[doc] 角叉菜胶炎性痛及痛过敏诱导大鼠脊髓后角神经元一氧化氮合酶变化的时间特征

[doc] 角叉菜胶炎性痛及痛过敏诱导大鼠脊髓后角神经元一氧化氮合酶变化的时间特征 角叉菜胶炎性痛及痛过敏诱导大鼠脊髓后 角神经元一氧化氮合酶变化的时间特征 中国临床康复第7D卷第76期2006—04-25出版 ChineseJournalofClinicalRehabilitation,April252006Vo1.1oN0.16 角叉菜胶炎性痛及痛过敏诱导大鼠脊髓后角神经元一氧化氮合酶 变化的时问特征-- 杨永忠’,郭新华,刘宇宁,王彦华,乔俊红 95 ? 基础研究? 0邯郸市中心医院心内科,河北省邯郸市056OOl;河北工程大学医学 院生理系.河北省邯郸市056oo2 杨永忠,男,1969年生,河北省邯郸市人,汉族,l993年河北医科大学毕 业,副主任医师,主要从事心血管,神经康复方面研究. 中圈分类号:R44I_l文献标识码:A文章编号:l67l一5926(2006)l6-0095一O3 收稿日期:2006—0l-ll修回日期:2006—01一l9(05—50一lO一83l3/Y?x) Timecharacteristicsofchangesofnitricoxidesynthase activityinneuronsofspinalcordposteriorhornin.ratswith carrageenan-inducedinflammatorypainandhyperalgesia YangYong—zhong.,GuoXin—Hua,LiuYu—ning,WangYan—hua.Qiao Jun—hang ‘DepartmentofCardiology.HandanCentralHospital,Handan056ool, HebeiProvince,China;DepartmentofPhysiology,MedicalCollegeof HebeiEngineeringUniversity,Handan056002,HebeiProvince,China YangYong—zhong,Associatechiefphysician,DepartmentofCardiology, HandanCentralHospital,Handan056001,HebeiProvince,China Received:2006—0l—llAccepted:2006一Ol—l9 Abstract AIM:Toobservethechangesofnitricoxidesynthase(NOs1activityinthe spinal’cordposteriorhornduringcarrageenaninflammatorypainand hyperalgesia,especiallythetimecharacteristics. METHODS:TheexperimentwasperformedintheLaboratoryof Physiology,MedicalCollegeofHebeiEngineeringUniversityfromMayto August20o4.FortyhealthymaleWistarratsofcleangradewerechosen andrandomlydividedinto5groupswith8ratsineachgroup:Control group:Ratsreceivednotreatment.Carrageenan—injection12一hourgroup, carrageenan—injection24一hourgroup,carrageenan—injection48一 hourgroup andcarrageenan—injection72一hourgroup,voixpedisofrighthindpawin ratswerehypodermiclyinjectedwith30g/Lcarrageenan0.1mLto establishinflammatory—painmodels.Materialsweredrawnrespectivelyin thel2.24.48and720hoursafterinjectionofcarrageenan.NOS expressionofspinalcordwasdeterminatedwithnicotinamideadenine dinucleotide(NADPH)diaphorase(NADPH—d)histochemicalstain. NADPH—dpositivecellsinlaminaeI—lIofsDinalcordpesteriorhom wereenumeratedandobservedwithlightmicroscope;Thegreydegreeof NADPH—dpositivecellswasdeterminedwithHPLAS—l000color pathologicalimageanalysissystemtoquantitativelyanalyzethestaining intensity.Valueof. greydegreewasinverselyproportionaltostaining RESULTS:Fortyincludedanimalswereinvolvedintheanalysisof results.ChangesofthenumberofNADPH—dpositivecellsinlaminae I一1Iofk:SomeNADPH—dpositivecellsweredetectedinthecontrol groupwhilethenumberofpositivecellsinlaminaeI—lIofspinalcord posteriorhornineithersamelateralorcontralateralsides12.24.48hours afterinjectionofcarrageenanwereincreasedandreachedtheDeakinthe 24hourandgraduallydecreased24hoursaftertheinjectionofcarrageena andthatinbilateralsidesrecoveredtothecontrollevelinthe72.dhour.In addition,numberofNADPH—dpositivecellsintheipsilateralsidewas morethanthatinthecontralateralsideineachtime—pointafterinjected withcarrageenan.(2)ChangesinthestainingdegreeofNADPH.dpositive cellsinlaminaeI—lIoftheL:Afterinjectionofcarrageenan.thatin bilateralspinalcordposteriorhornsgraduallybecamedeeperafter injectionofcarrageenanandreachedthepeakinthe24hourandbegan toattenuate24hoursaftertheinjectionofca~ageenan.Statisticalresult showedthatthoseinthel2hour.24hourand48hourgroupswere remarkablydeeperthanthatinthecontrolgroup(i.e.thevalueofgrey degreedecreased),amongwhichthestainingdegreewasthedeepestinthe 24hourofinjectionofcarrageenan.Atthe72hour.thestainingdegree ofNADPH—dpositivecellsinlaminaeI—lIofthecontralateralspinal cordposteriorhornrecoveredtocontrolleve1.whileneitherdidthosein thebilateralsides.1twasfoundincomparisonbetweenbilateralsidesthat thestainingintensityofNADPH—dpositivecellsinipsilateralsidewas deeperthanthatinthecontralateralsideateachtime—ppointafterthe injectionofcarrageenan. CoNCLUS10N:Duringtheprocessofcarrageenan—inducedinflammatory painandhyperalgesia,NOSactivityinspinalcordposteriorhornis reinforcedwithacertainchangingcharacteristicsintime. YangYZ.GuoXH.LiuYN.WangYH,QiaoJH.Timecharacle~islics0fchanges0f nitricoxidesynthaseadivilyinneuronsofspinalcordposteriorhorninrotswith carrageenan—inducedinflammatorypainand Kan~u2006:10f16):95—7lchinaJ 杨永忠,郭新华,刘宇宁,王彦华,乔俊红.角叉菜胶炎性痛及痛过敏诱导大鼠脊髓 后角神经元一氧化氮合酶变化的时间特征Ull中国临床康复,2o06,10(16):95—7 1www.zgkk~coral 摘要 目的:观察角叉菜胶炎性痛及痛过敏中脊髓后角一氧化氮合酶的变化, 特别是其时间特征. 方法:实验于2004-05/08在河北工程学院医学院生理学实验室完成. 选用清洁级健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为5组,每组8只:对照 组:不加任何处理.注射角叉菜胶12h组,注射角叉菜胶24h组,注射 角叉菜胶48h组,注射角叉菜胶72h组,大鼠右后掌足跖部皮下注射 30异/L角叉菜胶0.1mL建立炎性痛模型,分别在注射角叉菜胶后l2, 24,48,72h取材.应用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶组织化学法测 定脊髓一氧化氮合酶表达.应用光学显微镜下观察并计数脊髓后角I, ?板层内尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶阳性细胞数目:应用 HPLAS一1000高清晰度彩色病理图文分析系统软件测定尼克酰胺腺嘌 呤二核苷酸一黄递酶阳性细胞的灰度值,用于定量分析染色深度,灰度 值与染色深度呈反比. 结果:纳入动物4O只,均进入结果分析.?脊髓后角I,?板层尼克 酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶阳性细胞数量的变化:对照组可见少量尼 克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶阳性细胞,注射角叉菜胶后l2,24,48h, 无论是同侧还是对侧的脊髓后角I,?板层内,阳性细胞数目均较对照 组增加,24h达到高峰,以后逐渐减少,至72h,两侧均恢复至对照水 平.此外,两侧脊髓后角比较,在注射角叉菜胶后各时间点,注射侧的阳 性细胞数目均比对侧多.?k脊髓后角I一?板层尼克酰胺腺嘌呤二核 苷酸一黄递酶阳性细胞染色深度的变化:注射角叉菜胶后,双侧脊髓后 角尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶阳性细胞染色均逐渐加深.至24h 达高峰,以后逐渐降低.统计结果表明,l2,24,48h组阳性细胞染色深 度均较对照组明显加深(即灰度值降低),其中24h加深最显着;至 72h时,注射部位对侧脊髓后角I,?板层内的阳性细胞染色已恢复 至 对照组水平,而同侧尚未降至对照组水平.两侧比较,发现注射角叉菜 胶后各时间点,注射同侧均较对侧阳性细胞染色加深. 结论:角叉菜胶炎性痛及痛过敏中,脊髓后角一氧化氮合酶活性增强. 且这种增强有一定的时间变化特征. 主词:疼痛;痛觉过敏;一氧化氮合酶;脊髓 0引言 外周伤害性信息传人可导致痛及痛过敏.一氧化 氮作为机体细胞生成和释放的生物活性物质,在中枢 神经系统内可作为细胞内第二信使和神经递质发挥作 用.实验表明,一氧化氮在疼痛及痛过敏的形成及维 持中发挥重要作用.由于一氧化氮合酶是一氧化氮 96:C删N21.-1伽470/R杨等.苎蚤薏譬霎琵器蒿霭鼠脊髓后角神经元 合成的关键酶,因此,通常采用检测组织中一氧化氮 合酶活性来反映一氧化氮的生成情况.在外周伤害性 信息持续传人时,一氧化氮合酶活性是否增强,一氧 化氮生成是否增多,有关这一方面的研究结果不相一 致[4.51.本文旨在观察角叉菜胶炎性痛及痛过敏中脊髓 后角一氧化氮合酶活性的变化,特别是其时间特征. l材料和方法 :随机分组设计,对照动物实验. 单位:河北工程学院医学院生理学实验室. 材料:实验于2O04—05/08在河北工程学院医学 院生理学实验室完成.选用清洁级雄性Wistar大鼠4O 只,体质量250—280g,由河北医科大学实验动物中心 提供(合格证编号:DKIM05—0081).试剂:角叉菜胶,尼 克酰胺腺嘌呤二核苷酸及氯化硝基四氮唑蓝(sigma公 司).主要仪器:光学显微镜,德国Leica恒温箱冷冻切 片机,HPLAS一1000高清晰度彩色病理图文分析系统. 设计,实施,评估者:设计为第一作者,评估为第 二,三作者,实施为第一,二,三,四作者,均经过专业 训练. 方法: 模型建立[61:40只Wistar大鼠随机分为5组,每组 8只:对照组,注射角叉菜胶12h组,注射角叉菜胶 24h组,注射角叉菜胶48h组,注射角叉菜胶72h 组.对照组不加任何处理,其他组分别于右后掌足跖 部皮下注射3Og/L角叉菜胶O.1mL建立炎性痛模 型,分别于造模后12,24,48,72h,多聚甲醛灌注固 定,取材. 标本采集:在100g/L水合氯醛腹腔麻醉 (350mg/kg)下,常规4Og/L多聚甲醛固定,打开椎 板暴露脊髓,找到并取出脊髓节段.将标本置于4cI= 的多聚甲醛固定液中后固定4—6h,随后移入150g/L 蔗糖溶液中,于4cI=冰箱内存放至标本沉底,再移入 3Og/L的蔗糖溶液中至沉底. 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶组织化学染 色:将所取脊髓标本做横截面连续冰冻切片,片厚 4Om,以pH7.4的O.1mol/L磷酸盐缓冲液接片.尼 克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶反应以漂片法进行: 将切片移入含1.0g/L的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸, O.5g/L氯化硝基四氮唑蓝,10g/LTtitonX一100和 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pU7.4)的混合液内,置于 37cI=的温箱中温育4h,,然后将切片移入O.1mol/L磷 酸盐缓冲液(pH7.4)中终止反应后,用磷酸盐缓冲液漂 洗3遍,3min/次,然后将标本捞至明胶玻片上铺展, 干燥,10g/L中性红复染5,10min,脱水,透明,封固. 细胞计数及图像分析:每只动物随机抽取2O张 切片于光学显微镜下观察,分别计数脊髓后角I,?板 层内尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶阳性细胞数 目;应用HPLAS.1000高清晰度彩色病理图文分析系 统软件测定尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶阳性细 胞的灰度值,用于定量分析染色深度,灰度值越小,染 色越深.2O张切片的平均数值作为每例动物的阳性细 胞数目值及染色灰度值. 主要观察指标:L5脊髓后角I,?板层尼克酰胺 腺嘌呤二核苷酸二黄递酶阳性细胞数量和染色深度的 变化. 统计学分析:由第二作者采用SPSSl1.O进行数 据处理,数据以表示,多个样本均数比较采用单因 素方差分析(one—wayANOVA),之间的两两比较行口 检验;左右两侧均数比较行配对t检验,以P<0.05为 差异显着. 2结果’ 2.1实验动物数量分析纳入动物40只,均进入结 果分析,无脱落. 2.2实验动物造模后反应足底注射角叉菜胶数分 钟后,局部迅速肿胀,动物出现反复抬足,舔足等自发 痛行为.约2h后,自发痛行为自行消失,局部炎症反 应于注射角叉菜胶后24h达高峰.’ 2-3L5脊髓后角l,?板层尼克酰胺腺嘌呤二核苷 酸一黄递酶阳性细胞数量的变化对照组大鼠L5脊髓 后角I,?板层内可见少量尼克酰胺腺嘌呤二核苷 酸一黄递酶阳性细胞,注射角叉菜胶后12,24,48h,无 论是同侧还是对侧的脊髓后角I一?板层内,阳性细 胞数目均较对照组增加,24h达到高峰,以后逐渐减 少,至72h,两侧均恢复至对照水平.此外,两侧脊髓 后角比较,在注射角叉菜胶后各时间点,注射侧的阳性 细胞数目均比对侧多,见图1. 一4o :I缸,35 茎 量 壁医l5 餐墟10 bebc 广1| 广1I广一ldl广1I左右 2.4L5脊髓后角l,?板层尼克酰胺腺嘌呤二核苷 酸一黄递酶阳性细胞染色深度的变化注射角叉菜胶 后,双侧脊髓后角尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶 阳性细胞染色均逐渐加深,至24h达高峰,以后逐渐 降低.统计结果表明,12,24,48h组阳性细胞染色深 度均较对照组明显加深(即灰度值降低),其中24h加 深最显着;至72h时,注射部位对侧脊髓后角I,?板 ISSN1671-5926CN21—1470/R#嵋圣删中国临床康复2006年4月25 日第l0鲞蔓!皇塑 层内的阳性细胞染色已恢复至对照组水平,而同侧尚 未降至对照组水平.两侧比较,发现注射角叉菜胶后 各时间点,注射同侧均较对侧阳性细胞染色加深,见 图2.’ 右 3讨论 注射角叉菜胶已用于制备多种组织炎症模型.足 底皮下注射后,动物出现早期的痛反应和随后的痛觉 过敏,表现为舔,摇动后掌,后掌抬离盒底,对热刺激 的耐受性下降等.伴随这些行为变化及注射局部的炎 症反应,脊髓后角I一?板层尼克酰胺腺嘌呤二核苷 酸一黄递酶阳性细胞数量增加,染色加深.尼克酰胺腺 嘌呤二核苷酸一黄递酶阳性细胞胞体多成菱形,一些 为卵圆形或圆形,部分细胞可见明显的突起.此外,还 可见一些纤细的阳性染色神经纤维.这些特征符合神 经元的形态特征.因此可以认为,尼克酰胺腺嘌呤二 核苷酸一黄递酶阳性细胞大部分为神经元.已经证实 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶染色是一种标记一 氧化氮合酶的特异方法f7.,因此,注射角叉菜胶后脊 髓后角I一?板层尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶 阳性细胞数量增加,染色加深,表明这些神经元内一 氧化氮合酶活性增强,一氧化氮生成增多. 脊髓后角一氧化氮合酶活性增强的可能机制:尼 克酰胺腺嘌呤二核苷酸一黄递酶阳性细胞数目增加和 染色加深.这有两种可能:一是一些神经细胞本身即含 有一氧化氮合酶,但由于在正常情况下含量极低而未 能被染出;持续传递伤害性信息后,使细胞内一氧化氮 合酶含量增加.另一种可能是一些细胞在正常情况下 并不含有一氧化氮合酶,持续传递伤害性信息后,引起 细胞内转录水平的变化而导致神经型一氧化氮合酶 mRNA增加,进而使一氧化氮合酶的合成增多ol. 注射角叉菜胶后脊髓后角I一?板层尼克酰胺腺 嘌呤二核苷酸一黄递酶阳性神经细胞数量和染色加 深,于24h时达到高峰,以后逐渐降低.这表明一氧化 氮合酶活性在24h达到高峰,随后则逐渐减少.此种 97 变化特点可能与炎症反应的强度有关.因为注射角叉 菜胶后24h时,注射部位炎症反应较强,伤害性信息 传递量较多,因此一氧化氮合酶的活性最强;随后炎症 反应逐渐消退,伤害性信息传馐量降低,则一氧化氮合 酶的活性逐渐减弱.此外,本实验中尚观察到注射角叉 菜胶部位对侧的脊髓后角I一?板层尼克酰胺腺嘌呤 二核苷酸一黄递酶阳性细胞数量也增加,染色也加深, 表明对侧脊髓后角内的一氧化氮合酶合成也增加.这 一 结果表明双侧脊髓后角之间可以相互交通,这种交 通可能源于脊髓后角左右侧区域间存在的多突触通 路,或是生化物质的弥散.但是这种交通如何诱导一氧 化氮合酶的合成,目前尚不清楚. 本实验大鼠角叉菜胶炎症性疼痛过程中,神经细 胞内一氧化氮合酶的活性增强,进一步证明了一氧化 氮在伤害性信息传递及痛觉过敏形成中的作用.关于 一 氧化氮在脊髓伤害性信息传递及痛觉过敏形成中的 作用,一般认为在伤害性因素刺激下,初级传人神经末 梢释放兴奋性氨基酸,并由此激活突触后靶细胞内一 氧化氮合酶,使一氧化氮生成增多,促进痛及痛过敏. 本实验中给大鼠注射角叉菜胶造成炎症性痛及痛过敏 灶后,脊髓后角内一氧化氮合酶的活性明显增强,进一 步证明了一氧化氮在痛及痛过敏中的作用,为这一设 想提供了一个有力的实验形态学依据. 综上所述,大鼠后掌注射角叉菜胶后能引起脊髓 后角一氧化氮合酶表达增多,且以注射后24h最为显 着,说明一氧化氮在脊髓水平伤害性信息传递中发挥 了作用,但是一氧化氮合酶增多的机制尚不甚明了,需 要进一步研究. 4参考文献 1GarthwaiteJ.Glutamate,nitricoxideandcell—cellsignallinginthenervous system.TrendsNeurosci1991:14:60—7 2SophieB,GiseleP,AlainE.et.RoleofspinalNMDAreceptors.protein kinaseCandnitricoxidesymhaseinthehyperalgesiainducedbymagnesium deficiencyinrats.BrJPharmacol200l;l34(6):1227—36 lnoueT,MashimoT,ShibataM,etal,Rapiddevelopmentofnitricoxide— inducedhyperalgesiadependsonanalternatetothecGMp-mediatedpathway intheratneuropathiepainmodeLBrainRes1998:792:263—70 YoneharaN,TakemuraM.YoshimuraM.NitricoxideintheratspinalCOrdin FreundSadjuvant—indUCedhyperalgesimJpnJPharmacol1997;75(4】:3 27—35 周红杰,黎海蒂,李希成,等.鞘内注射促皮质素抑制福尔马林痛敏大 鼠脊髓 NOS阳性神经元增多叨.中国药理,1999,2o(8):737-40 NackleyAG.SuplimRL2.HohmannAG.Aperipheralcannabinoidmechanism suppressesspinalfosproteinexpressionandpainbehaviorinaratmodelof inflammation.Neuroscience2003:l17(3):659—70 熊抗辉,赵经纬,王百忍.还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶操作 步骤中 各种参数的选择叨.神经解剖学杂志,1996,l2(2):79—82 HopeBT.MichaelGLKniggeKM.etNeuronalNADPH—diaphoraseisa nitricoxidesynthase.ProcNatlAcadSciUSAl99l:88:281l—4 许敬,方明,黄叔怀.运动后大鼠小脑诱导型一氧化氮合酶的动态变化叨.中 国临床康复.2004,8(33):7514—5 刘定一,刘鸿字,杨桂娇冲枢运动性疲劳应激大鼠下丘脑腹内侧核和背内侧 核神经元中一氧化氮合酶的表达【J】.中国临床康复,2005,9(24):240-1