大蒜素联合奥沙利铂对HCT-8细胞生长和增殖的影响及机制
大蒜素联合奥沙利铂对HCT-8细胞生长和
增殖的影响及机制
山东医药2009年第49卷第7期
大蒜素联合奥沙利铂对HCT一8细胞生长
和增殖的影响及机制
崔瑞雪,王贵吉h,申凤乾,高伟艳,裴迎新
(1郑州大学第一附属医院,河南郑州450052;2郑州大学公共卫生学院)
[摘要]目的探讨大蒜素与奥沙利铂联合应用治疗大肠癌的可行性及机制.方法将
大蒜素和奥沙利铂
单独及联合作用于人大肠癌细胞系HCT-8细胞,M1T法检测HCT-8细胞生长抑制
率,流式细胞术检测细胞周期及
细胞凋亡率,免疫细胞化学sP法检测Caspase-3蛋白
达,苏木素复染观察异常分
裂细胞.结果联合大蒜素后,
奥沙利铂对HCT.8的增殖抑制作用增强(P<0.01);细胞阻滞于G/M期,且凋亡率
升高(P<0.01);Caspase.3表
达上凋(P<0.01);异常分裂细胞数增多(P<0.01).结论大蒜素能增强HCT一8
细胞对奥沙利铂的化疗敏感性,
此可能与大蒜素对HCT-8细胞的抑制增殖,细胞周期阻滞及促进凋亡作用有关.
[关键词]大蒜素;奥沙利铂;大肠癌;细胞凋亡;细胞周期
[中图分类号]R735.3[文献标识码]A[文章编号】1002-266X(2009)07-0010-03 Effectandmechanismofallicincombinatedwithoxaliplatinonthegrowthand
proliferationofHCT-8cells
CU/Rui—xuel.WangGui-ji,SHENFeng—qian,GAOWei-yah,PElYing—xin
(1efirstaffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhenzhou450052,P.R.China)
Abstract:0bjectiveToinvestigatethefeasibilityandmechanismofallieincombinatedwitho
xaliplatininthetreat-
mentofhumancoloreetalcancer.MethodsThehumancolorectalcellsHCT-8weretreatedwit
hallicinandoxaliplatin
singlyandbothofthem.TheproliferationinlfibitionratewasdetectedbyMTrassay,theapoptosisratioandcellcycle
blockagewereexaminedbyflowcytometry,theexpressionofCaspase-3weredetectedbyimmunocytochemistry,thecellsof
abnormaldivisionofcellscounterstainwithhematoxylinwereobserved.ResultsComparedwiththecellstreatedwithOX-
aliplatinalone.oxaliplatincombinatedwitha11icinincreasedtheproliferationinhibitionratio(P<0.01)andtheapeptosis
ratio(P<0.01),arrestedinG2/Mphase,increasedtheexprssionofCaspase一
3(P<0.O1)andcellsinabnormaldivision
increased(P<0.01).ConclusionsTheallieincansignificantlyenhancethechemotherapeuticsensitivityoftheHCT-8
cellstooxaliplatin,themechanismmayberelatedtoproliferationinhibition,apoptosisinductionandcellcyclearrest.
Keywords:allicin;oxaliplafin;colorectalcancer;apoptosis;cellcycle 近年来我国大肠癌发病率逐渐增高.奥沙利铂
是近年』一泛用于大肠癌化疗的第3代铂制剂,但长
期应用其
剂量毒副反应较大.大蒜素是从大蒜
球茎中提取的含硫化合物,具有强大的抗炎作
用,,近年研究发现大蒜素具有防癌,抗癌的特
点L32008年7,l2月,我们观察了大蒜素和奥沙
利铂联片J对人大肠癌HCT.8细胞生长的影响.现
如下.
1材料与方法
1.1材料人结肠癌HCT.8细胞(郑州大学肿瘤
中心提供);人蒜素注射液(济南利民制药厂);奥沙
利钔(江苏恒瑞约业有限公司);M1Tr(【]q甲基偶氮
迎il"1
10
唑蓝),DMSO(二甲基亚砜),胰酶(北京中杉金桥公 司);RPIM1640(Hycolon公司);FBS(标准胎牛血 清,TBD公司);苏木素染液,小鼠抗人Caspase一3单 克隆抗体,sP染色试剂盒,DAB检测试剂盒(Santa Cruz公司);PI(碘化丙啶),AnnexinV/FITC细胞 凋亡试剂盒及RNasc(Sigma公司);24孔板,96孔 板(美国Coming公司);酶联免疫检测仪(美国BIO— RAD公司);流式细胞仪(德国Partec公司). 1.2实验方法
1.2.1人蒜素和奥沙利铂对HCT一8细胞生长的抑 制效应取对数牛长期HCT一8细胞,消化成单细胞 悬液并调节细胞浓度为2×10个/ml,接种于96孔 培养板,每孔200l,置于5%CO培养箱37?培 养.2d后细胞密度达70%时殳换培养液并分组处 山东医药2009年第49卷第7期
理:对照组以PBS代替药物,大蒜素组加入大蒜素 使终浓度为l5g/rrd,奥沙利铂组加入奥沙利铂使 终浓度为lOg/II1l,联合用药组加人大蒜素和奥沙 利铂,使终浓度分别为15g/m1和10g/ml(分别 为预试验中大蒜素和奥沙利铂对HCT-8细胞48h Ic浓度的一半).每组设lO个复孑L,每孑L终体积 200l.处理因素作用48h后加入5mg/ml的M,ITr 溶液2Ol,5%CO2培养箱37?继续培养4h;小心 吸去培养液,每~lAlr]人150lDSMO,室温轻轻震荡 30rain后用酶联免疫检测仪于492rim波长处测量 吸光度(OD)值.实验重复3次.细胞增殖抑制率 =
(1一实验组OD值/对照组OD值)×100%:采用 金正均法判断两药合用的协同作用J.金正均公
式为:q=E(a+b)/(Ea+Eb—Ea×Eb),其中E(a +b)为联合处理组的抑制率,Ea,Eb分别为a药和 b药单独处理的抑制率.若0.85<q<1.15为两药 合用单纯相加,若q>1.15为有协同作用,若q< 0.85表示两药合用有拮抗作用.
1.2.2大蒜素和奥沙利铂对HCT.8细胞周期及细 胞凋亡的影响HCT-8细胞用无血清培养基培养 24h,使细胞生长同步化,之后常规培养.细胞密度 达70%时分组,分组及处理同1.2.1,每组设5个平 行样本.处理因素作用48h后终止.胰酶消化后 置于离心管,PBS重悬2次,调节细胞浓度为1.5× l0个/rnl,预留各组各管细胞悬液500行细胞凋 亡检测.另取各组各管细胞悬液2m1分别置于5 ml流式管中,加入70%冰乙醇固定,于4冰箱过 夜后1000r/rain离心5rain,弃去乙醇,PBS洗3 次,加人l0g/ml的RNasel50ml于37?消化30 rain,加人5Og/m1的PI于4c【=染色1h,300目尼 龙网过滤后上流式细胞仪检测细胞周期,实验重复 3次.取预留的各组各管细胞悬液100分别置于 流式管中,加人5lAnnexin—V/FITC和5lPI溶 液(2Og/m1),混匀后室温避光孵育15rain,加入 400l结合缓冲液,重悬后及时上流式细胞仪检测 凋亡细胞,实验重复3次.
1.2.3大蒜素和奥沙利铂对HCT一8细胞Caspase.3
表达及细胞分裂的影响取对数生长期HCT一8细 胞,加入已放置无菌盖玻片的24孑L板中,盖玻片上 的细胞密度达70%时更换培养液并分组.分组及 处理同1.2.1,每组5孔.处理因素作用48h后终 止.每孔PBS洗2遍,4%多聚甲醛固定30rain.采
用免疫细胞化学SP法DAB检测系统检测Caspase一 3的表达.苏木素复染观察异常分裂细胞.染色步 骤严格按照试剂盒说明书操作.结果判定:Caspase一 3阳性细胞胞质出现棕黄色颗粒,异常分裂细胞主 要指有丝分裂期两个子代细胞的细胞核形态明显不 对称或细胞核数目>2个.随机选取5个高倍视 野,每个视野记数100个细胞中的Caspase-3阳性细 胞数N+,以?N+/500X100%表示蛋白表达的阳 性率.苏木素复染后高倍镜下计数500个分裂期细 胞中的异常分裂细胞数n,以n/500X100%表示异 常分裂细胞占分裂期细胞的百分比.试验重复3 次.
1.3统计学方法采用SPSS13.0软件统计学处 理.计量资料以x?s表示,多组间均数比较采用单 因素方差
.P?0.05为差异有统计学意义. 2结果
2.1各组细胞生长率大蒜素和奥沙利铂单独作 用48h后HCT-8细胞生长抑制率分别为19.8l% ?1.45%和21.56%?1.68%,两药联合作用48h 后生长抑制率为57.32%?1.89%.与单药组比 较,联合用药组细胞生长抑制率明显增加,P均< 0.Ol;两药合用有协同作用,q=1.55,P<0.05.
2.2各组细胞各周期百分比及细胞凋亡率大蒜 素诱导48h后,与对照组比较,联合用药组,大蒜素 组的G./G期细胞减少,G/M期细胞增加(P均< 0.O1),而s期细胞无明显变化(P>0.05);奥沙利 铂组各周期与对照组比较无明显变化(P均> 0.05).与对照组比较,大蒜素组,奥沙利铂组及联 合用药组的凋亡率均增加(P均<0.O1);与奥沙利
铂组,大蒜素组分别比较,联合用药组细胞凋亡率明
显增高(P均<0.O1).见表1.
表1药物作用48h后各组细胞周期百分比,凋亡率及Caspase-3阳性率(%.?s) 注:与对照组比较,',J(O.01;与奥沙利铂组比较,P<O.01;与大蒜组比较,'P<O.O1
2.3各组Caspase-3l;闩性表达率及异常分裂细胞百素和奥沙利铂组及联合用药组Caspase-3阳性表达
分比处理『天l素作用48h后,与对照组比较,火蒜牢均增加,(P均<0.O1);与各单药组比较,联合用
l】
药组Caspase一3阳性表达率均增加(JP均<0.01). 见表1.联合用药组和大蒜素组异常分裂细胞百分
比分别为12.17%?0.76%和9.85%?0.57%,与
对照组(4.20%?0.48%)比较均升高(P均<
0.01);奥沙利铂组(4.62%-4-O.68%)与对照组比
较无显着差异.与各单药组比较,联合用药组异常
分裂细胞百分比均增加(P均<0.01).
3讨论
近年来我国大肠癌发病率不断上升.奥沙利铂
是大肠癌术后辅助化疗及部分晚期大肠癌姑息化疗
的一线药物,但其剂量累积毒性限制了其长期应用.
大蒜素是一种含硫化合物,分子式为CH.
0s,化学名为二烯丙基三硫化物(DiallylTrisulfide, DATS),是大蒜的主要有效成分,被誉为天然广谱抗
生素?J.近年研究发现大蒜素还有抑制细胞增殖,
细胞周期阻滞,诱导凋亡及调节化疗敏感性等抗肿瘤
作用.国内外有大蒜素联合紫杉醇或顺铂作用于宫
颈癌,前列腺癌,食管癌及胃癌等细胞的报道,但大蒜
素与奥沙利铂联合作用于大肠癌的报道鲜见.
本研究结果显示,大蒜素对大肠癌HCT.8细胞
有增殖抑制作用(抑制率为l9.8l%?1.45%);且 其与奥沙利铂联用时抑制率明显升高(57.32%4- 1.89%),对细胞增殖有协同抑制作用,表明两药合 用的细胞增殖抑制作用大于两药单用的抑制作用之 和.Arunkumar等通过3H一胸腺嘧啶核苷掺人法 观察到大蒜素能抑制人类前列腺癌PC.3细胞的增 殖.wu等通过Westernblot分析发现大蒜素能 减少人类肝癌J5细胞的增殖,并将细胞周期阻滞于
,本实验结果与其相符.大蒜素对HCT.8 G:/M期
细胞增殖抑制作用可能与其可将HCT.8细胞周期 阻滞于G:/M期有关;关于大蒜素和奥沙利铂协同 抑制细胞增殖作用的机制尚需进一步研究. 关于大蒜素影响细胞周期的机制,Knowles 等研究了其与蛋白激酶C(PKC),钙依赖蛋白激 酶II(CAMKII)和细胞外信号调节激酶(EPK)的相 关性,认为大蒜素磷酸化EPK是将细胞阻滞于G/ M期的机制之一.为进一步明确其是否阻滞于M 期,我们用苏木素复染后观察了各组分裂期细胞的 细胞核情况,发现大蒜素组和联合用药组分裂期的 异常分裂细胞百分比较对照组为高,而奥沙利铂组 无明变化.提示大蒜素可干扰HCT一8细胞的有 丝分裂,使细胞阻滞于M期.
本研究各用药组HCT一8细胞凋亡率均njj显增 高;与各单药组比较,联合用药组凋I:率明显增加. 在绱胞凋亡信'转导中Caspase一3起核心作用,其被 12
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激活后可直接水解与细胞凋亡相关的蛋白质,使细胞 发生不可逆的凋亡,而针对肿瘤细胞的细胞凋亡是肿
瘤治疗的主要目标j.本研究结果显示,大蒜素组,
奥沙利铂组和联合用药组Caspase一3的阳性表达率均
增加;与各单药组比较,联合用药组表达率明显增加,
证实无论从细胞水平还是蛋白水平,大蒜素对HCT.8
细胞均有促凋亡作用,且能增强奥沙利铂的促凋亡
作用.Hassan等研究发现大蒜素可通过调节人
白血病CD阳性细胞bcl-2基因和Caspase一3蛋白
的表达而提高化疔药物促癌细胞凋亡的作用.
Oommen等?叫发现,大蒜素可通过增强肿瘤细胞
Caspases一3,Caspases.9蛋白表达,诱导癌细胞凋亡小
体的形成和核固缩.我们的结果与此相符.
分析本研究结果,联合大蒜素后,奥沙利铂对大
肠癌细胞系HCT一8的增殖抑制作用及促凋亡作用
明显增强,且可将HCT一8细胞阻滞于M期.证实大
蒜素能增强HCT.8细胞对奥沙利铂的化疗敏感性,
其机制可能与大蒜素抑制HCT.8细胞增殖,促进凋
亡及细胞周期阻滞作用等有关.大蒜素可作为新的
生物反应调节剂与奥沙利铂等化疗药物联合应用,
以减少化疗药物应用剂量,提高肿瘤细胞对化疗药
物的敏感性.但本研究为体外试验,其临床疗效尚
需进一步研究证实.
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