗 皮下注射0,1/只,共4o只. L23方法与步囊 1.2,3,1对首免小娉免疫3,5,10,15,20天后.从 每组选12只鸡进行心脏采血0.5ml,分离血清,采用 p_微量血凝抑恻实验测定HI抗体效价.以组为单位 求其平均值.数据采用F检验(邓肯氏新复极差 法)进行统计分析. 1.2.3.2当首免鸡鹅日龄时,用克隆30弱毒疫苗 进行二免,二免3,5,lD,15,20,30,45,60,75天后从 每组选l2只鸡心脏采血0.5m!,同上法测定HI抗体 效价和进行统计分析. 1.2.3.3细胞免疫韵测定clo『]] 1.卫.3.3.1淋巴细胞收集;同群饲养的6周龄鸡. 从每组造5鼠,无茸操作心脏采血5ml,肝素抗凝,灭 曹离心管收集,甩水平离心机低速离心(5o×g/10 , l)无菌分离淋巴细胞.用嗳管吸出上部白色细 胞屠放在无菌离心管中,加入细胞层总体积的1/5 的RPMI1640培养摹.再次离心15rain,吸til1o~,I淋 巴细胞液与9o~,I的0.06台盼蓝溶液混匀.计数活 的淋巴细胞,用RPMI1640培养基调到淋巴细胞的 浩度为5×10/m!. 1.2.3.3.2细胞培养:用RPMI1640培养基稀释 PHA作朝撇原,吸50,t(古PHAZO~g)赦在无菌% 孔组织细胞培养板的孔中(so~l/孔).同时一孔加入 s0vl(不合PHA)的RPMI1640培养基做为对照.然 后在每个孔中各加入调好的淋巴细胞的浓度(5x 10/m1)5o~,I,放在培养箱中培养(41?,5CO2, 9O湿度)64h,取出加入Brdu标记物(5一溴一2脱氧 一 “ 一 扎 一 38 尿苷)10~1/孔,继续培养16h.空白孔则不加淋巴细 胞,其余同上. 1.2.3.3.3拌品处理与结果表示:培养的96孔组 织细胞培养板从培养箱中取出,在倒置显微镜下观 察其细胞形态.穆击孔中的培养基,加固定剂ZOO~I/ 孔在室温辫育~0min穆击固定荆,加入抗Brdu底物 酶1o叫,芋L,在室温1孵育3o,120rain,用洗液洗3 次,甩干,加底街在室温孵育5~30rnin. 结果甩ELBA酶联免疫仪测的OD值表示T 淋巴细胞的转化率,加终止剂(1MHSO.D在45Ohm 波长,不加终止荆在370nm波长下测出,在5, 中国兽压杂志柏98年(第24眷)第1期 30mln内测完.数据以组为单位求其平均值,数据处 理,经F检验. 2结果 2.1对首免HI抗体效价的影响玉米花粉多糖 A】组(10mg/0.2m1),A2组(5n~/O.1m1),Aj组 (Sn~/0.1m1.疫苗半量),A.组(多糖作疫苗稀释液, 5浓度,0.1ml/只皮下注射)的HI抗体效价的平均 值,与对照组相比,经F检验.差异显着或极显着(> LSD?或>LSD1).组问相比,差异显着或般显着 (>LSD~.或>LSD?).见表1. 衰1玉米花柑多鞠组HI抗体效价婚测定(1og) ?:与对照组相~5>LSD口5I$-S与A1组荆量相比,>LSD?5l*|与对照组相 比,>LSD?1}ab{与A】组剂量相比.> LSDao1 2.2对二免HI抗体效竹的影响小鸡28日龄时 进行二免(方法同上),结果l十处理组的HI抗体效 价平均值与对照组在免疫5,20,45,60,75天时相 比,经F检验,差异显着或极显着(>L5或> LSDom).组间相比,也存在着差异.见表2. 衰2玉米花粉多I皇二免组HI抗体效价婚测定(1og) ?.与对照组相~5>LSDo.6IB与AI组剂量相比,>LSI~*-*,与对黑组相比,>LSD…b4. 与A’组剂量相 比,>LSD00】 2.3对细胞免疫应答的影响在同群小鸡6周斡 时,测得体外T淋巴细胞转化试验的oD值,各处理 组的OD平均值均比对照组高0.31,1.01滴度.A. 组与对照组相比.经F检验,差异显着(>LSIX). 见表3. 寰36同龄璃体外T淋巴细胞转化率的OD值的溺定 中国兽医杂志1998年(第24卷)第1期 3讨论 3.1玉米花粉多糖对鸡体液免疫功能的影响 国内外学者认为多糖作为药用主要是提高细胞 免疫作用.毛小娟等(1991)Ak黄芪中提取得到的红 芪多糖(RHPS)和黄芪多糖(APS)均可明显增加小 鼠脾重,对抗强的松龙抑制血清凝集素,溶血素抗体 的产生许i-m等(1990)报道刺五加多糖(ASPS) 能特异地增强小鼠对SRBC的体液免疫反应性,表 现为牌抗体分泌细胞数明显增加[].不同的多糖具 有不同的免疫调节作用.这与提取方法不同多糖的 组分结构不同有密切相关.王奉样等(1982)认为各 种多糖免疫促进机理不尽相同.张菊明等(1986) 研究指出中华猕璇挑多糖复合物(ACPS)能同时在 抗体和巨噬细胞两方面起调节作用[1目.举研究结果 五米花粉多槽韵明星增强璃的体液免疫能力. 玉米花粉多糖三个不同剂量组在免疫3,5,i0,15天 时,m抗体效价的平均值与对照组楣比.经t检验. 差异显着(P<O.O5)(见表I,2).同拌显示了玉米花 粉多糖能增强鸡的体液免疫功髂.其作用机理可能 与玉米花橱具有显着的提高巨噬细胞功能有关[. 巨噬细胞与淋巴细胞间通过释放的各种免疫因子形 成一个调节环龉,以调节免疫虚答.促进抗体产 3.2玉米花粉多糖对璃细胞免疫功能的影响 多糖类是非特异性免疫增强剂,专家认为多糖 作为药物主要是提高机体的细胞免疫能力.美国卡 林顿研究室与禧克萨斯州A8’M大学合作研究了芦 荟提取物乙酰甘露聚糖在动物保健中的应甩,发现 乙酰甘露聚糖很容易被免疫细胞摄取而大大增强动 物宿主对入侵微生物的免疫应答.该药与鸡马立克 疫苗音用,可使免疫力的产生比仅接种马立克疫苗 提早3天,死亡率降低[】本研究也证明花粉多糖具 有多方面的生物活性,在细胞免疫上,体外t淋巴细 胞转化实验OD值的测定较对照组高(P<0.05)(见 表3).提示玉米花粉多糖作为非特异性免疫增强剂, 通过非特异澈活而影响机体的特异性免疫能力.在 另外一批试验中,即玉米花粉多糖水溶液与法氏囊 弱毒苗免疫合用,使鸡的免疫力产生比仅用法氏囊 弱毒苗免疫提早3天.预示了玉米花粉多糖作为一 种新型的免疫增强荆提供了理论_I葭据. 3.3多糖作为免疫增强荆的作用机理,与多糖的分 子量,溶解度,牯度,多糖的组分与结构,剂量,给药 逾径,动物种类等请因素有密切关系.一般来说.分 子量越大,活性越高.在溶解度方面,如增大糖的溶 解度t可能会降低其活性.在组分与结构上,大多有 生物活性的糖都是(1—6)或(1’3)糖苷健.而 在玉米麸皮中提取的多糖RBS中i个活性片断 RON,结构是r型的.有些多糖在动物抗肿瘤活性实 验时腹腔注射有效而口服无效,而云芝多糖不同,口 服亦有效.这可能与组分中葡聚糖主链与蛋白质结 合有关.在剂量方面在药教反应上有1个最佳剂量, 一 39 过高过低都会影响免疫效果奉研究中3种剂量相 比.以5rag/0.1ml剂量组具有较强的免疫增强作用 (P<0.05或P<O.01)多糖的不同给药途径,其增 强效果也不尽相同.本试验采用多糖承溶液胸肌注 射而疫苗滴鼻点眼,和多糖承溶液作为疫苗的精释 液皮下注射.都有良好的免疫增强效果.此外,疫苗 半量组虽然与其他组相比,稍差一些.但与对{豫组相 比,HI抗体效价平均值均高于对照组.P<0.05或P <o.01.这可能是多糖改变抗原分子构舞或其电荷. 从而延长抗原贮存和释放时阃.增强抗原性.由此持 续地刺激机体而增强特异性免疫虚替.从而可以在 疫苗使用半量,仍能得到良好的保护作用.这在疫苗 实际应用上具有重要意义. 4结论 4.1奉项研究证明玉米花橱多糖不但增强璃的体 浪免疫,而且增强聘的细胞免疫能力.预示了玉米花 粉步糖作为一种瓶型的免疫增强剂提供了理论依据 与应用前景. 4.2玉米花粉多糖增强鸡新城痉克隆3o弱毒疫苗 免疫应答的量佳剂量是5n.配戚亦溶液腩肌注射 或作为疫苗稀释液皮下注射. 参考文献 1章曼华.冉培根.中草药,b92,23(2);95~99 2穰学襄.颤茂瑜.中成药,1988.(5)3q~39 3方一革.第二届全国农列产品缚音衬用让学学术讨论 台.青岛.1神3 I昧博芸.摩运掌.卓光祖等.中国免疫学杂志.1991, 7(3)t186~187 5许到琴,陆粥.张克家.中酉兽医站台研究与临床.北 京t北京农业大学出版社.1993103 6郑文辉,邱华,王梧华等.中国免疫学杂志,1987. 3(1);57~58 7王开发主编.花粉营养成分与花粉资源衬用.上海复旦 犬学出版牡.19#3.2,3 8LuGang?XuJhmiin,Zh丑0Bing.~n,UnGuiU扭.wld Vet.Congress.Yokohama.Japan.1995,S单t.3,9,47 9沈恒范主埔.概率论与数理统计教程.第2版.北京;高 尊教育出社1995 10TimMosmann.J.0fimmunologicalMethods.1983, (65),55,63 11沈丹蓿.中华医学检验杂志,1989.2(3),17O,172 12毛小婿.中国免痤学杂志.1989.I(a);158~160 13许士凯.中成药,1990:12(3);25,26 1I王车祥,崔量朝.羽爱晶.药学学报.1982,疗(1)…88 87 15张菊明,韩佩芳.何一中等.中酉医结合杂志,1986.6(a) ;171,173 16黄会岭,陆钢.张克家.中国兽医杂志.1998.21(1) 39 17暂瞳春主编.动物免疫学.北京,中国农业太学出版社. 1998.83 l8芦新华译自(Broil~du吡y嗣外畜牧学-措与?, l993.(3),58