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肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究.pdf.doc 硕士专业学位 论文题目 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义 及其机制研究 研究生姓名 栗玉龙 杨甲梅教授 指导教师姓名 专业名称 普通外科学 研究方向 肝胆疾病的外科诊治 论文提交日期 2014年 5 月 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 中文摘要 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 中文提要 肝细胞癌(HCC)是一种最常见的原发于肝脏的恶性疾病，发生率位于全球肿瘤 的第五位，在肿瘤相关死亡率中占到第三位，在我国，肝细胞癌患者约占全球患者总 数的 55,。近年来随着药物及治疗手段的多样化，HCC的生存率已明显增高，但是 由于 HCC的早期症状不明显，就诊时往往处于晚期，严重影响了 HCC患者的生存率 和生活质量，因此 HCC的早期诊断变得至关重要。目前临床应用于 HCC的监测及诊 断的指标主要是甲胎蛋白(AFP)，但是由于其假阳性率及阴性率的影响，使得 AFP 的应用呈现出一定的局限性，近年有研究发现 HCC患者中血小板参数呈现规律性的 改变，并且该研究认为平均血小板体积的改变具有特异性，可以联合 AFP应用于 已有报道 HCC患者中血小板平均体积(MPV)相比于肝硬化及肝炎患者会增大， 而且认为HCC MPV的这种变化与白细胞介素-6(IL-6)有一定的相关性，同时更有研究 的诊断，提高发现血小板计数( HCCPLT)与的早期诊断率。 HCC 患者手术切除术后的并发症及死亡率相关，所以本 研究欲通过临床结合实验的办法探索 HCC对于血小板参数的改变及其变化规律，进 而推断血小板参数的改变在预测 HCC、协助诊断、指导预后或监测复发的临床意义。 本研究包括两部分，第一部分通过统计临床 HCC患者病例资料，分析患者手术 前后及复发前后血小板参数的变化规律，推断血小板参数在 HCC发生及监测复发中 的临床意义。第二部分通过实验分析与血小板参数改变以及 HCC相关性最强的两个 因子---IL-6及促血小板生成素(TPO)，在 HCC组织中的表达及血清浓度的变化，寻 找血小板参数改变机制的合理解释。 I 中文摘要 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第一部分: 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义 目的:探讨血小板参数在肝细胞癌患者中的变化规律及其在协助诊断及监测复发中的 潜在的临床意义。 方法:收集 2006年 1月-2011年 12月我院(第二军医大学附属第三临床医院上海东 方肝胆外科医院)特需治疗一科及肝脏移植科行肝脏部分切除术且术后病理证实为肝 细胞癌的 410例患者的临床病例资料，采用配对 t检验的方法分析患者手术前后及复 发前后血小板参数改变的规律。 结果:手术前后血小板计数的差异具有统计学意义(P<0.001)、平均血小板体积在手 术前后、复发前后相比均具有统计学意义(P<0.001)，BCLC分期中，早期、进展期 和中期相比平均血小板体积无统计学差异(P>0.05)。 结论:血小板参数的早期改变可以协助肝细胞癌的早期诊断以及 HCC患者复发的监 测。 关键词:血小板参数协助诊断复发监测 II 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 中文摘要 第二部分: 肝细胞癌中血小板参数改变机制的探讨 目的:探讨肝细胞癌患者中血小板参数改变的可能机制。 方法:收集 2014年 2月-2014年 3月在我院诊断肝细胞癌，并行手术切除患者的肝癌 组织及癌旁组织各 20份，以及血管瘤、局灶结节性增生等患者非病变肝组织 10份， 采用免疫组化方法检测肝癌组织、癌旁组织及非癌患者肝组织中 IL-6及 TPO的表达 结果:IL-6及 TPO在癌组织及癌旁组织中的表达高于非癌患者肝脏组织，两者在癌 情况。 中的表达与癌旁组织相当。 结论:IL-6及 TPO可能都参与了血小板参数的改 变。 关键词:IL-6 TPO免疫组化 作 者:栗玉龙 指导教师:杨甲梅教授 耿利副教授 III 英文摘要 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 The clinical significance and the mechanism of changes of platelet parameters in hepatocellular carcinoma Abstract Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common primary liver malignant tumors, in our country, because of the large amounts of patients with hepatitis B，so patients with hepatocellular carcinoma often experience typical three progresses: hepatitis B–cirrhosis–HCC. Due to the duration up to several decades and difficulty to predict the incidence of carcinoma and few physical examinations, so the prognosis of HCC patients is relatively poor. When patients came to hospital, they found that tumor metastasis and difficult to operate excision, thus led to a serious negative impact on survival and bad quality of life of patients with HCC. For these reasons to find a convenient detection and easy measurement index for the early prediction of HCC occurrence is very important. It has been reported that mean platelet volume (MPV) in patients with HCC is larger than patients with liver cirrhosis and hepatitis. Moreover MPV and IL-6 were positively correlated, at the same time, more studies have found that the platelet count (PLT) is associated with complications and mortality after surgical resection of HCC patients, so I want to combine experimental approach and clinical experiments to find the relationship between platelet and HCC, and looking for a quick, easy, convenient predictor of HCC, to guiding prognosis or monitoring recurrence. This study includes two parts, the first part is the statistical data of clinical cases with HCC patients. Though compare with platelet parameters in preoperative and postoperative, as well as preoperative and recurrence ,to discuss the significance of platelet parameters in recurrence and monitoring the occurrence of HCC. The second part is the experimental analysis about IL-6 and TPO, which is relevant to HCC and platelets. Through test the level in HCC tissue and serum, to discuss the correlation between HCC and platelets，and try to explain the mechanism of platelet parameter changes. IV 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 英文摘要 Part?: The clinical significance of platelet parameters in the hepatocellular carcinoma Objective: To investigate the clinical significance of platelet parameters in early diagnosis and predicting recurrence of patients with hepatocellular carcinoma. Methods: This study was undertaken at the special medicine care dept1 and liver transplantation dept. of Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital (EHBH, the Third Affiliated Hospital of the Second Military Medical University). The medical records of all patients who underwent a liver resection and patients with liver masses which were pathologically confirmed to be hepatocellular carcinomas between January 2006 and December 2011 were reviewed. The total of clinical cases data is 410. We adapt the spss-18 software to analyze the clinical significance of platelet parameter change by Single sample t test. Results: There were significant differences in platelet count between preoperative and post operation (p<0.001), compared with preoperative ones mean platelet volume is also statistical significance (p<0.001) in post operation and recurrence patients. Advanced stage and medium stage compared to the early stage in BCLC stages, mean platelet volume showed no significant difference (p>0.05). Conclusions: The early changes of platelet parameters can help for early diagnosis and detection of recurrence in patients with hepatocellular carcinoma. Key words:platelet parameters diagnosis recurrence monitoring V 英文摘要 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 Part?: The mechanism of platelet parameter changes in patients with hepatocellular carcinoma Objective: to investigate the mechanism of changes of platelet parameters in patients with hepatocellular carcinoma. Methods:We collected 10 shares hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinomatous tissues and 5 shares normal liver tissues from our hospital between 2014 February to 2014 year. We detected, the expression of IL-6 and TPO in the hepatocellular carcinoma tissues, pericarcinomatous tissues and normal liver tissues by using immunohistochemistry. Results: Expression of IL-6 and TPO in cancer tissue and pericarcinomatous tissue was significantly higher than that in normal liver tissues, and their expression in cancer tissue and pericarcinomatous tissue are similar. Conclusions: IL-6 and TPO may be involved in platelet parameter changes. Key words:IL-6 TPO immunohistochemistry Written by: Yulong Li Supervised by: Jiamei Yang Li Geng VI 目 录 引 言?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????1 第一部分肝细胞癌中血小板参数改变的临床意 义 ??????????????????????????????????????????5 研究材料与方法?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????6 结果分析 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 讨 论 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 13 第二部分肝细胞癌中血小板参数改变机制的探 讨 ???????????????????????????????????????? 16 材料与方法 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 17 结 果 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 21 讨 论 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 25 结 论??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 27 参考文献??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 28 综述肝细胞癌与血小板相关性的研究进 展 ????????????????????????????????????????????????? 32 英文缩略词表????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 40 致 谢??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 41 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 引言 引 言 肝细胞癌(HCC)是一种最常见的原发于肝脏的恶性疾病，发生率位于全球肿瘤 [1] 全世界每年大约有新发病例 75万， 的第五位，在肿瘤相关死亡率中占到第三位。 [2] 在我国，肝细胞癌患者约占全球患者总数的 55,，在 每年的死亡病例约有 70万。 [3-4] 肿瘤相关性死亡因素中位居第二，仅次于肺癌。 男女年龄化发病率分别为每 十万人中 37.4和 13.7。近年来随着药物及治疗手段的多样化，HCC的生存率已明 显增高，但是由于 HCC的早期症状不明显，就诊时往往处于晚期，严重影响了患者 [5] 的预后,因此 HCC的早期诊断变得至关重要。 目前临床用于 HCC患者早期筛查或术后监测特异性较强的指标主要是甲种胎儿 [6-7] 球蛋白(简称甲胎蛋白，缩写为 AFP) ，但是由于其尚有 30%-40%的假阴性，严 重影响了 HCC患者的检出，又由于其阳性诊断率仅为 60%-70%，且有时差异较 [8-9] 大， 。临床上急需寻找一种特异性较强、 需动态观察，因此不能仅靠 AFP诊断所有 HCC 监测方便的指标诊断或与 AFP一起协助 HCC患者的早期诊断。 近年研究发现血小板参数在肝细胞癌患者中表现出一定的规律性，即HCC患者中 平均血小板体积高于慢性肝炎、肝硬化及正常对照人群，血小板数量 (PLT)低于慢性 肝炎及正常对照人群，但高于单纯肝硬化人群，提示HCC可能影响了血小板参数的改 变。 该研究认为肿瘤及相关炎症导致了血清IL-6水平的升高，IL-6会刺激骨髓巨 [10-12] 核细胞的增值及分化，并能够增加血小板直径。先前的研究也已经证实HCC的发生与 IL-6具有相关性，且IL-6水平的升高在HCC的极早期就会表现出来，因此我们认为IL-6 参与了HCC患者血小板参数的改变 ，血小板参数的改变可用于HCC早期诊断。也 [10] [13-15] ， 有研究指出平均血小板体积(MPV)与AFP一起可以使HCC诊断率提高至90%以上 但是由于肝硬化程度及脾功能亢进都会不同程度影响血小板参数的改变，因此我们通 过临床结合实验的方法进一步研究血小板参数与肿瘤的关系，并阐述血小板参数改变 所涉及的相关因子。 我们这里研究的血小板参数主要包括平均血小板体积与血小板计数，两者多用于 血液系统相关疾病的检查和诊断中，自 1958年 wood教授发现血小板是参与肿瘤细 1 [16] 引言 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 胞转移的重要因子，血小板与肿瘤之间的研究越来越多，近年研究发现血小板在 HCC 形成中也扮演了重要的角色，在病毒性肝炎患者中血小板通过介导肝内病毒 -特异性 CD8+T细胞和病毒非特异性炎症细胞的肝内聚集，造成肝脏的持续慢性免疫损伤， 因此可见血小板与肿瘤之间存在相互作用 ，这种 进而诱导了 HCC的发[17-18] [19-21] 生。 作用一方面表现在肝脏的损伤过程，另一方面表现在 HCC对血小板的影响，所以我 们想进一步证实 HCC对于血小板参数的改变及变化规律，利用这些规律探索新的 HCC的诊断或治疗方法。 研究中发现对于血小板的形成，促血小板生成素(TPO)能够最大程度的促进巨 核细胞集落形成单位，在体外实验中也发现，TPO与其他一些造血细胞因子组合， 包括 IL-3，IL-11和干细胞因子(SCF，KITLG)等，不仅可以显著增加巨核细胞集 落的形成，更能够增加新生成血小板直径，因此 HCC患者中血清或组织中 TPO的浓 度是否也会受肿瘤细胞的影响，有待进一步的研究。 TPO即促血小板生成素，主要由肝脏细胞产生，肾脏和平滑肌等组织也会分泌 [22] 少量，是巨核系祖细胞的扩增和分化的主要调节因子。 此外，TPO对造血干细胞 的稳定存在也是至关重要的，它是一个作用广泛的细胞因子。 TPO通过与其受体 C-MPL(也被称为 MPL)结合，激活一系列的下游信号转导通路，促进细胞存活和 [23] 增殖。除此以外发现在肿瘤细胞中 MPLmRNA表达水平也是明显升高的。 血浆 TPO水平的调节部分依赖于血小板计数，血小板增多症患者中，TPO会被 血小板吸附，血清水平较低;相反，血小板减少症患者中，肝脏产生的 TPO几乎不 被血小板吸附，血液水平较高。这个论断的数据来自 THPO半合子小鼠实验，通过调 [24] 控一个等位基因 THPO模拟血小板减少，可以使血小板计数减少 40%。 此外，一些炎症状态与 TPO水平升高相关的血小板计数改变有关，如炎症因子 IL-6能够诱导 TPO表达增加间接刺激血小板的生成，这个实验也证明炎症反应介质 [25] 能够增加 TPO在体内外血清浓度水平。 除此以外我们也发现，IL-6也能够增加肝 癌细胞中 TPO的生成，这对我们关于血小板改变机制的研究是一个突破，因此与血 [26] 小板生成相关的两个因子便相互联系在了一起。 本研究通过病例分析结合基础实验的方法研究患者肝癌组织、癌旁组织中 IL-6及 TPO表达水平以及 HCC患者中血清浓度水平与血小板参数改变的相关性，重在寻找 HCC与血小板参数改变的机制，进而为血小板参数对于 HCC的诊断作用提供理论基础。 2 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 引言 参考文献: [1] Rampone B, Schiavone B, Confuorto G. Current management of hepatocellular cancer[J]. Current oncology reports, 2010, 12(3): 186-192. [2] Ferlay J, Shin H R, Bray F, et al. GLOBOCAN 2008, cancer incidence and mortality worldwide: IARC CancerBase No. 10[J]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer, 2010, 2010: 29. [3] Yang T, Lu J H, Wu M C. Hepatocellular carcinoma in China [J]. Student BMJ, 2010, 18: c1026. [4] Parkin D M, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics, 2002[J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2005, 55(2): 74-108. [5] Yang J D, Roberts L R. Hepatocellular carcinoma: a global view[J]. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology, 2010, 7(8): 448-458. [6] Cheng J, Wang W, Zhang Y, et al. Prognostic Role of Pre-Treatment Serum AFP-L3% in Hepatocellular Carcinoma: Systematic Review and Meta-Analysis[J]. PLOS ONE, 2014, 9(1): e87011. [7] Cui Z, Yu X, Guo L, et al. Combined Analysis of Serum Alpha-Fetoprotein and MAGE-A3-Specific Cytotoxic T Lymphocytes in Peripheral Blood for Diagnosis of Hepatocellular Carcinoma[J]. Disease markers, 2013, 35(6): 915-923. [8] Bruix J, Sherman M, Llovet J M, et al. Clinical management of hepatocellular carcinoma. Conclusions of the Barcelona-2000 EASL conference[J]. Journal of hepatology, 2001, 35(3): 421-430. [9]Forner A, Llovet JM, Bruix J. Hepatocellular carcinoma. Lancet .2012,379:1245–1255. [10] Kurt M, Onal I K, Sayilir A Y, et al. The role of mean platelet volume in the diagnosis of hepatocellular carcinoma in patients with chronic liver disease[J]. Hepato-gastroenterology, 2011, 59(117): 1580-1582. [11] Cho S Y, Lee A, Lee H J, et al. Mean platelet volume in Korean patients with hepatic diseases[J]. Platelets, 2012, 23(8): 648-649. [12] Cho S Y, Yang J J, You E, et al. Mean platelet volume/platelet count ratio in hepatocellular carcinoma[J]. Platelets, 2012, 24(5): 375-377. [13] Porta C, De Amici M, Quaglini S, et al. Circulating interleukin-6 as a tumor marker for hepatocellular carcinoma[J]. Annals of oncology, 2008, 19(2): 353-358. [14] Wong V W S, Yu J, Cheng A S L, et al. High serum interleukin‐6 level predicts 3 引言 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 future hepatocellular carcinoma development in patients with chronic hepatitis B[J]. International journal of cancer, 2009, 124(12): 2766-2770. [15] Kilinçalp S, Ekiz F, Basar Ö, et al. Mean platelet volume could be possible biomarker in early diagnosis and monitoring of gastric cancer[J]. Platelets, 2013 (0): 1-3. [16] Giles C. The platelet count and mean platelet volume[J]. British journal of haematology, 1981, 48(1): 31-37 [17] Iannacone M, Sitia G, Isogawa M, et al. Platelets mediate cytotoxic T lymphocyte–induced liver damage[J]. Nature medicine, 2005, 11(11): 1167-1169. [87] Sitia G, Aiolfi R, Di Lucia P, et al. Antiplatelet therapy prevents hepatocellular carcinoma and improves survival in a mouse model of chronic hepatitis B[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(32): E2165-E2172. [19] Kaneko K, Shirai Y, Wakai T, et al. Low preoperative platelet counts predict a high mortality after partial hepatectomy in patients with hepatocellular carcinoma[J]. World Journal of Gastroenterology, 2005, 11(37): 5888. [20] Amano H, Tashiro H, Oshita A, et al. Significance of platelet count in the outcomes of hepatectomized patients with hepatocellular carcinoma exceeding the Milan criteria[J]. Journal of Gastrointestinal Surgery, 2011, 15(7): 1173-1181. [21] Sitia G, Iannacone M, Guidotti L G. Anti-platelet therapy in the prevention of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J]. Journal of hepatology, 2013, 59(5): 1135-1138. [22] Hitchcock I S, Kaushansky K. Thrombopoietin from beginning to end[J]. British journal of haematology, 2014, 165(2): 259-268. [23] Erickson-Miller C L, Chadderton A, Gibbard A, et al. Thrombopoietin receptor levels in tumor cell lines and primary tumors[J]. Journal of oncology, 2010, 2010. [24] de Sauvage F J, Carver-Moore K, Luoh S M, et al. Physiological regulation of early and late stages of megakaryocytopoiesis by thrombopoietin[J]. The Journal of experimental medicine, 1996, 183(2): 651-656. [25] Kaser A, Brandacher G, Steurer W, et al. Interleukin-6 stimulates thrombopoiesis through thrombopoietin: role in inflammatory thrombocytosis[J]. Blood, 2001, 98(9): 2720-2725. [26] Wolber E M, Jelkmann W. Interleukin-6 increases thrombopoietin production in human hepatoma cells HepG2 and Hep3B[J]. Journal of Interferon & Cytokine Research, 2000, 20(5): 499-506. 4 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第一部分 第一部分肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义 理论分析: 肝细胞癌(HCC)是原发于肝脏的恶性肿瘤，占到原发性肝癌的 90% 以上，对 [1] [2-3] 于 HCC发生的监测，目前临床上常用的血液学指标主要是甲胎蛋白(AFP)，但是由 ，因此 于 AFP的敏感性及假阳性率的限制，使得 AFP的诊断作用受到一定的局限 寻找一种与 HCC的发生相关的且具有特异性的因子去诊断肝细胞癌或者协同 AFP一 起提高诊断的阳性率势在必行。 近年来文献报道，在 HCC、肝硬化及肝炎患者中发现血小板参数变化具有一定 的规律(前已述)，这种规律提示 HCC可能影响了血小板参数的改变，因此有专家提 [4-5] 出血小板参数的改变可以用于提高 HCC诊断率 ，但是对典型的 HCC患者可能都 经历了―肝炎-肝硬化-肝细胞癌‖这一过程，患者往往伴有比较明显的脾功能亢进，而 脾功能亢进又会影响血小板的参数，所以二者之间是否有相关性以及相关性的稳定性 遭到质疑，2013年 Serta K?l?ncalp和 Sait Demirkol等人发表的关于血小板参数在胃 癌患者中的研究表明，胃癌患者中平均血小板体积高于正常对照人群，相比于胃癌术 [6] [7] 前，胃癌术后平均血小板体积又会减小，除此以外，如肺癌、胰腺癌、某些卵巢 [8] [9] [10] 癌 中都发现了类似规律，提示血小板参数的改变可能是与肿瘤相关的。 如果血小板参数的改变的确与肿瘤相关，此规律便可以用于 HCC的诊断，或者 [11] 与 AFP一起提高 HCC诊断的准确率，基于此原理，在 HCC复发中也可以通过检 测血小板参数的改变，监测肿瘤的复发或再发。尤其是对于 AFP阴性的病人，血小 板参数将会提供更多的参考。 基于以上的想法，本研究主要通过两方面去阐述该问题，首先对比患者手术前后 血小板参数的改变，找出其中的规律，另一方面，通过比较 HCC复发前后血小板参 [12-14] 数的变化，寻找复发后血小板参数改变的规律。本次研究相比较于其他人的研究 ， 有以下几点独特之处:首先病例数 410例，较为丰富，其次分析病人术前、术后及复 发时三个时间段血小板参数的改变，最后排出了肝炎活动、不同肝细胞癌分期等的影 响，更加说明了血小板参数与肿瘤的相关性。 5 第一部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 研究材料与方法 一、病例资料及特点 回顾性的收集上海东方肝胆外科医院(第二军医大学第三附属医院)特需治疗一 科及肝脏移植科自 2006年 1月-2011年 12月期间住院病人中，诊断为原发性肝癌且 行肝脏部分切除手术，术后病理证实为肝细胞癌的病例，并排除以下几点: 1.手术前后出现感染症状者且经血液化验或血培养证实(包括蜂窝织炎、泌尿系感 [15-17] 染、自发性腹膜炎、胆道感染等、明确的上呼吸道感染或疑似感染无法明确病因 者) ; 2.任何原因需要行手术切除脾的患者; 3.任何血液系统疾病患者(包括原发性血小板增多症、特发性血小板减少、非脾功 能亢进引起的贫血等)、有冠心病病史者、任何原因要服用阿司匹林、波立维(硫 酸氢氯吡格雷)等抗血小板药物者; 4.输血超过 2000ml者以及各种原因导致的术后恢复时间明显延长者(如:术后出现 胃瘫、胆瘘等，饮食营养较差，术后 1-1.5个月时体重增加不明显或减少者); 5.术后早期复查怀疑残留病灶、切除不彻底或术后第一次复查发现远处已有转移者。 最终有 410份病案资料纳入研究中，包括 382名男性和 28名女性，平均年龄 48.4?10.5 二、统计指标 岁(16-76岁)，所有患者均为中国人。 收集患者的资料主要包括:姓名、性别、年龄、诊断、肿瘤的大小(CT、MRI、 B超测量)、肝炎病史、门脉宽度、脾脏大小厚度、肝功能(采用 child-Pugh评分)、 白蛋白水平、乙肝病毒 DNA、肿瘤分期(采用巴塞罗那，BCLC肝细胞癌分期系统)、 手术前患者指标(血小板计数、平均血小板体积、血细胞及白细胞计数)、手术后患 者一、三、七天指标(血小板计数、平均血小板体积、红细胞及白细胞计数);术后 一月复查时血小板计数及平均血小板体积、红细胞及白细胞计数，肝功能、脾脏大小 及门脉宽度等情况;复发患者治疗前的血小板计数、平均血小板体积、肝功能、脾脏 大小及门脉宽度、肝内影像学描述。 血小板参数的测定及要求:收集患者首次入院、术后一月复查以及首次发现复发 后未行治疗前的血小板计数及平均体积。该血液样本均在我院检验科进行，血小板参 6 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第一部分 [18] 数由西门子 ADVIA 2120i机器测量，血液样本装载在 ，静脉穿刺后 1-2 EDTA管中 小时内进行测定,MPV正常值介于 6和 11.5fl之间。 三、统计分析 统计分析采用 SPSS-18.0(Statistical Product and Service Solutions 18.0)软件进 行分析。所有结果统一用均数?标准差表示。配对样本 t检验被用来比较术前、术后 以及复发时的参数变化的比较。独立样本 T检验用于进行其他参数的比较(包括 AFP 阳性与阴性组、DNA活动与阴性组、BCLC分组的比较)。以 P小于 0.05定义为有统 计学意义。 结果分析 一、患者基本临床特点 410例确诊的 HCC患者，平均年龄为 48.4?10.5岁，年龄范围波动在 16至 76岁 之间，其中男性患者 382例，占总数的 93.17%，女性患者 28例，占总数的 6.83%。 Child-Pugh肝功能评分中，A级肝功能患者包含 379例(92.4%)，B级肝功能患者为 31例(7.6%)且经积极保肝后均转为 A级。患者手术包括根治性手术及部分肝切除 合并门脉癌栓取出术，对于术中肉眼可见的无法切除病灶或癌栓无法取尽者不包括在 内。手术后患者常规在术后 1-1.5个月期间返院复查或行预防性 TACE，患者一般情 况恢复尚可,具有明显恢复不良者排除(前所述)。该患者中发现复发返回我院治疗者， 治疗前的指标予以记录。 7 第一部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 表 1-1 410例患者基本临床特点 P N MPV PLT P 年龄 207 10.5?1.7 176.7?67.3 <50岁 * 0.646 0.001 ?50岁 203 156.7?57.1 10.6?1.86 性别 382(6.8%) 10.6?1.8 165.2?63.2 男 0.63 0.152 10.5?1.8 182.8?68.1 28(93.2%) 女 肝功能 A级 10.5?1.8 170.0?63.0 379(92.4%) 0.001 * 0.067 11.0?1.5 136.0?62.5 B级 31(7.6%) BCLC分期 A期 10.7?1.7 145.3?52.2 87(21.2%) * 10.5?1.9 171.3?63.1 B期 291(71.0%) 0.529 0.002 32(7.8%) 10.5?1.2 179.6?84.6 C期 AFP 221(53.9%) 10.5?1.80 168.5?69.4 阳性 0.413 0.552 189(46.1%) 10.6?1.75 164.7?55.6 阴性 HBV-DNA 阳性 221(58.5%) 10.7?1.9 160.9?63.1 0.223 0.134 157(41.5%) 10.5?1.6 170.9?63.6 阴性 注:‘*’以 P<0.05为参考,认为有统计学差异 表 1-2患者术前、术后与复发的基本病例特点 术前(n=410) 术后(n=410) 复发(n=138) 358/52 115/23 379/31 肝功能(A/B) HCC肿块大小 0.6-18.5cm - 0.9-9.1cm 门脉宽度 10.5?1.5mm 10.5?1.6mm 10.5?1.5mm 104.5?18.6mm 110.7?18.6 108.8?25.0 脾脏大小 脾脏厚度 32.4?6.7mm 33.0?8.6mm 33.0?8.8mm 总胆红素 14.4?6.9 11.7?5.0 14.5?5.9 39.2?1.9 白蛋白 42.5?3.5 42.4?4.4 34.0?19.3 47.6?46.5 33.2?15.4 谷丙转氨酶 红细胞计数 4.7?0.5 4.1?0.5 4.5?0.6 白细胞计数 5.5?1.6 4.7?1.5 4.8?1.6 MPV 10.6?1.8 10.3?1.8 10.9?1.6 139.2?51.5 PLT 166.4?63.6 131?51.7 8 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第一部分 二、关于手术前后血小板参数改变的比较 下面我们采用配对 T检验的方法比较患者手术前后血小板参数的改变，假设手术 对于血小板参数没有影响，可以认为 HCC造成了血小板参数的改变。 表 血小板参数在手术前后的比较 2 N=410 t P值 术前 术后 10.6?1.8 t1=3.425 MPV 10.3?1.8 P1<0.001* PLT 139.2?51.5 P2<0.001* 166.4?63.6 t2=10.858 注:t1、P1为术前与术后血小板平均体积相比，t2、P2为术前与术后血小板计数相比，‘*’以 p<0.05为参考，提 示有统计学差异 由表 2可见，患者血小板参数在手术前后相比是有统计学意义，术后血小板体积 相比于肿瘤切除前减小，血小板计数也是减少的，但是该种方法未能排除手术对于血 小板参数的改变，所以我们进一步统计上述患者中术后复发患者血小板参数进行分 析。 三、复发患者血小板参数的比较 为了进一步明确 HCC对于血小板参数的影响，排除手术对于血小板参数的影响， 我们统计了上述记载有患者复发信息的病例 138例，分析患者手术前后、术后与第一 次复发时血小板参数的变化。 图 血小板平均体积的比较 1 9 第一部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 表 3-1血小板参数的 ANOVA分析 MPV F值 P PLT F值 P * <0.001 术前(N=138) 10.7?1.6 5.502 0.004 165.6?60.4 17.444 * 10.2?1.7 141.4?52.0 术后(N=138) 复发(N=138) 10.9?1.4 131.7?51.3 注:‘*’，以 P<0.05作为参考，认为具有统计学意义 表 血小板参数的比较 3-2 MPV t P PLT t′ P′ 术前(n=138) 10.7?1.6 165.6?60.4 * 3.4 0.001 6.578 <0.001 术后(n=138) 10.2?1.7 141.4?52.0 * 术后(n=138) 10.2?1.7 141.4?52.0 * 4.36 <0.001 2.645 0.009 复发(n=138) 10.9?1.4 131.7?51.3 * 术前(n=138) 10.7?1.6 165.6?60.4 1.375 0.171 9.26 * <0.001 复发(n=138) 10.9?1.4 131.7?51.3 注:‘*’，以 P<0.05作为参考，认为具有统计学意义 表 3-1与 3-2中显示，手术前后以及复发前后,平均血小板体积的变化呈现先减 小 后增大的趋势,这种典型的表现说明 HCC影响了血小板,同时血小板计数的变化,也提 示了 HCC的影响,但是没有平均血小板体积的变化规律,对于可能的解释将在讨论中 给出。 四、甲胎蛋白阳性与阴性患者血小板参数分析 甲胎蛋白为目前临床应用最广泛且公认的较特异性的 HCC诊断及检测指标，但 由于其诊断能力的限制，不能诊断所有的肝细胞癌患者，在很多情况下需要与炎症活 动、胚胎瘤等进行区别，如果甲胎蛋白阳性患者与阴性血小板参数有差异，便可以与 AFP一起提高肝细胞癌的诊断，以下分析采用独立样本 T检验的方法进行分析。 10 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第一部分 表 4 AFP阳性与阴性患者血小板参数相比 AFP t P值 阳性(n=221) 阴性(n=189) 10.5?1.80 10.6?1.75 MPV 0.82 0.413 PLT 0.552 168.5?69.4 164.7?55.6 0.406 注:t1、P1为 AFP阳性与阴性患者平均血小板体积相比;t2、P2为 AFP阳性与阴性患者血小板 计数相比 由表 4可知，AFP阳性与阴性的患者血小板平均体积与血小板计数没有统计学差 异，即肿瘤患者是否分泌甲胎蛋白与血小板参数之间没有相关性，但是 AFP与血小 板参数联合诊断原发性肝癌可能会提高诊断的效能和准确性。 五、乙肝病毒对于血小板计数的影响 [19] 病毒性肝炎患者处于病毒活动时，慢性炎症介质是否引起血小板参数的改变 ， 下面通过对乙肝病毒阳性与乙肝病毒阴性的患者采用独立样本 T检验的方法进行验 证。 表 乙肝病毒活动对血小板参数的影响 5 HBV-DNA t P值 阳性(n=221) 阴性(n=157) 10.5?1.6 MPV 10.7?1.9 t1=1.22 1=0.223 PPLT t2=-1.5 P2=0.134 160.9?63.1 170.9?63.6 注:t1、P1为乙肝病毒阳性与阴性患者平均血小板体积相比所得;t2、P2为乙肝病毒阳性与阴性 患者血小板计数相比所得;研究中共有 42例患者缺少 HBV-DNA指标。 以上分析可知，病毒肝炎活动与不活动组相比较，血小板参数均无统计学差异， 即病毒性肝炎活动对于血小板参数无明显影响，因此对于肝细胞癌患者中血小板参数 的改变可以排除肝炎病毒活动的影响，但是对于肝炎造成的肝硬化的影响是无法排除 的。 六、不同 BCLC分期的肝细胞癌中血小板参数的比较 血小板参数对于 HCC预后是否有影响，我们通过对比不同分期患者血小板参数， 同时间接证明肿瘤的大小、远处转移、侵犯程度对于血小板参数的影响，具体详见下 表。 11 第一部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 图 2 BCLC不同分期患者中 MPV比较 表 6-1 BCLC分期的 ANOVA分析 MPV F值 P PLT F值 P 早期(n=87) 10.7?1.7 0.638 0.529 145.3?52.2 6.495 0.002 * 中期(n=291) 10.5?1.9 171.3?63.1 10.5?1.2 179.6?84.6 进展期(n=32) 注:‘*’，以 P<0.05作为参考，认为具有统计学意义 表 6-2 BCLC不同分期数据比较 MPV t P PLT t′ P′ 10.7?1.7 145.3?52.2 早期(n=81) 1.091 0.276 3.507 <0.001 中期(n=291) 10.5?1.9 171.3?63.1 * 10.7?1.7 145.3?52.2 早期(n=81) 2.639 * 0.756 0.451 0.009 10.5?1.9 179.6?84.6 进展期(n=32) 10.5?1.9 171.3?63.1 中期(n=291) 0.978 0.672 0.502 0.28 进展期(n=32) 10.5?1.2 179.6?84.6 注:‘*’以 P<0.05为参考，提示存在统计学差异. 以上结果提示早期、中期、晚期相比，血小板平均体积无明显差异，中期及进展 期与早期相比，血小板计数后者明显比前者小，且具有统计学意义，提示血小板参数 对于 HCC的预后是有一定临床意义的。 12 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第一部分 讨 论 对于肝细胞癌的治疗，早期诊断至关重要，据报道 HCC早期患者五年生存率可 [20] 达 75%以上，但在本研究资料中晚期就诊患者占到 78.8%，严重 [21] 影响了患者生存率 和生活质量，因此早期诊断对于肝细胞癌患者的诊治变得尤为重要 。甲胎蛋白对于 肝细胞癌的诊断率只有 60%-70%，且存在一定的假阳性率，严重限制了其临床应用 价值 ，因此寻找一种新的并且具有特异性的指标协助肝细胞癌的诊断受到越来越 [22-23] 多的重视，但是到目前为止都没有发现敏感性和特异性超过甲胎蛋白的新指标。近年 来在研究肝细胞癌患者癌栓和血栓形成时发现，虽然血小板计数在肝细胞癌患者中相 比于正常人减少，但是平均血小板体积却高于正常对照组，所以有人推测，肝细胞癌 患者血清中虽然血小板数目减少了，但是功能并未减弱，甚至较常人的凝血功能增强 [24] 。这种现象提示我们，血小板参数的这种变化可能具有一定的规律，这种规律可能 与肿瘤相关，如果这种变化具有特异性，血小板参数便可以用于 HCC的诊断，因此 我们探寻二者之间的规律。 先前的研究已经发现，肝细胞癌患者相比于正常人，血小板计数是减少的，但是 平均血小板体积较正常人大，且具有统计学意义，但是该种统计方法，未能排除肝硬 化脾功能亢进及肝炎活动的影响，因此无法直接说明血小板参数的改变是否有肿瘤因 素的参与。因此我们了下列临床研究，首先收集患者新入院的血常规资料，先前 做过治疗者予以排除，然后收集患者手术后来院复查时的资料，术后复查一般在术后 1-1.5个月时间，以我们以往的，该段时间的恢复，病人的一般情况已经好转， 可以进行下一步的治疗，所以我们选择这个时间段进行统计。这两个时间段的资料我 们采用配对 T-test的方法，这样既可以排除肝硬化程度不同造成的影响，也可以排除 个体差异造成的影响，即手术前后患者血小板参数的改变，就可以认为是肿瘤单一因 素造成的影响。之后我们再次统计患者复发后未行治疗的资料，比较肿瘤再次生长后 对于血小板参数的影响。在该设计中我们同时排出了混杂因素的影响，并且探讨了血 小板参数对于 HCC的预后影响。下面对上述结果进行进一步的分析。 通过表 2我们可以看出，手术前后患者血小板平均体积是有统计学差异的，即平 13 第一部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 均血小板体积术前要大于术后或有肿瘤时大于肿瘤切除后，提示肿瘤参与了血小板平 均体积的改变，血小板计数的改变同样具有相似的变化规律。表 3中的数据提示手术 前后、复发前后血小板平均体积的改变具有统计学意义，手术后血小板计数改变明显， 对于术后与复发相比较无统计学意义，由此可见平均血小板体积在的改变具有典型的 变化规律，这种规律可以用于 HCC的诊断及监测，对于术前与术后血小板计数的改 变，可能解释有以下几个方面: 1.血小板计数在肝细胞癌患者中受到影响更为敏感 , 血小板计数的影响因素较多，包括年龄、肝功能等,因此它的稳定性会更差;2手术切 除部分肝脏,可能会影响患者体内包括促血小板生成素等因子的分泌 ;3.是由于随时间 延长肝硬化的加重或脾功能亢进加重的影响等。从上述结果可以看出，平均血小板体 积相对于血小板计数更加稳定，影响因素相对较少，更适合作为一种诊断指标。 对于血小板平均体积的改变目前主要认为与两种因子相关 ---白细胞介素-6(IL-6) 和血小板生成素(TPO)。目前研究认为肝细胞癌的发生很大程度上是由于病毒性肝 [25] [26] 炎这一慢性炎性损伤造成的，其中 IL-6作为一种作用广泛的炎性介质，可以促进骨 髓细胞的增殖、分化和成熟 。研究发现在排除感染因素的前提下，肝细胞癌患者中 [27] IL-6的表达高于正常对照组及肝硬化组 。另有研究表明高水平的 IL-6和 C反应蛋 [28] 白可以通过多种信号通路参与 HCC的发生和转移 。同时实验证明，在 HCC伴有 [29] 肝硬化患者比单纯肝硬化患者具有更高的 IL-6水平 ，此外 HCC患者中，血清高 [30] ，同时研究发现 IL-6浓度在复发患者中 水平被发现早于慢性乙型肝病肝癌的发展 IL-6 的水平也会增加，因此有专家认为 IL-6可作为一个有用的工具，监测 HCC的治疗观察病情缓解和 [31] 。与此同时，研究发现还 IL-6可以有效的刺激巨核细胞的成熟。当 步增加血小板直径。这个研究显示细胞因子能够改变巨核细胞的终末成熟阶段，从一起使用早期活化的 IL-3时，IL-6可以协同促进巨核细胞和造血祖细胞的成熟，逐 [32] 而使大部分血小板可以获得更大的体积。由于 IL-6对巨核细胞的影响，高浓度的细 胞因子可能成为肝癌患者 MPV值较高的合理解释。因此我们认为，在 HCC患者中 IL-6可能参与了 MPV水平的变化。 另一种与血小板的发生关系较为密切的因子为促血小板生成素(TPO)，TPO主 要是由肝脏细胞产生，肾脏和平滑肌等组织也会分泌少量，是巨核系祖细胞的扩增和 [33] 分化的主要调节因子 。血清中游离的 TPO通过与其受体 C-MPL结合，进而 激活信 号转导通路中的一系列的下游分子，促进巨核细胞的增殖和分裂。除此以外，Connie 14 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第一部分 [34] 等 发现在肿瘤细胞中 MPLmRNA表达水平也是明显升高的。在体外实验中也发现， TPO一方面可以最大程度的促进巨核细胞集落形成单位的形成,同时也可与其他一些 造血细胞因子组合，包括 IL-3，IL-11和干细胞因子等共同作用与骨髓巨核细胞系， [35] 增加新生成血小板直径大小 。我们对于肿瘤患者体内 TPO的表达水平及作用尚未 完全清楚，特别是肝脏手术后，血清中 TPO水平的变化规律，因此对于其在肝细胞 癌患者血小板参数改变中的意义需要更多摸索。 [36] 此外，更有研究指出炎症因子，如 IL-6能够诱导 TPO表达，另有一项研 增加 究也发现在肝细胞癌 HepG2和 Hep3B两者细胞系中 TPO在癌组织中的表达也是明显 升高的。该研究将 IL-6与 TPO联系在了一起，说明二者在肝细胞癌中共同参与了血 目前对于血小板参数的改变机制仍有许多未知之处，但是可以肯定的是这是一个 小板参数的改变。 多因素、多步骤的、多种因子参与的复杂过程，我们将在第二部分的实验中探讨可能 的影响机制。 15 第二部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第二部分肝细胞癌中血小板参数改变机制的探讨 理论分析 前已述，HCC影响了血小板参数的改变，这种变化规律对于监测肿瘤的发生、 复发及指导预后有一定的参考价值，但是对于其改变的机制研究较少，仍未有明确的 结果，目前临床认为 IL-6是参与血小板平均体积改变的非常重要的因子，主要基于 以下几点: 1.IL-6可以促进骨髓细胞的增生、分裂与增殖，同时与肝细胞癌患者血清中 IL-6 [37] 水平的升高，具有一定的相关性; 2.前已述 IL-6在肝炎、肝硬化、肝细胞癌变化规律与 MPV变化规律相符,同 时 IL-6与在肿瘤出现的早期开始升高;[11、28] 3.肝细胞癌的发生认为是病毒性肝炎这一慢性炎症过程长期损伤的结果，IL-6 便是参与这一过程的重要的炎症因子，而且也已有报道证实，在某些炎症性疾病中如 [38] [39] 关节炎、活动性肺结核等，血小板平均体积也是增高的; 基于以上几点认识，IL-6似乎可以解释血小板平均体积的改变，但是在肝细胞癌 患者中，由于影响因素较多，如肝硬化程度、脾功能亢进程度、TPO的分泌等，血 小板平均体积的改变是一个综合作用的结果，这似乎可以解释 IL-6水平高于正常人 群的肝细胞癌患者，PLT却低于正常人的原因。 关于 IL-6对 MPV的影响，是促进了现有原有血小板生成机制，还是通过其他 通 路影响了 MPV的改变，目前仍不清楚，在这一过程中，另一重要因子 TPO参也与了 TPO即促血小板生成素，在体外实验中已经证实，TPO不仅能够最大程度的促 血小板平均体积的改变。 进巨核细胞集落形成单位,同时也可与其他一些造血细胞因子组合，包括 IL-3、IL-11 [34] 和干细胞因子等，共同参与血小板的形成 ，可见 TPO对于 MPV的改变的影响 是 肯定的，同时研究也发现，在部分肿瘤患者中，TPO及其配体的表达也是呈现上升 [40] ，因 趋势，也有研究发现 TPO在卵巢癌组织中的表达明显高于癌旁组织中的表达 此推断，升高的这些因子分泌到血清也必然会影响骨髓中血小板的生成。另外有研究 16 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第二部分 [34] 发现 IL-6也可以促进 ，对于 MPV的改变我们可以这样理解，升高的 TPO的表达 IL-6一方面刺激骨髓巨核细胞的增殖、分裂。另一方面通过刺激 TPO的表达直接作 用与骨髓从而导致了 MPV的改变。 因此，本研究立足于上述观点，通过免疫组化的方法证明两者之间的关系，首先 证明患者癌组织及癌旁组织 TPO及 IL-6的表达是否高于正常，同时证明两者表达的 升高是否具有一定的相关性，通过该实验为肝细胞癌患者平均血小板体积改变的机制 提供一点临床参考。 材料与方法 一、材料 (一)组织来源 我院 2014年 2月-2014年 3月期间收治的原发性肝癌患者，取 术中癌组织及癌旁 组织各 20例，术后病理证明为非肝细胞癌者予以排除，另取血管瘤、局灶结节性增 生患者中非病变组织 10例(后面简称正常组织)。 (二)主要试剂 1.基本试剂: 4%中性甲醛、二甲苯、石蜡、3%H2O2-甲醇液、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、 75%乙醇、甲醇、实验超纯水(简称 ddH2O)、0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)、 0.01M PBS缓冲液(PH7.4)、1% BSA、抗体稀释液(FL-5001)、抗鼠-兔二抗、DAB 浓缩液 A、DAB稀释液 B、苏木素、盐酸酒精、树脂、牛血清白蛋白组分?冻干粉 2、特殊试剂: (1)抗 IL-6抗体 ab6672(Abcam,艾博抗上海贸易 有限公司) (2)抗 TPO抗体 ab40664 (Abcam,艾博抗上海贸 易有限公司) 1、PBS缓冲液(pH7.40):NaCl 16.0g，KH2PO4 0.48g，Na2HPO4 7.26g，KCl 0.4g, (三)主要溶液的成分及配制 加 ddH2O稀释成 2000ml,并调节 PH=7.40。 2、0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0): A液 27ml加 B液 123ml，补水至 1500ml， 调 pH为 6.0。 17 第二部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 A液:2.1 g枸橼酸 (1H20合)加水至 100 ml B液: 14.7g枸橼酸钠 (2H20合)加水至 500 ml 3、3%甲醇- H2O2溶液:30% H2O2加 80%甲醇溶液混合配制。 4、盐酸酒精:5ml浓盐酸(HCl)加 75%乙醇 400ml混匀配制。 5、1%BSA:100mg牛血清冻干粉加入 0.01M PBS(PH7.40)10ml配制而成。 6、DAB:一滴 DAB浓缩液 A用 DAB稀释液 B液稀释1、实验纯水机(S.A.67120 MILLIPORE) 至 1ml。 2、免疫组化石蜡包埋机(EG1150H-1150C LEICA) (四)主要实验仪器 3、免疫组化冰冻切片机 4、恒温箱(HB-1000 UVP) 5、显微镜(DMRXA2 LEICA) 6、精密电子天平(PL602-L博特勒-托利多仪器上海分公司) 7.卧式转换型-20?冰箱(BC/BD-536G河南新飞电器有限公司) 8、4?冰箱(BCD-252K伊莱克斯) 9、电热恒温水浴锅(DK-S22 型上海精宏实验设备有限公司) 10、烤片机(HI1220 LEICA) 11、超声波清洗器(KQ3200E 型昆山市超声仪器有限公司) 12、恒温磁力搅拌器(85-2型) 13、PH调节计(DELT320 METTLER) 14.量筒(2000ml、50ml)、烧杯(2000ml、1000ml)、载玻片、盖玻片 15、湿盒、高压锅、微量加样器(200ul) 二、方法: (一)石蜡块透腊和包埋步骤 1、取材与固定: 取术中新鲜的肝癌组织及肝组织块(5mm左右)，初步修剪后置入 4,中性福尔马 林溶液中固定 24-48小时。 2、脱水透明: 将浸泡过福尔马林溶液的组织块置入 75%消毒乙醇溶液中过夜，过夜后的组织块 18 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第二部分 再次浸泡 85%乙醇溶液 2个小时，之后在浸入 95%的乙醇溶液?、?各 1小时，之 后依次无水酒精?、?、?脱水 15min、15min、30min，最后分别置于二甲苯?、? 中进行透明处理。 3、浸蜡包埋: 二甲苯透明后的组织块置于完全溶化的石蜡?、?中各 1小时，蜡的熔点与组织 硬度相适应。待组织浸蜡完全后开始包埋，将预先清理过的铅盒准备好，将熔蜡滴入 盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在铅盒底部，切面朝下，再将做过标记的一 次性塑料器皿置于其上，平放在冷却台上，使其迅速冷却凝固，一般冷却 5-8分钟， 将蜡块取出，置于室温继续冷却，冷却台时间过长会造成蜡块冻裂。 (二)切片: 用轮转式切片机对石蜡块进行切片，厚度为 4-7微米。将切片置于水浴锅内待其 待其完全展开，用载玻片捞起，并置于 60?烤片机上烘烤 5-10分钟。然后收于切片 盒内，恒温箱 37?过夜即可。 (三)免疫组化 1、脱蜡、水化 (1)60?烤片半小时，烤片要充分，防止脱蜡不完全造成染片不均; (2)依次浸入二甲苯(1)(2)(3)各 10minutes，之后分别放入无水乙醇、85%乙 醇、75%乙醇各 5 minutes进行脱水; (3)ddH2O浸泡 5 min进入下一 步; 2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 (1)置入 3%H2O2-甲醇液室温浸泡 20 minutes，取出后用自来水冲洗 3 minutes; (2)实验纯水浸泡 3次，每次 5min,进入修复阶段; 3、抗原修复暴露抗原决定簇 将配置好的 0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)倒入大烧杯内，放入切片，封以 薄膜并扎小洞若干，置于加水沸腾的高压锅内，小火煮沸 30min,时间到后待其自然冷 却并用 ddH2O浸泡 2次，每次 5min。 4、封闭非特异性蛋白 用已配置好的 0.01M PBS缓冲溶液洗 5 min，然后用组化笔圈定组织，再用 1% BSA于湿盒中置于恒温箱封闭非特异性抗原 30min。 19 第二部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 5、一抗的孵育 封闭好的切片加入已稀释的抗体(1:600;1:700)，放入湿盒中 4?过夜(18-22h)。 6、二抗孵育 (1)将一抗倒掉并用 PBS洗 3次，每次 5 min; (2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入 1滴已稀释的二抗后放入 37?恒温烤箱中孵 育 30 min;然后重复(1)×3次 7、显色 加入配好的 DAB开始显色，显色时间控制在约 80s(40s)，甩去 DAB，自来水 冲 5min,然后 ddH2O浸泡 2次，每次 5min。 8、复染、脱水、透明 苏木素复染 10min，自来水冲洗 15秒，盐酸酒精分化 5s,ddH2O洗、自来 水反复 冲洗反蓝 2-5min,最后依次经过 75%乙醇、85%乙醇、无水乙醇分别 30s、30s、1min 9、中性树胶滴入封片，然后盖载玻片封固，注意防止气泡产生。 进行脱水。 (四)待封片液干燥后进行显微镜观察。 (五)统计学分析 统计分析采用 SPSS-18.0(Statistical Product and Service Solutions 18.0)软件进 行分析。所有统计结果统一使用均数?标准差表示。三组间数据的比较采用行×列表的 卡方检验(Chi-square test)或 Fisher确切概率法。以 P小于 0.05定义为有统计学意 义。 20 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第二部分 结 果 一、30例病例临床特点 表 7 30例临床病例特 点 HCC组(n=20) 非 HCC组(n=10) 51.8?9.7 46.9?10.5 年龄 性别 男 17(85%) 5(50%) 3(15%) 5(50%) 女 肝功能 A级 20 10 B级 0 0 HBV-DNA 阳性 7(35%) 2(20%) 阴性 13(65%) 8(80%) MPV 11.8?1.3 10.5?0.8 248?58.9 PLT 162.5?61.7 4.8?0.8 4.8?0.5 RBC 二、免疫分析 1.评分标准 根据细胞的染色面积(S)及染色强度(D)进行综合评分。染色面积评分:无 细胞染色为 0分，<25,细胞染色为 1分，25,-50,细胞染色为 2分，>50,细胞染 色为 3分;染色强度评分:不染色为 0分，轻度染色为 1分，中度染色染色 3分。按照两者积分相加进行评定，积分相加为 0,2分 为(-)，积分相加 3,4 为 2分，强度 分为(+)，积分相加 5-6分为(++)，各等级划分见下图。 [41] 21 第二部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 2.IL-6免疫组化结果统计(具体见图 3- 图 5) 表 9 IL-6免疫组 化 2 X P 组别 (-) (+) (++) 2 X 1<0.001 P正常对照 9 1 0 =33.420 1 2 癌旁组织 2 X =5.461 * 13 5 2 癌组织 P2=0.65 2 6 12 注:X1、P1代表整个图标的构成比，X2、P2代表癌组织和癌旁组织的构成，此运算采用 Fisher确切概率法进行 计算。‘*’，以 P<0.05作为参考，认为具有统计学意义 2 2 由表 9可以看出，IL-6在正常组织中的表达相比较于癌组织及癌旁组织要低，且 具有统计学意义，癌组织及癌旁组织在构成比中的不同尚不能认为存在差异，即二者 在癌旁组织及癌组织中的表达相当。 3.TPO免疫组化结果统计(具体见图 6- 图 8) 表 9 TPO免疫组 化 2 (-) (+) (++) X P 组别 2 7 2 1 X =19.44 P1?0.001 正常对照 1 2 癌旁组织 3 X =2.340 * 11 7 2 癌组织 P2=0.310 1 8 11 注:X1、P1代表整个图标的构成比，X2、P2代表癌组织和癌旁组织的构成，此运算采用 Fisher确切概率法进行 计算。 ‘*’，以 P<0.05作为参考，认为具有统计2 2 学意义 上述表格可以看出，TPO在正常组织中的表达相比较于癌组织及癌旁组织要低， 且具有统计学意义，癌组织及癌旁组织相比，尚不能认为存在差异，即二者在癌旁组 织及癌组织中的表达相当。 22 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第二部分 4.IL-6免疫组化染色结果 图 3.(左为×200倍光镜下右为×400倍光镜观测)肿瘤组织中 IL-6染色，上图可见，IL-6主要存 在细胞浆内，黄色区域面积明显大于蓝色部分，根据上述评分标准为归为阳性，?++‘。 图 4.(左为×200倍光镜下观测，右为×400倍光镜观测)此为 IL-6组化中正常组织染色，图中染 色以苏木素染色为主，无黄色染色，根据上述评分标准归为阴性，?-‘。 图 5.(左为×200倍光镜下观测，右为×400倍光镜观测)此为 IL-6组化染色中癌旁组织染色，较 图 2颜色重，较图 1颜色轻，根据上述评分标准归为阳性，?+‘。 23 第二部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 5.TPO免疫组化染色结果 图 6(左为×200倍光镜下观测，右为×400倍光镜观测)肿瘤组织中 TPO染色，上图可见，TPO 主要存在细胞浆内，黄色区域面积明显大于蓝色部分，根据上述评分标准为归为阳性，?++‘。 图 7(左为×200倍光镜下观测，右为×400倍光镜观测)上图为正常组织中 TPO染色，根据上述 评分标准为归为阴性，?-‘。 图 8(左为×200倍光镜下观测，右为×400倍光镜观测)此为 IL-6组化染色中癌旁组织染色，较 图 2颜色重，较图 1颜色轻，根据上述评分标准归为阳性，?+‘。 24 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 第二部分 讨 论 对于血小板参数特别是平均血小板体积在肝细胞癌患者中的改变具有一定的临 床意义，通过上述病例分析及实验数据可以看出，对于血小板参数的改变参与因素众 多，其中关系较为密切的除了脾功能亢进、肝炎、肝硬化等，白细胞介素-6(IL-6) 和血小板生成素(TPO)所发挥的作用更为重要。 IL-6是一个作用广泛的细胞因子，一般由淋巴细胞如 T细胞、B细胞分泌，也可 由成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成骨细胞等非淋巴细胞分泌。另有报道指出 [42] 肿瘤细胞本身也可以分泌部分 IL-6到循环中。循环血液中的 IL-6与其受体结合后， 可以通过激活祖细胞表面的 GP130糖蛋白在 SCF的作用下介导造血干细胞或祖细[43] 的分裂、增殖。 体外实验也已证明，IL-6可以刺激巨核细胞的分裂、增殖，以及 胞 [35] 血小板的生成。 另有研究指出，对于血小板的生成，IL-6、IL-3及 SCF等因 子主 要在巨核细胞的早期发挥作用，Kaushansky等人观察 TPO体内与促血小板生成的 细胞因子如 IL-6和 SCF单独或联合应用时对巨核细胞系的影响，研究最终发现 [44] IL-6 和 SCF联合应用时主要在祖细胞的早期阶段起作用，即促进巨核细胞系造血祖细胞 集落的形成，单独使用 TPO主要影响巨核细胞系的成熟阶段，即促进巨核细胞体积 的增大、多倍体的形成及巨核细胞表面分化抗原标志的表达，此外更明显的促进了外 [45] 周血小板的形成。McDonald 等人也指出 IL-6、SCF等细胞因子在体内外单独或联 合应用虽然可以促进血小板的生成，但是其作用均弱于促血小板生成素，因此升高的 IL-6对于骨髓巨核细胞的影响，可能是在 TPO存在的基础之上发挥作用的。 促血小板生成素即 TPO，也称巨核细胞生长因子，主要是由肝脏细胞分泌，肾 脏、脾脏也可以分泌少量，其主要功能是参与体内造血过程。 Methia等人用 TPO 寡脱氧核苷酸抗血清封闭 TPO受体时发现，体外巨核系造血祖细胞集落的形成受到 [46] 抑制，但是红系或粒-巨核系造血祖细胞集落的形成毫无影响。而体内研究则发现促 [47] 血小板生成素可同时增大巨核细胞体积和提高成熟巨核细胞的数量 。这些研究说明 TPO对血小板的生成影响较大,另一项关于小鼠的实验中指出胎肝干细胞同源重组处 理后的 TPO表达缺陷的小鼠，其血小板数目仅为正常的 15,，巨核细胞亦有减少。 25 第二部分 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 [48] 以上说明 TPO是体内对血小板作用最大的因素,但是并非唯一可以起作用的因子， 并且说明 IL-6等炎性因子对血小板参数的影响更多是通过 TPO发挥作用的。 如上所述，在肝细胞癌患者血清中 IL-6会升高，同时患者 TPO水平也会升 高， 与此同时相比于正常组织，癌组织中两种细胞因子的表达也是升高的。两种因子升高 后，一方面作用与肿瘤细胞相互作用，另一方面，升高的 IL-6和 TPO可以共同促进 骨髓巨核细胞的成熟。但是对于二者的相互作用通路或者说肿瘤患者中是否有其他因 子通过不同的信号通路介导血小板参数的改变，目前仍不清楚，将通过进一步的实验 深入探索。 26 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 结 论 结 论 本课题通过临床资料统计和实验数据分析证实了，肝细胞癌患者中血小板参数的 变化与肿瘤相关，且血小板参数的改变对于肝细胞癌的辅助诊断、预测复发、指导预 后具有一定的临床意义。同时证明了 IL-6与 TPO参与了 HCC患者中血小板参数的 改变。 27 参考文献 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 参考文献 [1]原发性肝癌诊疗(2011年版). [2] Bruix J, Sherman M, Llovet J M, et al. Clinical management of hepatocellular carcinoma. Conclusions of the Barcelona-2000 EASL conference[J]. Journal of hepatology, 2001, 35(3): 421-430. [3] Forner A, Llovet JM, Bruix J.Hepatocellular carcinoma. Lancet,2012,379:1245–1255. [4] Cho S Y, Lee A, Lee H J, et al. Mean platelet volume in Korean patients with hepatic diseases[J]. Platelets, 2012, 23(8): 648-649. [5] Cho S Y, Yang J J, You E, et al. Mean platelet volume/platelet count ratio in hepatocellular carcinoma[J]. Platelets, 2012, 24(5): 375-377. [6] Kilinçalp S, Ekiz F, Basar Ö, et al. Mean platelet volume could be possible biomarker in early diagnosis and monitoring of gastric cancer[J]. Platelets, 2013 (0): 1-3. [7] Demirkol S, Balta S, Kucuk U, et al. Mean platelet volume may indicate early diagnosed gastric cancer based on inflammation[J]. Platelets, 2013 (0): 1-2. [8] Inagaki N, Kibata K, Tamaki T, et al. Prognostic impact of the mean platelet volume/platelet count ratio in terms of survival in advanced non-small cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2014, 83(1): 97-101. [9] Karaman K, Bostanci E B, Aksoy E, et al. The predictive value of mean platelet volume in differential diagnosis of non-functional pancreatic neuroendocrine tumors from pancreatic adenocarcinomas[J]. European journal of internal medicine, 2011, 22(6): e95-e98. [10] Ma X, Wang Y, Sheng H, et al. Prognostic significance of thrombocytosis, platelet parameters and aggregation rates in epithelial ovarian cancer[J]. Obstet Gynaecol Res. 2014 Jan;40(1):178-83. [11] Kurt M, Onal I K, Sayilir A Y, et al. The role of mean platelet volume in the diagnosis of hepatocellular carcinoma in patients with chronic liver disease[J]. Hepato-gastroenterology, 2011, 59(117): 1580-1582. [12]黄宇清,张添新.血小板平均体积检测的临床意义[J].国际检验医学杂志, 2006, 27(9): 833-833. 28 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 参考文献 [13]于海丰,叶磊光,黄旭,等.血小板增多与恶性肿瘤的关系[J].实用肿瘤学杂志, 2012, 26(121): 474-476. [14]黄松音,段朝晖.原发性肝癌患者凝血与血小板功能变化的临床意义[J].中国医 药导刊, 2002, 4(6): 412-413. [15] Wang R T, Li Y, Zhu X Y, et al. Increased mean platelet volume is associated with arterial stiffness[J]. Platelets, 2011, 22(6): 447-451 [16] Yuri Gasparyan A, Ayvazyan L, P Mikhailidis D, et al. Mean platelet volume: a link between thrombosis and inflammation?[J]. Current pharmaceutical design, 2011, 17(1): 47-58. [17] Yazici S, Yazici M, Erer B, et al. The platelet indices in patients with rheumatoid arthritis: mean platelet volume reflects disease activity[J]. Platelets, 2010, 21(2): 122-125. [18] Diaz-Ricart M, Brunso L, Pino M, et al. Preanalytical treatment of EDTA-anticoagulated blood to ensure stabilization of the mean platelet volume and component measured with the ADVIA counters[J]. Thrombosis research, 2010, 126(1): e30-e35. [19] Yüksel O, Helvaci K, BaSar Ö, et al. An overlooked indicator of disease activity in ulcerative colitis: mean platelet volume[J]. Platelets, 2009, 20(4): 277-281. [20] Bruix J, Llovet J M. Prognostic prediction and treatment strategy in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2002, 35(3): 519-524. [21] Bruix J, Llovet J M. Major achievements in hepatocellular carcinoma[J]. The Lancet, 2009, 373(9664): 614-616. [22] Bruix J, Sherman M, Llovet J M, et al. Clinical management of hepatocellular carcinoma. Conclusions of the Barcelona-2000 EASL conference[J]. Journal of hepatology, 2001, 35(3): 421-430 [23] Reig M, Rimola J, Torres F, et al. Postprogression survival of patients with advanced hepatocellular carcinoma: Rationale for second‐line trial design[J]. Hepatology, 2013, 58(6): 2023-2031. [24]李立辉,李光.恶性肿瘤患者血小板聚集功能的测定 [J].实用医技杂志, 2008, 15(27): 3693-3694. [25] Afdhal N, McHutchison J, Brown R, et al. Thrombocytopenia associated with chronic liver disease[J]. Journal of hepatology, 2008, 48(6): 1000-1007. [26] Ishibashi T, Kimura H, Uchida T, et al. Human interleukin 6 is a direct promoter of 29 参考文献 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 maturation of megakaryocytes in vitro[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1989, 86(15): 5953-5957. [27] Ataseven H, Bahcecioglu IH, Kuzu N, et al. The levels of ghrelin,leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators Inflamm ,2006; 2006:78380. [28] Dufour J F. C‐reactive protein, a prognostic marker in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2013, 57(6): 2103-2105. [29] Porta C, De Amici M, Quaglini S, et al. Circulating interleukin-6 as a tumor marker for hepatocellular carcinoma[J]. Annals of oncology, 2008, 19(2): 353-358. [30] Wong V W S, Yu J, Cheng A S L, et al. High serum interleukin‐6 level predicts future hepatocellular carcinoma development in patients with chronic hepatitis B[J]. International journal of cancer, 2009, 124(12): 2766-2770. [31] Giannitrapani L, Cervello M, Soresi M, et al. Circulating IL‐6 and sIL‐6R in Patients with Hepatocellular Carcinoma[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2002, 963(1): 46-52. [32] Burstein S A, Erb S K, Adamson J W, et al. Immunologic stimulation of early murine hematopoiesis and its abrogation by cyclosporin A[J]. Blood, 1982, 59(4): 851-856. [33] Hitchcock I S, Kaushansky K. Thrombopoietin from beginning to end[J]. British journal of haematology, 2014, 165(2): 259-268. [34] Erickson-Miller C L, Chadderton A, Gibbard A, et al. Thrombopoietin receptor levels in tumor cell lines and primary tumors[J]. Journal of oncology, 2010, 2010. [35] Kaushansky, Kenneth, et al. "Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin." (1994): 568-571. [36] Kaser A, Brandacher G, Steurer W, et al. Interleukin-6 stimulates thrombopoiesis through thrombopoietin: role in inflammatory thrombocytosis[J]. Blood, 2001, 98(9): 2720-2725. [37] DeBruyn C, Delforge A, Martiat P, et al. Ex-vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood[J]. Stem Cells Dev, 2005, 14(4): 4l5—424. [38 ] Kim D A, Kim T Y. Controversies over the interpretation of changes of mean platelet volume in rheumatoid arthritis[J]. Platelets, 2011, 22(1): 77-78. [39] Gunluoglu G, Yazar E E, Veske N S, et al. Mean platelet volume as an inflammation 30 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 参考文献 marker in active pulmonary tuberculosis[J]. Multidisciplinary respiratory medicine, 2014, 9(1): 11. [40] Mermer T, Terek M C, Zeybek B, et al. Thrombopoietin: a novel candidate tumor marker for the diagnosis of ovarian cancer[J]. Journal of gynecologic oncology, 2012, 23(2): 86-90. [41]尚立新，宋海波，姜彦多等.瘦素与 TNF-α在妊高征胎盘中的表达及相关性研究[J]. 中国优生与遗传杂志，2004，12(5):73—75. [42]Flower L, Gray R, Pinkney J, et a1. Stimulation of interleukin-6 release by interleukin-l beta from isolated human adipocytes[J]. Cytokine,2003,21:32-37. [43] Sui X, TsuJI K, Tanaka R, et al. gp130 and c-Kit signalings synergize for ex vivo expansion of human primitive hemopoietic progenitor cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1995, 92(7): 2859-2863. [44] Kaushansky, Kenneth, et al. "Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin." (1994): 568-571. [45] Metcalf D. Blood. Thrombopoietin--at last[J]. Nature, 1994, 369(6481): 519. [46] Methia N, Louache F, Vainchenker W, et al. Oligodeoxynucleotides antisense to the proto-oncogene c-mpl specifically inhibit in vitro megakaryocytopoiesis[J]. Blood, 1993, 82(5): 1395-1401. [47] McDonald TP, Kalmaz GK.Effects of thrombopoietin on the number and diameler of marrow megakaryocytes of mice.Exp Hematol.1983,11:91. [48] GUlney AL, Carver-Moore K, de Sauvage FJ, et al. Thromboeytopenia in c-ra pt-deficient mice. Sci-cilce 1994，265:l445. 31 综述 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 综述肝细胞癌与血小板相关性的研究进展 【摘要】近年研究发现血小板不仅参与肝细胞癌发生、发展 ,并且在预后及预测复 发中也占有相当的价值，而且经实验证实抗血小板治疗可以有效预防肝细胞癌的形 成，延长患者的总生存期。同时发现肝癌细胞可以通过自身分泌或诱导作用影响血小 板的发生及形态,进而影响血小板的分布及功能,促进肿瘤细胞自身的发展。本文就肝 细胞癌与血小板相关性的研究进行综述。 Abstract:In recent years, studies have showed that platelets not only involved in the growth and development of hepatocellular carcinoma, and also have a considerable value in the prognosis and prediction of recurrence, and it is also confirmed by the experimental that antiplatelet therapy can effectively prevent the formation of hepatocellular carcinoma (HCC), prolong the patient's overall survival. At the same time we have found that tumor cellular can influence the morphology ,distribution and function of platelet by secretion and induce function, promote the development of tumor cells themselves.This article reviews the relationship between hepatocellular carcinoma and platelet. 【关键词】肝细胞癌;血小板;诊断及预后; 血小板参数应用于临床已有几十年历史，多用于血液系统及凝血相关的检查中， 极少用于其它疾病的诊断中。自 1958年 Wood发现了血小板在肿瘤转移中的作用后， 血小板与肿瘤关系的研究一直受到重视，随着研究的不断深入，血小板与肿瘤的相互 作用正不断被认识,在肝细胞癌(HCC)的中的应用价值也不断被提高。人们发现血 小板不仅参与肝硬化到肝细胞癌的发生，自身还可以分泌血管内皮生长因子及血小板 源性转化生长因子等，刺激肝癌细胞的生长，同时肝细胞癌也会影响血小板计数及平 均体积等相关参数，有研究认为血小板参数在肝细胞癌的早期改变，对于其早期诊断 及预测预后具有重要价值，本文就近年来血小板在肝细胞癌发生发展、诊断、转移及 预后中的作用及意义加以综述。 32 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 综述 1.血小板参数在肝细胞癌的诊断中的意义 近年来临床研究指出，血小板参数特别是平均血小板体积在胃癌、胰腺癌患 [1] [2] 者中高于正常对照组，并且对于胃癌和胰腺癌的早期诊断有所帮助，在一项肝细胞癌 的研究中也指出，血小板平均体积(MPV)在肝细胞癌患者组高于肝炎组、肝硬化及正 常对照组，血小板计数(PLT)低于肝炎及正常对照组，高于单纯肝硬化组，提示肝细 胞癌可能影响了血小板参数，并且该研究认为血小板参数在肝细胞癌中的早期变化， 可以作为一种有用的指标协助肝细胞癌的早期诊断。对于血小板参数的改变，目前 [3] 倾向于认为与肝细胞癌相关的 IL-6的影响有关，临床也有研究发现在 HCC合并肝硬 [4] 化者比单纯肝硬化者具有更高的 IL-6水平，另有研究指出肝细胞癌患者中 [5] 其受体相比于比健康对照组、慢性肝炎组、肝硬化组患者组都要高 IL-6及 [6] ，此外 Wong等 进一步的研究已经证实血清中升高的 IL-6协同 IL-3、IL-11和干细胞生成因子能够也发现血清中高水平的 IL-6与乙型肝炎相关的肝细胞癌的发生密切相关。与此同时 刺 激骨髓巨核细胞系的大量扩增和过早成熟，使新生成的血小板计数(PLT)升高，平 均血小板体积(MPV)增大。 2.血小板参与肝细胞癌的发生发展 血小板参与肝硬化到肝细胞癌的发展过程。现阶段的研究认为肝细胞癌的发生与 慢性炎症关系密切，HCC往往在病毒感染几十年后发生，这表明 HBV不是急性致癌， 而是慢些损伤，几乎所有肝癌的发生都是经过多年免疫介导的慢性肝炎过程。肝炎病 毒性感染的患者不能有效的从肝脏清除相关病元体，但是却维持了低水平的肝细胞损 伤，在肝功能修复过程中不断的坏死，再生，和炎症这一周期循环，被认为引发了随 机的基因和染色体的改变，最终导致 HCC的发生。而血小板被认为是参与这一炎症 过程的重要因子，先前在小鼠自限性病毒性肝炎模型的研究表明血小板能够通过促进 病毒-特异性 CD8+T细胞，其次是病毒非特异性炎症细胞的肝内聚集介导肝脏的急性 损伤，同时我们发现在小鼠的急性病毒性肝炎模型中，血小板的消耗可以减少病毒 [7] 特异性的细胞毒性 T淋巴细胞的肝内聚集和器官的损伤。输入可以活化的血小板后， 在血小板耗尽的小鼠中可以恢复杀伤性 T淋巴细胞(CTLS)的积累和肝脏疾病的损 伤程度。此外，在免疫介导的慢性病毒性肝炎(CHB)小鼠模型的观察中发现在肝 [8] 坏死性炎症灶和肝梗灶内出现了小的血小板聚集。对于血小板与 CD8+T细胞的作用 33 综述 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 机制，目前主要基于两种假说，一种假说认为，肝内初始炎症反应导致血管壁的变化， 促进血小板粘附，血小板活化，并激活相关的事件，促使病毒特异性 CD8+T细胞进 入肝实质，导致了致病作用。另一个假说认为，活化的血小板可能直接促进 CD8+T 细胞的分裂。因此认为血小板不仅参与了肝脏慢性炎症过程，同时也是促发 HCC 的重要因素。 [9] 除此以外，血小板也可以通过自身分泌的生长因子参与肝细胞癌的生长，目前研 究较多的包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，血小板衍生 生长因子(PDGF)，转化生长因子等。另有研究发现肝细胞癌患者血小板中要比正常 人群和肝硬化病人中脑源性神经营养因子(BDNF)因子高。BDNF是一种新型的功 能蛋白，它可以促进大鼠 HCC模型中肿瘤细胞的生长。相比于肝炎、肝硬化或正常 [10] 肝组织中，BDNF mRNA在 HCC肿瘤组织中过表。 达 3.肝细胞癌复发或再发中血小板的诊断价值 肝细胞癌术后的复发或再发几乎是一定的，一般来说，术后 2年内，有 70%患 者 属于复发，30%患者属于再发，2年以后有 70%患者属于再发。影响肝细胞癌复发或 再发的因素较多，如肝癌细胞的侵袭性、切除时肿瘤包膜的完整性、是否癌栓形成， 乙肝病毒控制情况、免疫系统损伤或精神的巨大打击等等。对于肝癌复发或再发，没 有有效的手段控制，目前可以做到的就是术后定期复查，早期发现，早期处理。现阶 段用于肝细胞癌术后复发或再发的检测办法主要依靠影像学及 AFP，但是鉴于术后肝 内结构的改变及肝硬化结节影响，特别是复发灶较小时给诊断到来困难，同时由于 AFP的敏感性和特异性的影响，诊断比较困难，可能会错过病人治疗的最佳时间，势 必会对病人的预后带来比较严重的影响。因此，近年来许多学者都致力于寻找一种敏 感性和特异性更高，或者可以更早提示肿瘤形成的指标。 近年研究发现肝细胞癌患者手术前后血小板参数变化具有一定的规律性，对于肝 细胞癌的复发或再发同样具有参考价值。研究发现在胃癌患者中，血小板参数相对于 正常人群会升高，胃癌患者术后，血小板参数与正常对照组相比无差异，提示胃癌 [1] 与血小板参数具有相关性，在我们的研究中发现，肝细胞癌复发或再发患者中，MPV 会比术后升高，即肝细胞癌患者中血小板平均体积与血小板计数会高于单纯肝硬化患 [11] 者 ，术后 MPV恢复正常，再发或复发后再度升高。现在的观点认为血小板变化是 34 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 综述 在肿瘤炎症的基础之上，因此血小板参数的改变在肿瘤早期形成阶段就可能会显现出 来，这样看来血小板参数的改变将会早于其他指标。血小板参数易于测量和监测，如 果该项研究成立，那么血小板参数可以对肝细胞癌的诊断以及复发或再发的早期阶段 提供更多、更早的参考。 如前所述，VEGF及 PDGF在肿瘤复发中也会升高，并且研究还发现早期复发患 [12] 者(2年内)VEGF和或 PDGF水平明显高于 。提示可以通过对血 2年后复发患者 小板内的 VEGF或 PDGF进行监测，预测肿瘤复发或再发的时间，但是测量复杂， 不适宜于进行监测，所见研究价值相对较低。 4.血小板参与肝细胞癌的转移过程 [13] 研究显示血小板可以促进肿瘤细胞的转移 。肿瘤细胞释放到循环血液中后，在 24小时内就会因血液流动产生的剪切力或被机体免疫细胞破坏清除，仅有不到 0.1% 的肿瘤细胞可以存活。覆盖有血小板的肿瘤细胞栓可以逃避宿主免疫监视，及血管 [14] 中剪切力的损伤，进一步促进肿瘤细胞的迁移。目前已经发现多种与肝细胞癌转移相 关的因子，各因子的分泌与释放与 ―肝细胞癌诱导的血小板聚集密切相关 ‖(tumour cell—induced platelet aggregation，TCIPA)‖，肝癌细胞可以通过旁分泌或远距分泌， 诱导血小板在肿瘤细胞周围的聚集，以利于肿瘤细胞的血行转移，肝细胞癌患者中血 [15] 小板的粘附率级聚集率明显高于肝硬化组支持了这一观点。该过程中有多种因子参， 首先肿瘤细胞会刺激血小板产生 ADP、血栓素 A并诱导聚集 ;丝氨酸蛋白酶如凝 血酶、半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶也参与 TICPA过程;一些黏附因子及其受 体也与此过程有关，如血小板中 GPIb-LX-V，GPIIb,IIIa和 P-selectin。 [16] 最新研究还发现肿瘤细胞自身可以分泌一种血小板聚集诱导因子-Aggrus 。Aggrus， 又名 podoplanin，在多种类型的肿瘤表达上调，它可以通过与表达于血小板表面的 CLEC-2结合诱导血小板聚集提高血行转移，而且研究发现单纯抑制 Aggrus-CLEC-2 之间的作用能够抑制肿瘤周围血小板的侵润和肿瘤的生长 ,但不会影响正生理性止血 过程。 [17] 35 综述 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 5.血小板在肿瘤预后评价中的意义 几项研究显示，低血小板计数对于肝炎后肝细胞癌的发生、治疗，包括肝切除术 后 HCC患者的生存率和复发都是一个危险因素。在一项多因素研究分析中发现，血 小板计数是肝细胞癌行手术切除后的独立预后因素，当血小板数目明显低于 100x109/L时，患者术后并发症明显升高，死亡率显著高于对照组。在另一项研究 [18] 中指出符合 MC标准血小板计数低于 100x109/L的 HCC患者术后复发率高于血小板 计数?100x109/L的患者。血小板计数?100x109/L的患者复发后行手术再切除或 RFA [19] 因素，而术前血小板计数可用于去评估肝细胞癌切除术后的复发率及死亡率。 治疗率高于对照组。因此有专家认为 ICGR15可以做为术前肿瘤可切除性的主要决定 血小板在预后中的意义，考虑主要与门脉高压的严重性相关，它可以间接反映脾 亢及肝硬化的程度，因此可以用血小板计数量化门脉高压性脾亢，参与评估肝功能。 6.癌抗血小板治疗在肝细胞中研究进展 流行病学实验已经证实，长期服用抗血小板药物，可以有效的预防或延迟乙肝病 毒相关的肝细胞癌的形成，以及患者的无瘤生存时间和总生存时间。动物实验也表 [20] 明，在慢性肝炎一开始，连续服用临床有效剂量的抗血小板药物，可以抑制或延缓肝 癌的形成，大大改善 HBV转基因小鼠的整体存活率。目前认为该过程是阻断了血小 板介导的肝内病毒-特异性 CD8+T细胞和病毒非特异性炎症细胞的肝内聚集，减少了 肝脏损伤和肝脏再生，以及肝脏纤维化程度进而抑制或延缓了 HCC的发生。我们发 现活化的血小板通过 TX-A2和 ADP介导的炎症过程诱导免疫细胞特别是病毒特异性 的 CD8+T细胞在肝内的持续聚集发挥作用，抗血小板药物可以阻断上述通路，如阿 司匹林通过对 COX-1和 COX-2的抑制作用，减少 TX-A2的产生，氯吡格雷通过阻 止 P2Y12 ADP受体，发挥了抑制免疫细胞聚集、抗炎作用，从而抑制或减少了炎症 修复过程中基因和染色体的随机突变，最终抑制或延缓了 HCC的发生、发展。同时 我们发现对于暴露于慢性化学性毒物诱导的非免疫相关的肝癌，抗血小板药物没有抗 肿瘤作用。这个前所未有的观察证实，血小板可能是 HBV相关的肝癌发生机制中的 关键因子。同时进一步证明了免疫介导的炎症反应是慢性肝病肝细胞转化的一个重要 原因。 36 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 综述 小结: 血小板参与肝细胞癌生长及转移微环境的组成，肝癌细胞也会反作用于血小板参 数，二者具有一定的相关性，并且研究发现在肝细胞癌患者中血小板参数不仅可以为 肝细胞癌的早期诊断提供一些必要的参考，并且可以预测肝细胞癌的预后，目前临床 在该方面的研究相对较少，而且对于肝细胞癌患者中，血小板参数的改变的机制，目 前仍未有明确阐述，目前的研究认为是 IL-6等炎性因子的作用，因为已有研究证实 IL-6、IL-3或 11等炎性因子可以刺激骨髓巨核细胞系的增生和分裂，但是今年的研 究也发现 IL-6与 TPO在肝细胞癌中血小板参数的改变中均具有意义。研究发现 TPO 在肝细胞癌中表达升高，且更有研究认为血清中升高的 IL-6一方面可以直接作用与 骨髓，另一方面可以通过促进 TPO的表达间接作用于骨髓巨核细胞，对于二者的具 体机制仍未有明确阐述。这将在今后的研究中进一步阐述，包括肝炎的影响， TPO 在肝脏手术前后的变化或组织中 TPO表达水平的影响等，因此对于血小板参数改变 的机制及所参与因子的种类有待将来更多的研究去阐述。 37 综述 肝细胞癌中血小板参数改变的临床意义及其机制研究 参考文献 [1] Kilinçalp S, Ekiz F, Basar Ö, et al. Mean platelet volume could be possible biomarker in early diagnosis and monitoring of gastric cancer[J]. Platelets, 2013 (0): 1-3. [2] Karaman K, Bostanci E B, Aksoy E, et al. The predictive value of mean platelet volume in differential diagnosis of non-functional pancreatic neuroendocrine tumors from pancreatic adenocarcinomas[J]. European journal of internal medicine, 2011, 22(6): e95-e98. [3] Kurt M, Onal I K, Sayilir A Y, et al. The role of mean platelet volume in the diagnosis of hepatocellular carcinoma in patients with chronic liver disease[J]. Hepato-gastroenterology, 2011, 59(117): 1580-1582. [4] Porta C, De Amici M, Quaglini S, et al. Circulating interleukin-6 as a tumor marker for hepatocellular carcinoma[J]. Annals of oncology, 2008, 19(2): 353-358. [5] Soresi M, Giannitrapani L, D‘Antona F, et al. Interleukin-6 and its soluble receptor in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(16): 2563-2568. [6] Wong V W S, Yu J, Cheng A S L, et al. High serum interleukin‐6 level predicts future hepatocellular carcinoma development in patients with chronic hepatitis B[J]. International journal of cancer, 2009, 124(12): 2766-2770. [7] Guidotti L G, Chisari F V. Immunobiology and pathogenesis of viral hepatitis[J]. Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis., 2006, 1: 23-61.. [8] Iannacone M, Sitia G, Isogawa M, et al. Platelets mediate cytotoxic T lymphocyte–induced liver damage[J]. Nature medicine, 2005, 11(11): 1167-1169 [9] Sitia G, Aiolfi R, Di Lucia P, et al. Antiplatelet therapy prevents hepatocellular carcinoma and improves survival in a mouse model of chronic hepatitis B[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(32): E2165-E2172. [10] Yang Z F, Ho D W, Lam C T, et al. Identification of brain-derived neurotrophic factor as a novel functional protein in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer research, 2005, 65(1): 219-225. [11] Cho S Y, Lee A, Lee H J, et al. Mean platelet volume in Korean patients with hepatic diseases[J]. Platelets, 2012, 23(8): 648-649. [12] Hu J, Xu Y, Shen Z Z, et al. High expressions of vascular endothelial growth factor and platelet-derived endothelial cell growth factor predict poor prognosis in 38