【doc】极低密度脂蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞载脂蛋白E基因表达的影响

【doc】极低密度脂蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞载脂蛋白E基因表达的影响 极低密度脂蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞载脂 蛋白E基因表达的影响 ,I.7[ ?I3/ cN43—1153/R中国动脉硬化杂志1999年第7卷第2期95一,g 主量词 置 /丁\/7\,7, 极低密度脂蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞 载脂蛋白E基因表达的影响 陈培利.冯友梅从容王淳本宗义强邓栩祖 (同湃医科大学生特化学教研室,武沈43o~o) 血浆蛋白;侗垫苎宣多甘油三酯 ? 论着? {3 .敏{F2I—f 巨噬细胞,腹腔;巨噬细胞活化;栽脂蛋白E基因表达; 播要为研究载脂蛋白E含量不同的枉低密度脂蛋白对巨噬细胞栽脂蛋白E表达的影响,咀肝素一琼脂糖麓胶亲和屡 析法将正常人枉低密度庸蛋白分离为富含载鹰蛋白E和贫含载脂蛋白E的二种不同亚组分.并分剐咀不同难度与小鼠髓腔 巨噬细胞共培养而后以I~catlaem印速分析和十二蟪基硫酸蚋一聚丙烯酰胺麓胶电泳的方法研究了其对小鼠髓腔巨噬细胞 戢脂蛋白E基因表达的不同影响.蛄果发现,两种极低密度庸蛋白亚组分在较低难度(含甘油三酯100L)时均可刺激小鼠 髓腔巨噬细胞戢脂蛋白E基固的表达,且光m贫含载庸蛋白E的极低密度鹰蛋白 作甩更为明显,其刺救后的细胞mRI~A覆蛋 白质表达分剐增高约1.58和1.82倍.但高难度的二种枉低密度脂蛋白亚组分刺救的细胞mRI~A水平下降为对照的6s%,而 蛋白质水平却升高2倍之多,其机制未明.上述实验蛄果说明.贫舍戢脂蛋白E枉低密度庸蛋白可能在较低难度下具有更强 的刺激小鼠腹腔巨噬妇胞载脂蛋白E基因表达的能力,而高难度时则不然. Ei~eetsotHIm眦VeryLow1)emityIApoproteinOilfileotA|ipI叩EGemin thePeritonealMaerophages0fMice cHENPei—Li,眦You一?i.COliC,R0IIg,WANGChtm—Ben,ZONC,Yi—QiangandDENC,Yao—zu (D!}肌,,7_帅Med~a/i~guhan43~Q30,c轴) ^j嘲BloodhDte目;Plasma;Ijp.pIo'ei肚,VI.,DL;Triglyeefides;MacoF,Peritoneal;M眦加phBActlvali~;^poli? ploIei憾E;C,eneE耳雌8B_啪;Mieo k,~'I'RACI"Ah缸1"ostudythed~ferential枷cbhumanverylowdensityhp町n(VLDI~)~fraetiomwithdit[czentapoal,or~- reinEoontellt蚰thepr0I.叩diPo即舡iIlEgenejI.咖棚'().Me岫p0p玎IE一五ch and婶01jp0o【eiIIE一Bl1.憾l岫且Ihl】II砒V吼础diIap01ip0pmnEcontent糖p匝rmedby}一啊嘴 血一61t施々d衄幻rand_m即b日willl^吐d删o.町l暇陀v由.枷r曲0I.the嘣删 叩0Ijp0曲由E赋de忱m吐mltNAand啦eiI.w池N她罄唧andSI)S—p0ly矗廿y王唧ided即,pb晴e_ siB嘴pe酬y.R鳃lIbAt删I啦砷曲嘲idel0o腭,LIIm.both甲)Ii|,0P由E—andap.IipoE一 鲥e~ald啦land?of叩出p0pmnEin,witl-印0Iip0咖E—p00r虮陆出咖憎?g删e p0叫:anearlytwo—foldi瑚黜i丑the?RNAandpl0l西nIevd(1.58and1.82一foldl噶Pev由)惴ob眈i丑the舢哦a 印0Iip0曲由E一m?tOthel珂廿嘲einodls嘶bed础叩PonE—?哪(1.10and1.25 一 fold唧砌由).,thew日BdforoeIIslhaltwoat1000舭d咖m. Awas8~NNtedtOa6s%c?cc11日ineotfa~tmelevatednE州at? two一枷.r.them1aiIImat.时IITIrai出m明lhal酬E一 VLDLh鲫.ermstimulatethe呷【?且P0hp0P涮nEatrelatively10wconcentration,d? Il呲atJ岫一 0nIB. 载脂蛋白E是人及某些动物血浆脂蛋白中重 要的载脂蛋白组分之一.它在介导某些脂蛋白.如 极低密度脂蛋白(verylowdensitylil~protem,VII?L), 丰文为国家自然科学基金资助课题 ?理在北京医科大学生物化学与分子生物学系,100083 乳糜微粒残粒,低密度脂蛋白(1owdefIsitybpop删ei凸, mL)等的运输和清除中起着重要的作用….巨噬 细胞是动脉粥样硬化病变中泡沫细胞的重要来源. 其细胞表面存在多种脂蛋白受体,诸如VII?L受体, LDL受体和清道夫受体等.这些受体大多需载脂蛋 白E为配体,而且已证明巨噬细胞有鞍强的分泌载 脂蛋白E的能力,但该过程的生理意义尚不清楚. 这些分泌的载脂蛋白E可能与上述脂蛋白相结合 而利于其被巨噬细胞摄取,籍此可以将进人动脉壁 的脂质转运出去,从而起到防止动脉壁中脂质堆积 的作用.但是,摄取脂质后的巨噬细胞如不能及时 移出动脉壁,则可导致泡沫细胞的形成与堆积.我 们以前的工作发现取自正常血脂个体的VLDL可致 巨噬细胞内甘油三酯和胆固醇酯的堆积J.但是载 脂蛋白E含量不同的VLDL是否及如何影响巨噬细 胞载脂蛋白E基因表达目前尚无报道.实验观察 了载脂蛋白E含量不同的人的VLDL组分对小鼠腹 腔巨噬细胞载脂蛋白E基因表达的影响,以进一步 阐明其分泌的载脂蛋白E在VLDL摄取中的作用. 1材料和方法 1.1材料 DMEM,胎牛血清及硝酸纤维素薄膜(0.45肿) 购自Gibco公司;苯硼酸购自si公司;肝素一琼 脂糖凝肢层析柱购自Pharmacia公司;P-dCTP得 自中国原子能科学研究院同位素研究所;其它试剂 均为国产分析纯级.' 1.2脂蛋白及两种极低密度脂蛋白组分的分离 将正常人(TG<1357mg/L,TC<1816mg/L)的 新鲜奎血以本实验室建立的超速离心法(L8—80M, Beckman,usA)分离VLDL(d<1.OO6kg/L)J.载脂 蛋白E含量不同的VLDL的两种亚组分参照Huff 等…介绍的方法阻肝素一琼脂糖凝胶亲和层析分 离.将两组分各取少量测定其蛋白质含量后,阻 Muire等介绍的方法鉴定各组分载脂蛋白的组 成.余者过靖除菌后于4~C充氪避光保存. 13小鼠腹腔巨噬细胞培养 按常规方法收集雌雄小鼠腹腔巨噬细胞(n'sotlS~ pefiUmeal?.pha菪e8,MPM)并悬浮于含10%胎牛 血清,1ku/L青霉素和1mg/L链霉素的DMEM中, 表1. Tablel 充分混匀后分散于90x18mm的塑料培养皿内,经. 37?,5%c培养约3h(ShelLab,USA),以{ DMEM冲洗以除去未帖壁的细胞后,按不同实验条 件继续培养. 1.4小鼠腹腔巨噬细胞载脂蛋白E的合成和分泌! 培养18—24h后的MPM分别在含有TG100 腭,L或1000L,富含载脂蛋白E或贫含载脂蛋 白E的两种VLDL组分的DMEM中继续培养24h (含苯硼酸200banol/L).废弃原培养基,DMEM/ 彻底冲洗后加^新鲜的无血清的DMEM继续培养8 — 10h.收集各试验组的培养基,充分透析,浓缩,. 冻干.测定其蛋白质含量后以十二烷基硫酸钠一甘 油一聚丙烯酰胺凝肢电溶(SDS-G-PAGE)分析其所 含蛋白质成分.各组载脂蛋白E以光吸收度扫描 作相对定量. 1,5RNA的提取与Noithem印迹分析 细胞单层以冰冷的PBS冲洗后依照Chomczym— ki等方法提取总RNA,在260rIrn测定吸光值以定 量.Northern印迹分析和载脂蛋白E及B—acfincD— NA探针的制备按标准方法进行,探针以随机引 物法标记.扫描各组载脂蛋白EmRNA条带的吸光 度作相对定量,阻各组口一acfinmRNA条带的吸光 度扫描作内参比. 1.6其它实验方法 蛋白质含量以's法测定,总胆固醇和甘 油三酯含量以酶法测定(BoehfingerMannhein). 2结果 2.1极低密度脂蛋白两种亚组分的组成 正常人血浆VLDL两种亚组分的脂质与蛋白质 的相对构成见表1(Table1).从表1(Table1)中可 见胆固醇/蛋白质,甘油三酯/蛋白质的构成均以贫 含载脂蛋白E的VLDL组分高(P<0.005,P<0. 05).提示两种组分中蛋白质含量与相对构成不同. 极低密度膀蛋白两种亚组分的膀质及蛋白质组成【L uaridpr嘶血.口叫嘲t嘶m0fllmlaanVILDLsubtrtlafiomsemrat~bym叫n—se啊e一 6B eamlatoo-a~~ TG,Tri0ycefide;,Cholestewl;Pr,Protein;APo,^?:P(0.05.b:P<0005,咖删山ApoE— richVLDL? 2.2载脂蛋白E的合成与分泌 十二烷基硫酸钠一甘油一聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析培养基中载脂蛋白E含量的结果见图1(Figure 1).其吸光度扫描结果见表2(Table2).可见MPM cN43—1153/R中国动脉硬化杂志1999年第7卷第2期 , 分泌载脂蛋白E的量在分别与正常人VLDL两种亚 组分共培养后均增高.对于富含载脂蛋白E的 VLDL,当培养基中IB浓度为1(30L时细胞所分 泌的载脂蛋白E是对照组的1.25倍.TG浓度为1 000v#L时是2.45倍.而相应浓度的贫含载脂蛋白 E的VLDL则可以使细胞分泌的载脂蛋白E分别是 对照组的1.82倍和2.43倍.可见贫含载脂蛋白E 的VLDL在较低浓度时具有更强的刺激MPM分泌 载脂蛋白E的能力,而在高浓度时虽然两种VLDL 均可使MPM分泌的载脂蛋白E增加,但似无差别. 蔼1.不同VLDL亚组分对小曩腹腔巨噬细胞分泌羲膳蛋 白E的影响 帆1.Effet~hl??玑出枷?the印0li- pepm~Esecteem缸皿阻日eperltoo~m啊邶phn窖e【MH) detem/ledbyPAGE.Line1.coal:~;Lines23,MIMetreated ,dthl?Lend1(900L甲lE-VLDLte~ve!.y; Iz~ee4and5,^?8tmaedwifla100Land10O0Lm,llporm~. BP咐VLDLtespeccdvety;Lines6lpT喃n.哪l"elnb 2.3载脂蛋白EmRNA的Noxthem印迹分析结果 为了研究富含载脂蛋白EVLDL与贫含载脂蛋 白EVLDL对MPM分泌载脂蛋白E不同作用的机 制,提取不同条件下培养的MPM的总RNA进行 Northern印迹分析以观察载脂蛋白EmRNA的表达 情况.结果见图2(FIe2)和表2(Table2).发现 在TG为低浓度实验组中正常人VLDL两种亚组分 均可使MPM载脂蛋白EmRNA的水平增高:富含 载脂蛋白E的VLDL中培养的细胞其表达的载脂蛋 白EmRNA是对照的1.1O倍,而加入相应浓度的贫 含载脂蛋白EVLDL的培养者其载脂蛋白EmRNA 大约是对照的1.58倍.然而,在培养基中TG浓度 为l000v#L的实验组中,两种亚组分却可以类似 的程度抑制mRNA的水平,即其mRNA均约为对照 的O.65倍.提示载脂蛋白E含量不同的VLDL可 能是在转录水平影响MPM载脂蛋白E的合成和分 泌的,并且低浓度下表现为诱导其转录,在高浓度 下则表现为抑制效应.' 表2.人VLDL亚组分对曩腹腔巨噬细胞羲膳叠白E基因 表达的影响 Table2Emmts皿叫V工DL鲫出h_d幢setlx.tlm mdtrameripe叩叩n嚏dnEgatem哪pt ~(MrM) 12345 围2.不同VLDL亚组分对小?腹腔巨t?胞t囊叠白E mRHA转录的影响 loire2.Effet:tsh珊VLDL卿删嘣瞄岫血棚b 叩oIIp触Eseereeen缸m暇ptt-mme~qe (删)determlaedl~rmemb/eteag.1ame1,cmttml;Lines 2and3l啡bt:mtedwilh100'sad1000L印F呷nE-Bob VLI~L?Pe畸;4sad5,tmaedwith100,Lsad10O0 Ld0prE.poorVLDLrespectively 3讨论 动脉内皮下巨噬细胞源泡沫细胞的大量聚集是 动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)早期病变的重要 病理特征.因此研究巨噬细胞在As发生过程中的 正1007-3949ChinJAaer~ler,V0l7.No2 生物学行为对阐明AB发生的分子机制及早期治疗 和预防有着重要的意义.tdP~l是研究巨噬细胞在 AB中作用的重要模型,该细胞不仅可以合成及分泌 载脂蛋白E,并且其合成量受诸如细胞内游离胆固 醇的量和某些细胞因子(如GM—CSF,TC.F—日)及佛 渡酯(PholtJole~tea")等因素的调节.研究表明,巨噬 细胞可以通过VLDL受体途径摄取VLDL[.该途 径主要以载脂蛋白E为配体介导VLDL与其受体相 结合.本实验则表明富含载脂蛋白E的VLDL组分 和贫含载脂蛋白E的VlJ.,D组分在经由上述受体途 径被巨噬细胞摄取时对其载脂蛋白E的基因表达 具有不同的作用.以肝素琼脂糖凝胶亲和层析法分 离的正常人VLDL富含载脂蛋白E的组分和贫含载 脂蛋白E的组分在低浓度时均可刺激载脂蛋白E mP,NA及蛋白质产物的合成,贫含载脂蛋白E者尤 为显着.通过该过程分泌的载脂蛋白E可能会在局 部与VLDL颗粒结合(尤其是贫含载脂蛋白E的 VLDL).以提高VLDL中载脂蛋白E的含量,从而 增强VLDL与受体的亲和力,利于VLDL的摄取和 清除.类似的过程有的研究者称之为分泌一再摄取 途径.贫含载脂蛋白E的VLDL组分具有较强的 刺激巨噬细胞分泌载脂蛋白E的作用,且这种调控 作用发生在转录水平.其机制可能如下:由于贫含 载脂蛋白E的VLDL中脂质与蛋白质的比值均高于 富含载脂蛋白E的VLDL,故可能具有更强的结合 载脂蛋白E的能力.此外.由于贫含载脂蛋白E的 VLDL使巨噬细胞中甘油三酯的堆积更为显着,增 高的甘油三酯也可能会通过某种机制影响载脂蛋白 E的表达. 同时,由于贫含载脂蛋白E的VLDL中载脂蛋 白E,C比值要低于富含载脂蛋白E者(o.37比2. 25).而载脂蛋白c在肝载脂蛋白E受体(LRP)及 LDL受体介导的脂蛋白摄取中的"负性调节因 子"的类似作用可能会延缓巨噬细胞对贫含载 脂蛋白EVLDL的摄取从而使巨噬细胞分泌的载脂 蛋白E反馈性的增加,以促进其内化和降解. 与在低浓度下的刺激效应相反.VLDL两种亚 组分在高浓度时均表现为对载脂蛋白EmP,NA的抑 制效应.其机制未明,可能机理如下:外源的载脂 蛋白E与细胞合成和分泌的载脂蛋白E均可再次 与VLDL相结合而被摄取",因此当环境中有足够 的载脂蛋白E参入VLDL的摄取时.巨噬细胞自身 载脂蛋白E的合成即受到抑制. 综上所述.巨噬细胞可以通过调节自身载脂蛋 白E的合成和分泌量而控制VLDL的摄取量,这对 解释在以碳水化合物为主食的人群中发生的以贫含 载脂蛋白EVLDL升高为主的高甘油三酯患者所发 生的AB提供了一定的实验依据. 致谢冯宗忱教授及屈伸教授在实验中给予了有益 的支持和建议. 参考文献 lM岫RW.^P0lipnE:ehote~.1a!h鲫呷哪岫I1with proleinoe?M.s?,l988,枷:盟一 2冯宗忱.B劬哺sR,G出Gs.楹低密度脂蛋白引起巨t?矗内 甘袖三醇的堆积:脂蛋白受悻的作用.武进医学晓, 191132:1昕一112 3王痒本,宗义强,昊万生,等.两步超连离心{岳快连分离大量 血浆楹低密度脂蛋白厦低密度脂蛋白.同济臣井置拳, 1995.24:l田一171 4嘣rMW,Tetf~tDE.Ch日矗?I咄山dicfideQI" Iow如竹liIq舢Hl岫响氍p日byH单一雌 -}I-:由『Dd成甲,1984,7%:1一l 5dcF,l舶M,-嘶阿.s啊Ii曲虹一由肾d 一 如妯d嘲呻h?QI"- telm.J,删脑,l啪,3o:757—761 60】--iP,S日odNsiIe一姆tmd?dQI"RN^.瞳?正? d呲_蚰i哦一一d?帅越. dm.1嘟.l:l56—159 7萨蝇布鲁竟J,弗里青匝,曼尼阿蒂新T(盒冬雁,摹置枫译). 分子克隆实奠指南.第二版,北京:科学出簟杜.1992,24— 28.3酯一372 8J,5,dIKd.11.eeVin edl{?rn.^br_地f帅67mBcid雌自em自.^rnc蚰H龇l A??油,N州Y咀k,1994(?e由,cd帆) 9J,HA,nk曲5,d.城,0邱r呻蛳loeb- ?.嘣p豫?h-锄1d芒哪畸I叩lnI优 .J删,1994,撙:2m—l82 10啪tFM,脏.M,el.k ul0flheh哪1竹H乜,呻Ere- 雠:Tm—mblE瞳.甲?p卫出BroleforlheI优—黼? 1日ld1日p叫1.br_啪【,1995,l:3柏一蛳 11sIl哪It,N咖b丑Y,J,se?一mp味pf 嗍印呷Ein?I呷dIl口伽Ib hnic?.』踟,1,粥:2215一 12K刊哪,陆埘,:-Rw,el0酗 印0IilP甲Ec硼liP叩bifl51出q1iP叩 I一埘n』删n,l啪,嬲:IO77l一 13wE.}h试RJ.1血唧酗cpIl' 埔t且h-锄硼lhe呷1日Ihi一br岫岫 I即IWbl.E如IHW.』E脑,l985,筠:556—565 (此文l998一?一24收到,1999一I34一惨回) (此文绾辑胡必利)