核转录因子

核转录因子 第四军医大学 硕士学位核转录因子-κB、波形蛋白在桥本氏甲状腺炎中的表达 及其相 关性研究 姓名:王頔 申请学位级别:硕士 专业:病理学与病理生理学 指 导教师:黄高升 20070501 第四军医大学硕士学位论文 核转录因子-κB、波形蛋白 在桥本氏甲状腺炎中 的表达及其相关性研究 硕士研究生 王 頔 导 师 黄高升 教 授 第四军医大学病理学教研室，西安 710032 中文摘要 桥本氏甲状腺炎 (Hashimoto’s thyroiditis，HT)，又称桥本氏病、慢性淋巴细胞性甲状腺炎，或淋 巴结样甲状腺肿，由日本学者桥本策先生于1912年首先报道并描述。HT是世界范围 内广泛存在的器官特异性自身免疫性疾病之一。本病有家族聚集现象，且女性多发。 其病理特征主要为淋巴细胞浸润、滤泡上皮细胞破坏和间质纤维化。随着疾病的发 展，甲状腺上皮细胞不断出现损伤、修复性改变和间质纤维组织增生。 波形蛋白是 一种中间丝蛋白，通常表达于间叶组织及双向分化的细胞胞浆中。正常情况下，上 皮细胞一般不表达Vimentin。近年来，有个别研究报道在人正常甲状腺上皮细胞以 及桥本氏甲状腺炎滤泡上皮细胞中检测到Vimentin的表达，但所研究病例数很少。 甲状腺上皮细胞是否存在Vimentin的表达以及随着HT进展，是否伴有甲状腺上皮细 胞波形蛋白Vimentin的表达增加，尚未见文献报道。核因子-κB NF-κB是一种具有多 向性转录调节作用的核蛋白因子，广泛参与多种基因特别是免疫炎症反应相关基因 的表达调控，2 第四军医大学硕士学位论文在机体炎症反应过程中发挥着重要作用。 目前国内外对NF-κB和甲状腺癌的发病机制研究较多，但是，有关NF-κB与桥本氏 甲状腺炎关系的研究、NF-κB与Vimentin基因表达的关系以及甲状腺上皮细胞发生 上皮-间叶转化的机制尚未见明确报道。 在此，本实验采用免疫组织化学，检 测Vimentin及NF-κB在28例HT及9例正常甲状腺组织中的表达，并从免疫组化二者均 阳性的17例HT标本中，选择3例作免疫荧光双标记染色，结合激光共聚焦显微镜观 察CK8和Vimentin，NF-κB和Vimentin的共表达情况。结果表明，在正常甲状腺 组织及HT的滤泡上皮细胞中，均可见细胞角蛋白CK8的阳性表达。统计学分析， Vimentin阳性细胞百分数在HT组(68.9?39.87,)和正常甲状腺组(22.4?34.63,) 中有显著性差异 P ,0.004，表明HT滤泡上皮存在Vimentin表达的明显增强。NF-κB 在HT组和正常甲状腺组的阳性表达率分别为64.29,(18/28)和11.11,(1/9)，两 者有显著性差异 P ,0.008。相关性分析结果表明，NF-κB的阳性表达与Vimentin的阳性表达呈正相关r0.662， P lt0.01。免疫荧光双标记及激光共聚焦显微镜观察发 现，CK8和Vimentin、NF-κB和Vimentin共定位于HT滤泡上皮细胞胞浆中。我们的 结果提示在HT中，甲状腺滤泡上皮细胞存在上皮,间叶表型转化，而这种上皮,间 叶表型转化可能与NF-κB表达增加相关。 综上所述，本实验研究了Vimentin、NF-κB 分别在HT和正常甲状腺组织中的表达，以及这两种蛋白表达之间的关系;探讨了 NF-κB在HT发病中可能的作用，为继续研究HT的发病机制提供了新的线索。关键词: 桥本氏甲状腺炎;波形蛋白;核转录因子-κB;免疫荧光双标记; 激光共聚焦显微 镜;上皮间叶转化3 第四军医大学硕士学位论文Expression of Nuclear Transcription Factor κB and Vimentinin Hashimoto’s thyroiditis and their correlation Candidate for master degree: Di Wang Supervisor: GaoSheng Huang Department of Pathology Fourth Military Medical University Xi’an 710032 China Abstract Hashimoto’s thyroiditis HT also called chronic lymphocytic thyroiditis orlymphomatoid goiter is one of the organ-specific autoimmune diseases in theworld. It was firstly reported by Hashimoto in Japan in 1912. HT has familyaggregation and a high prevalence among middle-aged females. Pathologicallythis disease is characterized by lymphocyte infiltration follicular epithelial cellsdestruction and interstitial fibrosis. With the progression of the disease the thyroidepithelium will experience damage repair and fibrosis continuously. Vimentin is a member of intermediate filament family and it is usuallyexpressed in mesenchymal tissues or bidirectional differentiatied cell cytoplasm.Normally Vimentin is expressed rarely in epithelial cells. In recent years severalresearch groups report that expression of Vimentin can be found in normalepithelium of thyroid and HT but the number of the case is very small in theirstudy. Little is known about the expression of vimentin in thyroid epithelium andits increased expression with the pathogenesis of HT. NF-κB is a kind of nucleicprotein factor with its pleiotropia transcription regulation. It is involved in the4 第 四军医大学硕士学位论文expression and regulation of many genes expecially in genes related immune andinflammatory reactions and plays an important role in human inflammatoryreactions. Many data have shown the role of NF-κB in the pathogenesis of thyroidcarcinomas however there is no report about the expression of NF-κB inHashimoto’s Thyroiditis the correlation of NF-κB and Vimentin and themechanism of epithelial-mesenchymal transformation(EMT)in thyroidepithelium. In this study Vimentin and NF-kB were detected by immunohistochemistryIHC staining in 28 HT specimens and 9 normal thyroid specimens. 3 specimensexpressed both Vimentin and NF-kB were selected for immunofluorescence IFdouble-staining assay. The co-expressions of CK8 and Vimentin NF-kB andVimentin were observed by confocal laser scanning microscope. The resultsshowed that the mean positive rates of Vimentin in the two groups were68.9?39.87 and 22.4?34.63 respectively and there exists a significantdifference statistically P 0.004. The positive rates of NF-κB in the HT groupand the control group were 64.29 18/28 and 11.11 1/9 respectively with asignificant difference statistically P0.008. The expression of Vimentin wasclosely related to that of NF-κB Spearman correlation r0.662 P ,0.01. IFdouble-staining assays showed that CK8 and Vimentin and Vimentin and NF-κBco-existed in the cytoplasm of epithelial cells in the HT. We demonstrated that thefollicular epithelial cells exist epithelial-mesenchymal transformation EMT inHT and it may be attributable to the increased expression of NF-κB. In summary we investigated the expressions of NF-κB and Vimentin both inHT and normal thyroid and their possible relationship explored that NF-κB 5 第四军医大学硕士学位论文might play a role in the pathogenesis of HT.Keywords: Hashimoto’s thyroiditis HT Vimentin NF-κBimmunofluorenscence double-staining confocal laser scanning microscopyEpithelial-mesenchymal transformation EMT6 第四军医大学硕士学位论文 前言和文献回顾1 前言 桥本氏 甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)，又称为桥本氏病、慢性淋巴细胞性甲状 腺炎或淋巴结样甲状腺肿，因日本学者桥本策先生于1912年首先报道而得名，是一 种主要累及甲状腺的自身免疫性疾病，有家族聚集现象，且女性多发1-3。其病理学 特征主要为淋巴细胞浸润、滤泡上皮细胞破坏，间质纤维化4。该病表现复杂，可合 并甲状腺癌或恶性淋巴瘤356，近年来，本病的发病率有上升趋势。HT是一种常见 的器官特异性自身免疫性疾病，可能是在遗传易感性的基础上，出现先天性免疫监 视缺陷，造成免疫功能紊乱，产生针对甲状腺的体液免疫和细胞免疫反应，使甲状 腺滤泡上皮细胞破坏，并且自身免疫反应的强度与病情密切相关。但到目前为止， 其发病机制尚未阐明。 曾有研究表明在人类正常甲状腺上皮细胞以及桥本氏甲状腺 炎上皮细胞中波形蛋白有一定表达，但所研究的病例数很少7。迄今为止，甲状腺滤泡上皮细胞中是否存在Vimentin的表达以及HT中Vimentin的表达是否增加并无明确结论。 在此，我们回顾了HT的病因学和发病机制的研究进展，以及上皮细胞间叶转化的机制，研究了Vimentin在甲状腺滤泡上皮细胞中的表达，分析了核转录因子-κB与Vimentin表达的关系，并进一步探讨了核转录因子-κB在HT发生机理中的可能作用，为进一步研究HT的发病机制打下了基础。7 第四军医大学硕士学位论文2 文献回顾2.1 HT及其病因学、发病机制研究进展2.1.1 HT 桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)，又称桥本氏病、慢性淋巴细胞性甲状腺炎或淋巴结样甲状腺肿，是一种器官特异性自身免疫性疾病，为甲状腺炎中最常见的类型。1912年，日本学者Hashimoto首先在德国医学杂志上描述了患有慢性甲状腺疾病的4个病人，并命名为淋巴性甲状腺肿。这些病人的甲状腺呈弥漫性淋巴细胞浸润，纤维化，间质萎缩及腺泡细胞的嗜酸性改变。通常表现为年轻或中年女性的无瘤性弥漫性甲状腺增大，并常伴有甲状腺机能低下。多年来一直认为该病较少见，但随着细针穿刺细胞学检查和血清抗体水平测定的运用，发现了更多病人，目前认为是一种较为常见的甲状腺疾病。 HT的组织病理学特征主要是甲状腺对称性肿大，大体标本组织呈粉红色至深黄色，质地硬而有弹性，表面稍有分叶与周围甲状腺组织无粘连。显微镜下呈弥漫性淋巴细胞浸润及纤维化。常见甲状腺上皮细胞增大，胞浆呈嗜酸性染色，这种细胞被称为Hürthles或Askanary细胞并富含线粒体4。滤泡缩小，胶质缺如或浓集散在分布。实质的淋巴细胞浸润常伴有生发中心形成，易见浆细胞。随着病变发展纤维化可从无到有。异物巨细胞和肉芽组织在HT中不出现，基底膜可见高密度物质沉积。典型病例中，累及整个腺叶或腺体，与甲状腺肿瘤或多结节甲状腺肿以及弥漫性甲状腺增生的Graves病中局部甲状腺炎不同。 HT血清免疫学的特点是γ-球蛋白可升高。这一现象反映了高浓度循环抗TG甲状腺球蛋白抗体出现。TGAB抗甲状腺球蛋白抗体或MCAB(抗微粒体抗原抗体)可在血清中出现，当滴度?2500时可诊断HT4。80,的病人可8 第四军医大学硕士学位论文测得TGAB、97,MCAB试验阳性4。年轻病人典型HT可出现低滴度抗体。许多年轻病人TGAB试验阴性，但绝大多数MCAB试验阳性。血清抗TPO甲状腺过氧化物酶抗体以20IU/ml为正常上限。HT和Graves病人高度阳性而甲状腺肿、甲状腺癌、SLE系统性红斑狼疮、RA类风湿性关节炎低滴度阳性89。通过比较正常人与HT患者血清抗TPO-IgG亚型发现，患者IgG1为主，而正常人以IgG4为主10。通过研究甲状腺损害与TAA甲状腺自体抗体和尿碘关系发现甲低更常见于TAA 阴性合并尿碘高度阳性患者中11。 从临床上看，在北美，该病被认为是原发性甲状腺功能减退最常见原因，患病率女性多于男性。发病率随着年龄而增加，甲状腺病家族史多见，有染色体病的病人发生率增加。大多数HT患者缺乏临床症状，起病隐匿，发展缓慢，病程较长，早期可无症状，出现甲状腺肿时病程可达2,4年。典型的临床表现为中年妇女(90,以上发生于女性)甲状腺呈弥漫性、无痛或轻度疼痛，轻度或中度肿大，一般呈对称性，但有时仅累及一侧腺体，表面不规则，也可呈结节性肿大。甲状腺质地韧如橡皮是本病特征之一。一般与周围组织无粘连，吞咽时可上下移动。患者常有全身乏力，10,,20,的患者有颈部压迫感或甲状腺隐痛，极少有喉返神经受压症状。甲状腺功能一般正常。随着甲状腺组织逐步被破坏，甲状腺可逐步缩小。多数患者表现为甲状腺机能减退，全身乏力，有非指凹性浮肿，腹胀，尿少，动作迟缓，不 爱讲话，对答反应慢，心率多在60分/次以下，声音嘶哑，皮肤粗厚，脱屑。大部分患者常有咽部不适，少数可出现心脏扩大，心包积液，或有冠心病表现。 大多数HT患者实验室检查血清T3、T4 、FT3、FT4一般正常或偏低，即使有甲状腺机能亢进症状者，其血清T3、T4水平也常正常。血清TSH浓度反映患者的代谢状态。一般甲状腺功能正常时TSH正常，甲状腺功能减退时则升高，但有些血清T3、T4正常患者的TSH也升高，可能是由于甲状腺功能不 9 第四军医大学硕士学位论文全，代偿性TSH升高，以维持正常甲状腺功能。甲状腺摄碘率检查根据病程不同而异，早期可正常，少数可升高，但到后期都明显下降。 影像学检查目前采用的有B超、CT、MRI。主要是了解甲状腺形态、大小及放射性碘的分布。细针抽吸活组织检查FNA是诊断HT简便有效、确诊率最高的方法，与术后病检对比符合率达95,以上，可代替同位素扫描。2.1.2 HT的病因及发病机制研究 HT的病因与发病机制至今尚未明了。目前认为是由环境因素与遗传因素共同作用而产生的自身免疫应答，通过改变甲状腺特异性的自身反应性T细胞的调节作用而引发HT的1。由于先天性免疫监视缺陷，特异的抑制性T淋巴细胞数量和质量异常，导致以自身甲状腺组织为抗原，最终由自身免疫因子引起的腺体淋巴细胞浸润的慢性甲状腺发炎。环境因素多为感染和膳食中的碘化物。HT常在同一家族的几代人中发生，有家族聚集现象，且女性多发，表现为多因素遗传1-3。 有报道汉族HT病人的HLA-DQAI和DQBI位点等位基因多态性检测，结果DQAI0301的等位基因频率明显高于正常对照;DQBI0602的等位基因频率明显低于正常对照，表明甲状腺自身抗体的产生与常染色体显性遗传有关12。此外，肠道细菌感染，以及碘缺乏或富含碘地区，HT发病率均升高。也有报道HT与甲状腺细胞的促凋亡蛋白-Fas表达增加相关。 HT的发生有显著的人种差异13，且碘丰富地区甲状腺机能减退与碘摄取量有关，碘摄取过量人群中甲状腺机能减退较为常见。因此，过量碘摄取被看作HT合并甲状腺机能减退的病因之一14。而慢性甲状腺炎是引起无症状性甲状腺肿和甲状腺机能减退的最常见病因15。有学者发现血浆γ球蛋白在本病病人血中升高，从而首先提出可能与免疫有关4。用兔甲状腺浸膏免疫的家免可产生与人HT相似的甲状腺组织学改变，并发现动物血内有抗甲状腺球蛋 10 第四军医大学硕士学位论文白抗体4。将正常人甲状腺浸膏放至在HT病人的血清中会产生沉淀，表明血清中存在人甲状腺某种成分的抗体并与本病发生有关4。尚有报道患有丙型肝炎的病人长期干扰素治疗后出现甲状腺炎16。国外报道l2例产后甲状腺炎病人血T-辅助细胞和滤泡细胞上HLA,DR 表达增多17。这些发现为本病自身免疫的理论提供了依据。2.2 Vimentin与EMT的产生2.2.1 Vimentin 中间丝(intermediate filaments，IF)直径10nm左右，介于微丝和微管之间。与微管不同的是中间丝是最稳定的细胞骨架成分，它主要起支撑作用。中间丝在细胞中围绕着细胞核分布，成束成网，并扩展到细胞质膜，与质膜相连结。IF是一类形态上非常相似，而化学组成上有明显差异的蛋白质，成分比微丝和微管都复杂，可根据组织来源的免疫原性分为5类:角蛋白(keratin)、结蛋白(desmin)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicproteinGAFP)、波形蛋白(Vimentin)和神经纤丝蛋白neurofilament protein。此外，细胞核中的核纤肽(lamin)也是一种中间丝。 中间丝具有组织特异性，不同类型细胞含有不同的中间丝蛋白质。肿瘤细胞转移后仍保留起源细胞的中间丝，因此可用中间丝抗体来鉴定肿瘤的来源。如乳腺癌和胃肠道癌，含有角蛋白，因此可断定它来源于上皮组织。大多数细胞中含有一种中间丝，但也 有少数细胞含有2种以上，如骨骼肌细胞含有结蛋白和波形蛋白。 Vimentin是中间丝蛋白中的一种，分子量约53KD，广泛存在于间充质细胞及中胚层来源的细胞中。波形蛋白一端与核膜相连，另一端与细胞表面处的桥粒或半桥粒相连，将细胞核和细胞器维持在特定的空间。其主要在正常或肿瘤性间叶组织细胞中表达，在上皮细胞中一般不表达，故大多认为是一11 第四军医大学硕士学位论文种间叶成分特异性标记物。以前有学者研究表明在甲状腺癌中Vimentin和CK蛋白可以共表达，但是在正常甲状腺、甲状腺肿以及慢性甲状腺炎中的甲状腺滤泡上皮细胞中未发现Vimentin的表达18。十分有限的研究资料表明:Vimentin在人类正常甲状腺上皮细胞以及HT上皮细胞可有一定表达，但所研究的病例数很少(桥本氏甲状腺炎组2例，正常组3例)7，因此，对HT甲状腺滤泡上皮中是否存在Vimentin的表达增加未能得出明确结论。2.2.2 EMT发生的分子学基础 EMT即上皮间叶转化 epithelial-mesenchymal transition，是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转分化的现象，这一概念是Greenburg和Hay19在1982年提出的，他们发现晶状体上皮细胞在胶原凝胶中可以形成伪足，转变为间质细胞样形态。其后陆续有报道很多物种的原肠胚形成、神经嵴细胞迁移形成神经管，心瓣膜、颅面结构以及肌肉骨骼系统的形成都有赖于EMT20。发生EMT的上皮细胞在经历了短暂的结构改变后，极性丧失，与周围细胞和基质的接触减少，细胞的迁移和运动能力增强，同时细胞表型发生改变，上皮表型，如角蛋白丝、E钙粘素逐渐丧失，而获得了间质表型，如波形蛋白Vimentin的表达等。 目前，EMT的发生机制尚未完全阐明，它涉及多个相互重叠的信号通路和复杂的分子机制。上皮细胞去极化和发生EMT时涉及几个重要步骤，每步都包含不同的分子机制，具体包括:? 细胞粘附相关基因E,钙粘素表达下调导致立方上皮细胞失去细胞间相互作用;? 立方上皮细胞的细胞角蛋白结构改变，外形演变为纺锤形纤维细胞态;? 获得了纤维原细胞或间质细胞的“特性”，如:波形蛋白的表达上调。在基础研究中，以上皮细胞极性的丧失及其间质特性的获得为发生EMT的标志，细胞获得较强的侵袭和移动能力。但是有时EMT过程仅在功能上有所改变，形态上可能毫无异常。12 第四军医大学硕士学位论文 目前有关EMT的研究认为，EMT的发生是由微环境因子作用于细胞受体，诱导细胞通路的改变，最终导致基因表达的改变。关于EMT的机制已有一些研究图0-1 图0-1 EMT分子机制(Nieto MA 2002) AKT:由AKR-8小鼠胸腺瘤中分离出的鼠类逆转录病毒基因;β-cat:β链接素;E-cad:E钙粘素;FAK:局部粘附激酶;IQ-GAP:一种生长相关蛋白;MAPK:丝裂原活化蛋白激酶;PI3K:磷脂酰肌醇3激酶;PAK:P21活化激酶;RTK:受体酪氨酸激酶;src:鲁斯肉瘤病毒基因;TGF-β:转化生长因子β;Tcf,Lef(T细胞转录因子,淋巴增强因子。 研究发现，不同程度的上皮细胞表型转化过程是由精确的细胞内信号转导机制调控的。细胞外信号通过与细胞表面特异受体结合而将信号转入细胞内，通过胞内的Ras、Src、Rho、PI3K、Wnt信号转导途径，活化不同的核内转录因子，最终调节转导基因的表达。 许多研究已经证实转录因子transcriptional factor有能力诱导EMT。其中Snail通过与E-钙粘素启动子区的E-盒结合，下调E-钙粘素的表达。在MDCK上皮细胞中Snail基因的过表达，可以导致细胞E-钙粘蛋白表达水平的.