菠萝蛋白酶的分离及其脱痂作用研究（可编辑）

菠萝蛋白酶的分离及其脱痂作用研究（可编辑） 菠萝蛋白酶的分离及其脱痂作用研究 山东大学 硕士学位 菠萝蛋白酶的分离及其脱痂作用的研究 姓名:李乃成 申请学位级别:硕士 专业:微生物与生化药学 指导教师:贺艳丽 20080428山东大学硕士学位论文 符号说明 符 号 中文含义 丙氨酸 谷氨酸 岩藻糖 木糖 .乙酰氨基葡萄糖 甘露糖 精氨酸 天冬酰胺 色氨酸 组氨酸 聚砜酰胺 羧甲基纤维素 快速蛋白液相层析 二磷酸腺苷 前列环素 前列环素 氟尿嘧啶 尿激酶组织型纤溶酶原激活因子 阢 白细胞分化抗原 肿瘤坏死因子 乳酸脱氢酶 肌酸磷酸激酶 眦 尿激酶样纤溶酶原活化物受体 谷丙转氨酶 谷草转氨酶 半数致死量 聚乙二醇 十二烷基硫酸钠 药时曲线下面积 湿润烧伤膏 湿润暴露疗法 酪蛋白消化单位 明胶消化单位 苏木精和伊红 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 期:卅二矽 论文作者签名:丛亟 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 期:趔:簟髟 论文作者签名:辑导师签名:丝日山东大学硕士学位论文 菠萝蛋白酶的分离及其脱痂作用的研究 研究生:李乃成 导师:贺艳丽研究员 专业:微生物与生化药学 摘要 菠萝蛋白酶具有良好脱痂作用,在国外临床上已有应用,国内尚未有相 关制剂产品。为制备用于烧伤脱痂的菠萝蛋白酶软膏,本课题参考国内外文 献,对国产菠萝蛋白酶从精制、各组分溶痂作用、软膏制各及动物活体脱痂 方面进行了研究。首先选择国内符合国家药品的菠萝蛋白酶原料,对菠 萝蛋白酶原料进行了精制,通过单因素法研究原料溶解浓度、值和丙酮浓 度对精制原料酪蛋白水解活性的影响,确定了最佳精制工艺条件为原料溶解 浓度为 /,值为.,冷丙酮加入浓度为%.一聚丙烯酰胺凝 胶电泳和葡聚糖凝胶.层析结果显示国产菠萝蛋白酶原料与日本 产的菠萝蛋白酶原料组分一致。.聚丙烯酰胺凝胶电泳测定菠萝蛋白酶中 、 各组分的分子量分别为 、 和 。用葡聚糖凝胶 分离收集个主要组分进行.聚丙烯酰胺凝胶电泳、酪蛋白 水解活性测定和体外溶痂实验,结果表明个组分的酪蛋白水解活性和体外 溶痂作用按分子量大小递减。精制原料用葡聚糖凝胶层析结果 表明各组分含量有变化。用和比例为:作为基质制备了 菠萝蛋白酶软膏,并制定了质量标准。影响因素实验和加速实验表明制备的 菠萝蛋白酶软膏稳定性符合要求。以湿润烧伤青为阳性对照、基质作为阴性 对照,研究了精制菠萝蛋白酶原料制备的软膏与未精制原料制备的软膏对豚 鼠?度烫伤脱痂效果,观察第天结痂率及平均脱痂天数,结果精制菠萝蛋 白酶制备软膏脱痂效果与湿润烧伤膏一致,好于未精制菠萝蛋白酶软膏,两 者脱痂效果均好于阴性对照组,脱痂后的病理学切片显示软膏组与阳性对照 组没有明显差别。 本研究取得的主要研究成果和结论有: 山东大学硕士学位论文 对菠萝蛋白酶原料进行了精制,制定了最佳精制工艺条件。 对菠萝蛋白酶分离出的主要组分进行了体外溶痂研究,研究了不同 组分的溶痂效果。 研究了菠萝蛋白酶的软膏制剂工艺,并制定了质量标准。 对菠萝蛋白酶软膏进行了豚鼠?度烫伤脱痂研究,证明了其良好的 脱痂效果。 关键词:菠萝蛋白酶;菠萝蛋白酶软膏;?度烫伤;脱痂 山东大学硕士学位论文: ? ? :.: .. 咄’伽. 笛 .: . ’ .%. /, ? 、 、 . ., / / ... .、啪 山东大学硕士学位论文 .,..?哪:. / .. . :; ; ; 山东大学硕士学位论文 第一章前言 菠萝蛋白酶是从风梨属植物菠萝中提取的一组巯基水解蛋 和茎菠萝蛋白酶 白酶。从来源可分为果菠萝蛋白酶 .年,等【增先用硫酸铵沉淀方法从菠萝果实中分 离出了果菠萝蛋白酶,年,等【发现并从菠萝茎中提取出了丰 富的蛋白水解酶,从此菠萝蛋白酶实现了商品化生产。现在商品化的菠萝蛋 白酶均来源于茎中,本文中的菠萝蛋白酶均指茎菠萝蛋白酶。 .理化性质 年,等【对用阴离子交换柱层析、硫酸铵沉淀等方法提纯的 菠萝蛋白酶进行了理化性质的研究。所得到的菠萝蛋白酶中含有. %的糖成份,有个?乙酰化的氨基己糖,等电点为.,分子中有个 氨基酸残基,其中有个酸性氨基酸分子,根据氨基酸组成计算出氮含量为 .%。用超速离心法测得的分子量为,,与通过分子结构计算出的分 ,. 子量相一致。酶溶液最大吸收波长为 ,最小吸收波长为 处的吸光度为.。 %浓度的酶溶液于 以后的许多研究者在等人的研究基础上对菠萝蛋白酶的理化性 质进行了研究,包括氨基酸组成、糖分子结构及酶的蛋白水解活性等,并对 其中不同组分的理化性质进行了比较。 年等【塘过研究排列出了菠萝蛋白酶主要组分的氨基酸顺 序,表明菠萝蛋白酶是木瓜酶系中的一种。其氨基酸数量有种,共个, 得出的酶分子量是 计算得出的分子量是 ,加上糖部分的分子量 。肛末端的氨基酸是丙氨酸,末端的氨基酸是谷氨酸. 菠萝蛋白酶是一种糖蛋白,分子结构中有一个寡糖分子,由甘露糖 、岩藻糖、木糖和肛乙酰葡糖胺 沁组成,共价连接在肽链上,等?锻据研究推测 糖分子的结构如图.。山东大学硕士学位论文唱.趴..。 图 等推测糖分子的结构而等嘲对酶水解后获得了两种寡糖分子,其结构如 图。 ?.图 等分离出的两种糖分子的结构 掣】将菠萝蛋白酶用连四硫酸钠保护分子中的基 团,过碘酸钠氧化糖分子,在反应、、小时后,未被氧化的糖分子分别 剩余%、%、%,而对酪蛋白水解活性分别保持了%、%和“%, 说明酶分子结构中糖分子不是催化所必需基团。 菠萝蛋白酶分子中基团是催化水解活性基团,它位于从肛末端开始 的第个氨基酸,陈清西等【】研究后认为:巯基、氨基、色氨酸残基 和唯一的组氨酸残基是酶催化活性必需基团,而羧基和羟基与酶活性 无关,酶中的六个色氨酸残基仅有一个是酶活性所必需的。 在丙酮提取的菠萝蛋白酶粉末中,含有能抑制酶活性的小分子蛋白, 。木瓜蛋白 等测定出了这些蛋白质的氨基酸组成,分子量约为 酶抑制剂??一和鸡蛋 清蛋白也可抑制菠萝蛋白酶,但由于分子结构上的不同,这两种物质对菠萝 蛋白酶的抑制程度要比对木瓜蛋白酶弱【。兔血清与人血清对菠萝蛋白酶活 山东大学硕士学位论文 性也有一定的抑制作用。 菠萝蛋白酶对多种天然蛋白质与合成多肽具有催化水解作用,天然底物 有酪蛋白、明胶等,合成底物有..:苯甲氧基,、:氨基酸形 式的肽及其它各种多肽。菠萝蛋白酶以酪蛋白为底物时的最适温度为~ ?,最适为~;以明胶为底物时的最适为..。实验已经证 明,酶活性的强弱与酶的各种药理作用有关,如由于酶的蛋白水解作用,使 得细胞膜的通透性增加,从而使细胞内水分能够重新被吸收回血液,达到消 除水肿的目的【。 在菠萝蛋白酶组分的研究方面,从发现菠萝蛋白酶开始,人们就用不同 的方法对菠萝蛋白酶进行分离和纯化,得到了单一组分,并且证明了其中某 些组分在理化性质与药理作用方面有特殊的性质。 年,等四在其年研究的基础上,建立了一种分离纯化菠萝 蛋白酶的方法,首先将菠萝蛋白酶溶解离心,收集葡聚糖凝胶柱层析后的活 .层析得到:五种组分,而收集其 性成份,再用. 中较低活性的组分通过.层析得到组分。 年,等【离子 层析法通过 阳离子交换柱分离出了茎菠萝蛋白酶中的主要组分 ,而将分离出的其中另外两种较少的组分分别叫做和 ,的氨基酸顺序已经排列出来,结构中不含糖分子。 认为和是起到脱痂作用的有效成分. 等在年四和年【习用 阳离子交换柱和 阴离子交换柱分别从菠萝酶中分离出了三种有活性的碱性酶 、、和两种酸性酶/、/。 .生产方法简介 年,等【将菠萝茎榨汁离心后用丙酮沉淀的方法获得了粗 酶,其中含有%蛋白质,..%的非有机成份,还有其它的一些复杂的 糖成份。现在工业化生产方法主要有两种【:白陶土吸附法和鞣酸吸附法。 山东大学硕士学位论文 王平诸等【】曾用一种新工艺生产菠萝蛋白酶,将除去杂质后的菠萝茎澄 清汁液用聚砜酰胺膜浓缩至原体积的/,再用%乙醇进行沉淀, 结果酶的活性和收率都得到提高。 菠萝蛋白酶生产过程中,为了不破坏酶活性,防止酶的自身水解作用, 温度一般控制在.?,另外常加入一些活性保护剂,如维生素、依地酸 二钠、半胱氨酸等。林韶湘等在提取过程中使用依地酸二钠、醋酸锌、氯 化钠、维生素可使茎菠萝蛋白酶活性比未加入时提高.%,而提取时加 入%半胱氨酸或%硫代硫酸钠作为抗氧化剂可使果菠萝蛋白酶和茎菠萝蛋 白酶活性分别提高.%和.%。 .药理作用 ..抑制血小板聚集、溶解纤维蛋白、抗炎作用 在年就有研究表明,菠萝蛋白酶可抑制血液中的血小板聚集。 例有心脏病史、中风史或血小板聚集值高的自愿者口服菠萝蛋白酶,其中 例患者血小板聚集值降低,例血小板聚集值较高的患者中有例恢复为正 常【】。体外研究表明,一定剂量下的菠萝蛋白酶通过刺激、肾上腺素、 前列腺素前体,可加强抑制板聚集的作用】。 研究表明:菠萝蛋白酶可以防止血小板的聚集,从而可阻止或减轻一过 性缺血的发作,可防治血栓的形成及血栓性静脉炎,可消除分解胆固醇斑, 可激活血纤维蛋白溶解作用【?。口服菠萝蛋白酶可在小鼠的激光血栓模型 中,将肠系膜小动脉的血栓的形成降低%。如果延长服用时间,在动物试 验中菠萝蛋白酶也可发挥抗高血压作用。对例心绞痛患者服用菠萝蛋白酶 每天 一 ,在天里,所有病人症状消失。每天服用 的患者也有相似的结果,但停止服药后,在一段活动期后心绞痛 再次复发。据报道,每天与乳酸镁钾同时服用 的菠萝蛋白酶 可显著减少心肌梗塞的发生蚴。对例有急性血栓性静脉炎病人的研究表 明,菠萝蛋白酶与止痛剂合用,可消除炎症,包括疼痛、水肿、触痛、皮肤 发热和无力剀。菠萝蛋白酶的上述作用可归因为分解纤维蛋白和溶解动脉硬 化斑。在兔主动脉中,菠萝蛋白酶很可能有助于增加脉管壁对氧和养分的渗 透性,增加血流流动性【】。 山东大学硕士学位论文 在体内和体外,菠萝蛋白酶都是一种有效的纤维蛋白溶解剂.然而,在 纯化的纤维蛋白原的溶液中的作用比在血液中强,这可能是由于血液中存在 蛋白酶抑制剂。在大鼠试验中,服用一定剂量的菠萝蛋白酶会降低血清中纤 维蛋白原水平口】。菠萝蛋白酶的溶解纤维蛋白的活力来自于促使血纤维蛋 白 溶酶原向纤维蛋白溶酶转变,从而使纤维蛋白降解,抑制凝块扩散过程,这 一过程可抑制因纤维蛋白而引发的凝血反应。 菠萝蛋白酶与其它酶系统一起会有直接或间接的抗炎作用。一定剂量的 菠萝蛋白酶和依托度酸酶有抑制大鼠炎症和疼痛的作用嘲。在大鼠实验性引 起的水肿试验中,菠萝蛋白酶是该研究中九种抗炎物质中最有效的一种【引。 在抗炎试验中,菠萝蛋白酶和强的松有相似的抗炎作用例.在大鼠动物模型 中,依莫法宗镇痛药和菠萝蛋白酶同用治疗,会有效地抑制发热引起的 免疫反应物质的释放以及抑制并发性水肿刚. 在小鼠、大鼠和兔等的动物模型的实验中,菠萝蛋白酶可抑制水肿的形 成,并消除水肿。其抑制水肿的形成比吲哚美辛、乙酰水杨酸和保泰松更有 效。另外菠萝蛋白酶在各种动物模型上口服给药都可明显减少水肿,它可以 通过水解纤维蛋白增加血管的渗透性,并促进水肿液重新吸收进血液循环, 提高药物向组织内的渗透,这与临床结果一致,临床上服用菠萝蛋白酶后可 协同地增加组织对抗生素的吸收【】。 在大鼠外伤性的腿水肿实验中,菠萝蛋白酶经肠道吸收有显著的减轻水 肿作用,而非肠道吸收只有很小的治疗作用.经肠吸收虽然会引起菠萝蛋白 酶的降解,但口服菠萝蛋白酶确实得到明确的效果,表明菠萝蛋白酶可被肠 道吸收而仍有生物活性网. ..用于烧伤后脱痂 ..烧伤简介. 烧伤是常见外伤,发生率约为外科住院病人的%~%。烧伤严重程度 的判断主要依据烧伤的面积、深度、部位、年龄、有无合并伤,伤前的体质 强弱,有无内脏器质性疾患等因素综合判断。对烧伤深度的识别我国普遍采 用三度四分法,即根据皮肤烧伤的深浅分为浅度、浅度、深度、?度。 山东大学硕士学位论文 深达肌肉、骨质者仍按度计算。临床上为表达方便,将度和浅度称为 浅烧伤,将深度和度称为深烧伤图.。 图一烧伤深度的三度四分法组织学示意图?度烧伤又称焦痂性烧伤。皮肤表 皮及真皮全层被毁,深达皮下组织, 甚至肌肉、骨骼亦损伤。创面上形成的一层坏死组织称为焦痂,呈苍白色, 黄白色、焦黄或焦黑色,干燥坚硬的焦痂可呈皮革样,焦痂上可见到已栓塞 的皮下静脉网呈树枝状,创面痛觉消失,拔毛试验易拔出而不感疼痛。烫伤 的?度创面可呈苍白而潮湿。在伤后周焦痂溶解脱落、形成肉芽创面, 面积较大的多需植皮方可愈合,且常遗留瘢痕挛缩畸形. 烧伤不仅造成皮肤的毁损,而且会引起严重的全身性反应,尤其是大面 积烧伤,全身反应甚为剧烈,可出现各系统、器官代谢紊乱,功能失调,谓 之“烧伤病”。临床上根据烧伤创面引起全身病理生理变化的阶段性,一般将 烧伤病程经过分为休克期、急性感染期、修复期。没有明显感染的浅度烧 伤可在~天愈合。深?度~天痂下愈合。?度烧伤,面积很小的直 径在 以内者可由四周的上皮长入而愈合,面积较大的需要经过植 皮方可愈合。明显感染的深度烧伤的痂皮,或?度烧伤的焦痂于周开 始与健康组织分离而自溶脱痂。此时大量坏死组织液化,感染或重,脱痂后 大片创面外露,体液渗出多,又加重代谢紊乱,仍可发生焦痂溶解期败血症。 山东大学硕士学位论文 因此,积极主动地清除坏死组织,及早植皮覆盖创面,才能从根本上控制感 染加速愈合。 ?度烧伤后常用暴露疗法,涂抗感染药物,烤干焦痂使之干透,干燥的 焦痂可暂时保护创面,减少渗出,减轻细菌侵入,然后可按分期分批地 切除焦痂坏死组织,植皮。年,我国上海广慈医院烧伤科首先应用大 面积?度焦痂切除大张异体皮打洞嵌植小片自体皮的方法救治特大面积? 度烧伤成功,以后随着手术方法的改进和切痂,保痂等方法的比较研究,又 提出了分期分次切痂,削痂,剥痂和酶脱痂等以及采用异种皮猪皮替代同种 皮等不同的方式方法,经过国内外不断的实践和发展,许多大面积?度烧伤 病人切痂的治愈率较传统的治疗有明显提高。 ...菠萝蛋白酶脱痂作用 对于?度烧伤病人,应用快速、无毒的方法脱痂是有效减少临床并发症 和死亡率的重要方法,深度烧伤病人的死亡主要原因是脓毒症。除去死皮组 织,又不伤及正常组织,就可促进尽早植皮,减少脓毒症的发生,并加快病 人的康复。菠萝蛋白酶就有以上的优点,该药品制剂已在日本等国家得到应 用,可用于烧烫伤、褥疮、各种浅表性溃疡、各种外伤及手术后坏死组织的 分解、去除。 菠萝蛋白酶应用于乳膏剂%菠萝蛋白酶混匀于脂质中能有效地局 部清理烧伤创面和加速愈合。有研究者认为菠萝蛋白酶中有一种非水解蛋白 成份具有这样的效果,这种成份被称为焦痂酶。它对正常蛋白底物或各种粘 多糖底物没有水解活性,同时其活性作用随着制剂类型而变化【. 局部应用菠萝蛋白酶能分离活组织界面的焦痂,使活组织与死组织之间 产生分界面,用压舌板可刮除所有的焦痂,并形成适合于植皮的表面。通过 使用菠萝蛋白酶,移植术可以在事故发生后小时内进行.使用菠萝蛋白酶 膏剂治疗烧伤,不会形成癍痕或者癍痕很小.有的研究者尝试拓宽菠萝蛋白 酶清创的应用范围,对冻伤的痂皮应用菠萝蛋白酶进行试验,但是冻伤痂皮 却没有明显的变化,而同时进行对比的烧伤脱痂却有效刚。 陈世铭】等用芥子气对兔皮肤进行损伤,以制做深度烧伤动物模型, 并将菠萝蛋白酶配成,%和%的软膏用于脱痂治疗,试验结果表明 山东大学硕士学位论文 菠萝蛋白酶软膏平均脱痂时间为.小时,时间最短,与其它浓度的软膏基 质比,脱痂效果有极显著性差异。 等在大鼠烧伤模型试验中,一组用%的菠萝蛋白酶,另一组 只用基质。几小时后,菠萝蛋白酶组脱痂完全,另一组动物手术切痂,两组 植皮及动物的行为、活动、体重、血细胞比容,血浆总固体物及水平等 无差异。 蚓等做了用菠萝蛋白酶对猪?度烧伤模型的脱痂作用研究,菠萝 蛋白酶配成%的缓冲液。试验结果表明:菠萝蛋白酶作用小时后,就 可观察到明显的脱痂作用,小时完全脱痂,脱痂后可形成健康的肉芽 组织,去痂后,血浆的、、、和碱性磷脂酶未出现异常 变化。认为脱痂作用包括溶解痂皮,溶解痂皮与下面正常组织的中层 组织,并减少创面的流血。菠萝蛋白酶的溶痂快慢与酶浓度成正比,对正常 组织无损伤。 】和等人对菠萝蛋白酶用于烧、烫伤后的脱痂也作了有 关的报道,认为该酶有疗效确切、作用快速、无毒副作用等优点,具有较高 的临床应用价值。 总之,菠萝蛋白酶可迅速去痂,效果优于其它化学去痂剂,它可提早植 皮时间,减轻脓毒症的发生并加快康复,这对于减少严重烧伤病人的并发症 和死亡率非常重要。 ..抗癌作用 年第一次报道癌症患者口服菠萝蛋白酶的治疗.例有卵巢或乳房 癌患者每日服用 菠萝蛋白酶,时间为个月至数年,部分癌肿瘤消失 并抑制肿瘤转移。也有报道结合使用化学药物如和长春新碱,每日服用 超过 的菠萝蛋白酶使肿瘤缩小。一定剂量的菠萝蛋白酶也能抑制接 种于小鼠体内的刘易斯肺癌细胞的转移。不论是否有蛋白水解、抗凝血的作 用,菠萝蛋白酶都存在这种抗转移作用【,柏】。 有研究表明,人口服较高剂量的菠萝蛋白酶数周或数年,可明显抑制恶 性肿瘤的发展且无副作用。体外研究表明菠萝蛋白酶可抑制不同肿瘤细胞的 增殖,其机理与菠萝蛋白酶可诱导细胞分化有关。另外,菠萝蛋白酶可选择山 东大学硕士学位论文 性地水解以清除细胞粘附分子,抑制肿瘤转移的第一步,并减少尿激酶 血浆溶纤原因子及其受体的浓度,抑制肿瘤转移的浸润过 程。 .对免疫细胞的调节作用 菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶都能诱导人外周血单核细胞产生细胞 因子。用一定剂量的这类物质治疗一定时间,可引发肿瘤坏死因子、 白介素?、白介素的生成增加。干扰素吨、干扰素吖 不能单独作用,它们与其它酶结合在一起发生作用,使增加【】。用胰 蛋白酶处理的而非自溶片段的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶对产生诱导,使 其作用可增强到倍,而单用胰蛋白酶只有很弱的作用。对细胞因子的 诱导作用可以解释口服菠萝蛋白酶的抗癌作用。 体外试验表明菠萝蛋白酶可刺激单核细胞产生相当多的盯吨,.和 .等细胞因子。一项对例健康人和例乳腺癌病人的研究表明,口服 菠萝蛋白酶 菠萝蛋白酶单位/天,天可双倍提高病人血液中单核 细胞杀死肿瘤细胞的能力洲。 ..增强抗生素效应 菠萝蛋白酶能促进不同的药物渗透到组织和器官中,如菠萝蛋白酶能延 长大鼠注射戊巴比妥后的睡眠时间,能增加鼠脊柱内的青霉素、庆大霉素水 平嗍。服用四环素和羧氨苄青霉素等抗生素同时使用菠萝蛋白酶,能增加血 和尿中的抗生素水平。 用阿莫西林或四环素治疗例妇女,同时使用 的菠萝蛋白酶,可 增加药物的血清浓度,与对照组相比,抗生素在子宫、卵巢导管、卵巢中的 药物水平增加,但对消炎痛就没有这种效果。这表明菠萝蛋白酶对药物有选 择性.双盲试验证实,口服 的菠萝蛋白酶,血清中的四环素水平提 高倍【田. 对例住院患者用菠萝蛋白酶和抗生素治疗,这些病人患有肺炎、支气 管炎、皮肤葡萄球菌感染、血栓静脉炎、蜂窝组织炎、肾盂肾炎、直肠周围 及直肠脓肿,其中例患者对单独使用抗生素治疗时无效。这些患者使用青 山东大学硕士学位论文 霉素或氯霉素等抗生素同时每日次服用菠萝蛋白酶,另外例患者只用抗 生素治疗作为对照。结果例抗生素治疗无效的患者中例联用后有效, 对每种病的研究显示,与单独使用抗生素相比,菠萝蛋白酶和抗生素联用可 有效抑制发病率。另有例只用菠萝蛋白酶治疗作为对照,与抗生素治疗 有类似的效果【】。 例急性鼻窦炎患者应用标准治疗,包括使用抗组胺药、镇痛剂以 及在需要的情况下使用抗生素,其中例每日给予菠萝蛋白酶次,而其余 病例应用标准治疗方案同时给予安慰剂。用菠萝蛋白酶%的患者鼻粘膜炎 完全治愈,而给安慰剂的只有%完全治愈。应用菠萝蛋白酶的%的患者 的呼吸系统改善,而接受安慰剂的只有%。没有使用抗生素而只用菠萝蛋 白酶治疗的患者,%完全治愈了鼻粘膜炎和呼吸困难。给予安慰剂的患者 中只有%治愈了鼻粘膜炎,%治愈了呼吸困难。菠萝蛋白酶对抗生素以 及其它药物的增强效应归功于菠萝蛋白酶能增强病变组织的通透性从而促 使 抗生素易于吸收到达感染部位。也有人认为应用菠萝蛋白酶可能使免疫系统 产生特殊物质,从而增加机体利用自身修复的资源酬。 在国内庞然【】用抗生素加用菠萝蛋白酶肠溶片治疗慢性前列腺炎疗效明 显优于单用抗生素。李伟华等【应用抗生素同时联合应用复方菠萝蛋白酶片 治 疗小儿肺炎,效果也明显优于只用抗生素的对照组。 ..在外伤方面的应用 菠萝蛋白酶在治疗外伤方面也有疗效。早期的临床试验曾将其用于消除 例拳击手的脸部瘀伤、眼眶、嘴唇、胸部和臂部等部位的血肿,每天给药 次,连续天或直至瘀伤消失,对照组的例拳击手给予安慰剂。在服用 菠萝蛋白酶的拳击手中例瘀伤于天内完全消失,其余的例于~ 天也完全恢复了。对照组中只有例在天内完全恢复,其余的需要~ 天才恢复【。 例手术前患者被分为两组。第一组例,术前小时,口服菠 萝蛋白酶每天次,术后小时继续服用;第二组例只在当天服用,术 前小时服用首剂。结果第一组中%和第二组中%的患者在小时内 疼痛和炎症完全消失,第一组中只有例疼痛和炎症超过小时,而第二组山东 大学硕士学位论文 中有人。第一组与第二组比较,疼痛完全消失的平均天数从.天减少到 .天,炎症消失的平均天数从.天减少到.天【。 例口腔手术患者在术前小时口服菠萝蛋白酶,每天次,在术后 小时%的病人只有轻微炎症或炎症消失,%的疼痛消失或有轻微疼痛; 而给予安慰剂的一组分别只有%和%。术后小时给药组疼痛消失或 有轻微疼痛的患者比例增加至%,而安慰剂组只增加到%。 对例骨骼肌系统有钝伤的患者进行观察研究,与常规治疗相比,个 平行试验结果表明:大剂量菠萝蛋白酶可以明显减轻水肿、静止疼、运动疼 及触别刈。 .药动力学与毒理学研究 一项对鼠灌胃给予菠萝蛋白酶的生物利用度试验表明【,灌胃给药,菠 萝蛋白酶由胃肠道吸收,给药小时后,循环系统中可检验到菠萝蛋白酶。 人口服菠萝蛋白酶.克,分天服用,药物平均半衰期为小时, 为. /。另一项随机、双盲、对照的临床研究表明,药物的活 性和是与服用剂量成比例的,菠萝蛋白酶主要是通过胃肠道以原型药 物的形式吸收【羽。 静脉给药小鼠的为 /.腹膜 /,家兔的为 内给药小鼠的.为./,大鼠的为./;灌胃给药小鼠 ’ 的 /,大鼠的 /。 对大鼠做的个月长期毒理试验研究表明,主要器官未见病理性变化。 静脉快速给药,血压下降约 ,分钟后恢复正常,心率升高约 次份钟,分钟后恢复正常,静脉慢速给药约分钟,血压未 发生变化。 .本课题的研究目的及内容 ..研究目的 日本产品菠萝蛋白酶软膏对家兔的?度烧伤动物模型具有良好的脱痂 作用,主要用于烫伤、褥疮,各种浅表性溃疡、挫伤、切开伤、切断伤、化 脓性创伤等情况下,创面坏死组织的分解,去除,脱痂等。在国内尚没有此 山东大学硕士学位论文 类产品,为能开发出用于治疗烧伤脱痂的相关产品,本研究将对国产菠萝蛋 白酶原料的组分及精制工艺进行研究并最终开发出治疗烧伤脱痂的产品。 ..研究内容 .对粗酶的精制工艺进行研究,生产出有较高活性的菠萝蛋白酶原料: .对菠萝蛋白酶进行组分分离,考察各组分的脱痂作用; .研究菠萝蛋白酶软膏生产工艺,动物实验考察菠萝蛋白酶软膏的药效。山东 大学硕士学位论文 第二章菠萝蛋白酶原料精制 本章研究目的是制备高活性菠萝蛋白酶原料,首先将国内市场可购买的菠 萝蛋白酶进行质量研究,选择合适的原料;然后根据不同的工艺分别精制原 料, 检测酶的酪蛋白水解活性,再通过优化工艺得出最佳精制工艺。 .菠萝蛋白酶原料的质量检查 目前国内菠萝蛋白酶生产厂家众多,多用于食品加工,产品生产工艺不同, 质量也不同,有药用文号的生产厂家共有个,但仅南京瑞尔制药有限公司有 产 品销售。为能够选择合适的原料,对市场购买的几个厂家的原料粗品按国家 药 品监督管理局国家药品标准.进行了质量对比研究。 ..实验仪器 电子天平,德国公司;计,梅特勒一托利多 仪器上海有限公司;电热恒温油浴锅,北京市永光明医疗仪器厂; .电热真空干燥箱,上海树立仪器仪表有限公司;.循环水式多用 真空泵,郑州长城科工贸有限公司;.台式高速离心机,上海医用分析 仪器厂. ..药品与试剂 菠萝蛋白酶:众缘生物科技有限公司,批号;南宁庞博生物工程, 批号;茂名市高活力蛋白酶有限公司, 批号;日本,批号 。酪氨酸:国药集团化学试剂有限公司,批号:。酪蛋白: 国药集团化学试剂有限公司,批号:。五氧化二磷:北京益利精细 化学品有限公司。实验用水为去离子水,其余试剂均为分析纯。 ..实验方法 按国家药品监督管理局国家药品标准【...对干燥失重、 炽灼残渣、砷盐、铁盐、效价酪蛋白水解活性等项目进行检查测定。山东大 学硕士学位论文 ..实验结果 根据国家药品监督管理局国家药品标准.,各厂家原料 的检验结果见表.。 表不同生产厂家菠萝蛋白酶的检验结果.菠萝蛋白酶原料精制 目前,国内外报道的菠萝蛋白酶精制提取脱痂组分的方法主要有硫酸铵 沉淀法、丙酮沉淀法】、超滤法及层析法【。本研究中对硫酸铵沉淀法 与丙酮沉淀法进行了试验。 ..仪器 紫外分光光度计, 电子天平,德国公司: 美国公司;计,梅特勒一托利多仪器上海有限公司; 电热恒温油浴锅,北京市永光明医疗仪器厂;电热真空干燥 箱,上海树立仪器仪表有限公司;?冷冻干燥机, , 英国;.台式高速离心机,上海医用分析仪器厂;透析袋, 美国。 ..药品与试剂 菠萝蛋白酶:茂名市高活力蛋白酶有限公司,批号。五氧化二磷: 北京益利精细化学品有限公司。实验用水为去离子水,其余试剂均为分析纯。 山东大学硕士学位论文 ..实验方法 ...硫酸铵沉淀法 称取粗品. 蒸馏水溶解,加依地酸二钠 ,?条件下用 和维生素各. /的溶液调至.,抽滤得澄清 ,再用 转/分离心分钟,收集沉淀置透 液,用%的溶液沉淀, 析袋中,放于?蒸馏水中透析小时,冷冻干燥,得精制样品。 丙酮沉淀法 称取粗品. ,加和维生素各. ,在?条件下用 蒸馏水溶解分钟,抽滤得澄清液,加入冷丙酮至浓度为%溶液沉淀,抽 滤,真空干燥,得精制样品。 ...效价测定 将以上两种方法精制得到的原料分别按国家药品标准... 中效价测定方法测定效价。 ..实验结果 两种工艺精制样品所测效价的结果见表. 表样品的效价测定结果 ?样品 效价/ 样品样品 结果表明:丙酮沉淀法比硫酸铵沉淀法所得样品的效价高。 .丙酮法精制菠萝蛋白酶工艺研究 本实验目的是通过单因素考察法确定丙酮沉淀法中最佳原料溶解浓度、 值和丙酮加入浓度。 ..仪器 电子天平,德国公司;计,梅特勒一托山东大学硕士学位论文 利多仪器上海有限公司;电热真空干燥箱,上海树立仪器仪表 有限公司。 ..药品与试剂 菠萝蛋白酶:茂名市高活力蛋白酶有限公司,批号。五氧化二磷: 北京益利精细化学品有限公司。实验用水为去离子水,其余试剂均为分析纯。 ..实验方法 ...原料溶解浓度 分别称取粗品.,. 和.,分别加和维生素各 、 和 蒸馏水溶解分钟,抽滤得澄清液, ,在?条件下用 加入冷丙酮至浓度为%溶液沉淀,抽滤,真空干燥,得精制样品?、?、 ?。。 ... 值 称取粗品份,每份各. ,分别加和维生素各 ,在? 条件下用 蒸馏水溶解,用和分别调值至.、.和., 溶解分钟后抽滤得澄清液,加入冷丙酮至浓度为%溶液沉淀,抽滤,真 空干燥,得精制样品?、?、?。。 ...丙酮浓度 称取粗品份,每份各. ,分别加和维生素各 ,在? 条件下用 蒸馏水溶解,溶液分别调至.,溶解分钟后抽 滤得澄清液,分别加入冷丙酮至浓度为%、%、%和%,沉淀,抽 滤,真空干燥,得精制样品。、、。和。 将以上所得样品分别称重,计算收率,按国家药品标准 ...方法测定效价。 ..实验结果 ...原料溶解浓度 不同溶解浓度样品所得收率及效价结果见表.。 山东大学硕士学位论文 表.不同浓度样品的收率及效价测定结果 由表.可见,样品浓度达到. /时,效价升高幅度开始变小,收率 也变小。 .. 值 不同溶解所得样品收率及效价结果见表。 表不同样品的收率及效价测定结果由表.可见,从.至.,效价变化较小,收率明显变小,这主要与其 等电点在.左右有关,而.以下却影响其活性。 ...丙酮浓度 不同丙酮浓度所得样品收率及效价结果见表?。由表可见,丙酮浓度增加 到%时,效价和收率不再增大. 表不同丙酮浓度的效价及收率测定结果 山东大学硕士学位论文 .讨论 由表可以看出,国内生产厂家的菠萝蛋白酶质量相差较大,经过了解, 不同生产厂家的生产工艺有所不同。众缘生物科技有限公司及南宁庞博生物工 程是用鞣酸吸附法工艺生产的,产品中炽灼残渣项目不合格,产品的水溶性较 差,导致效价偏低;茂名市高活力蛋白酶有限公司生产的菠萝蛋白酶是用采用 沉淀加超滤的工艺进行生产的,产品水溶性较好,外观、质量与日本原料相近, 效价较高。因此,我们选择茂名市高活力蛋白酶公司的菠萝蛋白酶作为粗品进 行精制研究。 硫酸铵能破坏蛋白质分子的水化层,又可中和蛋白质分子的电荷,可促进 蛋白质分子之间的聚集作用,使菠萝蛋白酶发生盐析。丙酮等有机溶剂可使蛋 白质等大分子溶解度降低而发生沉淀。通过对比两种方法,选择了用丙酮沉淀 方法精制样品,操作简单,所得样品效价高。 单因素法考察影响丙酮沉淀法精制工艺的三个因素,所得到的精制菠萝蛋 白酶的最佳工艺条件为:原料溶解浓度为 /,值为.,冷丙酮加入最 适浓度为%。山东大学硕士学位论文 第三章菠萝蛋白酶分离与体外溶痂研究 菠萝蛋白酶的组分复杂,已经有许多研究者用不同的方法对菠萝蛋白酶进 行分离和纯化,得到了单一组分,并且证明了其中某些组分在理化性质与药理 作用方面有特殊的性质。但目前文献中没有发现对其中各种组分的脱痂作用进 行详细的研究,为了得到对脱痂作用更加有效的菠萝蛋白酶原料,我们用葡聚 糖凝胶对菠萝蛋白酶进行了初步分离,并且对得到的不同分子量的组分进行了 体外的溶痂试验。进行以上试验的同时,对国产菠萝蛋白酶与日本产菠萝蛋白 酶的组分情况进行了对比研究. .菠萝蛋白酶的分离 ..仪器 电子天平,德国公司;计,梅特勒一托利多 仪器上海有限公司;电热真空干燥箱,上海树立仪器仪表有限公 司;.循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司:.台式高 速离心机,上海医用分析仪器厂;.自动液相色谱分离层析仪,上海沪西 分析仪器厂; 仪,重庆西川自动记录仪有限 公司;..型.垂直板电泳仪, 生物技术公司美国; 电泳电源,瑞典:岛津薄层扫描仪,一日本. ..药品与试剂 菠萝蛋白酶:批号,茂名市高活力蛋白酶有限公司;批号, 日本:葡聚糖凝胶.,上海生化制剂有限公司;酪氨酸,国药集团 化学试剂有限公司,批号:酪蛋白,国药集团化学试剂有限公司,批 号:低分子标准蛋白,中国科学院上海生化研究所;丙烯酰胺,国 药集团化学试剂有限公司,批号;亚甲基双丙烯酰胺,国药集团化学 试剂有限公司,批号;三羟甲基氨基甲烷,国药集团化学试剂有限公 司,批号:四甲基甲酰胺,公司,批号:十二烷 基硫酸钠,批号;其余试剂为分析纯。山东大学硕上学位论文 ..试验方法 ...原料的组分分离 凝胶柱填充【,加入蒸馏水。慢慢搅拌,置沸水浴中加 称取凝胶填料. 热时,轻轻搅动数次。室温放置,自然冷却。再于?冰箱放置冷却 至?,室温真空脱气分钟。 将凝胶面过多的水倾出,关闭层析柱出口,向层析柱柱直径 ,柱 长 中加入约/柱体积水,慢慢搅拌下将凝胶液连续倾入柱中,使其 自然沉降,待凝胶沉降约~ 后,打开柱出口,调节流速,使凝胶继续沉积, 待沉积的胶面上升至距柱顶端约 ,停止装柱,关闭出水口。在胶面上放一 尼龙滤布,防止加样品时凝胶面被冲起。 装柱后,凝胶柱用水平衡时以上,基线平整后,准备上样。 加样洗脱 称取国产菠萝蛋白酶 溶解,置离心机于 转/ ,加去离子水 分离心分钟,备用。 吸出层析柱内胶面上多余的液体,当液体与胶面相切时,沿管壁将离心后 的菠萝蛋白酶上清液 加到凝胶面上,调节流速使样品流入柱内。当样品溶 液与胶面相切时,再加水 ,重复以上步骤次。最后加水 ,连接好 蠕动泵,调整检测波长 ,流速. /分,?条件下用去离子水洗脱, /管收集洗脱液。 分别收集样品各组分,进行冷冻干燥。 将日本产菠萝蛋白酶原料按以上方法进行层析并记录色谱图。 将用丙酮精制的菠萝蛋白酶按以上方法进行层析并记录色谱图。 ...效价测定 按国家药品监督管理局国家药品标准对国产原料分离 后的各组分进行效价测定。 ... 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 试剂配制山东大学硕士学位论文 %丙烯酰胺溶液:取丙烯酰胺 与亚甲基双丙烯酰胺. ,加水至 ,滤纸过滤,避光保存。 分离胶缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷. ,加水 ,用盐酸调 至.,加水至. 浓缩胶缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷. ,加水 ,用盐酸调至 .,加水至。 电极缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷. 甘氨酸. , ,十二烷基硫酸 。 钠. ,加水至 固定液:称取三氯醋酸 溶解后,加甲醇 ,再加 ,加水 水至。 . 染色液:称取考马斯亮蓝 溶解后,加甲醇 ,加水 。 与冰醋酸 ,再加水至 ,加水至 ,充分混匀。 脱色液:取甲醇 ,冰醋酸 保存液:取冰醋酸 ,加水至 ,摇匀。 制胶 %分离胶制备:用%丙烯酰胺溶液.分离胶缓冲液%十二烷基硫 酸钠.%过硫酸铵溶液临配现用四甲基乙二铵一水.:..:.: .:.制成分离胶液,注入电泳槽至一定高度,用水封顶,聚合分 钟,倾去水层。 %浓缩胶制备:%丙烯酰胺溶液.分离胶缓冲液%十二烷基硫酸钠 .%过硫酸铵溶液临配现用.四甲基乙二铵一水.:.:.:.: .:.制成浓缩胶液,灌在分离胶上,并插入样品梳,聚合分钟, 老化分钟,除去样品梳和水. 样品溶液制备 样品溶解液的配制:%十二烷基硫酸钠 、巯基乙醇. 、溴酚 ,加重蒸水 蓝 三羟甲基氨基甲烷?盐酸溶液 、蔗糖、. 至 ,混匀。 样品溶液制备:分别称取菠萝蛋白酶国产原料与日本原料适量,各加样 品溶解液制成 /的溶液,在?沸水浴中保温分钟,冷却备用.山东大学硕士学 位论文 将层析分离后的国产原料各组分分别配制成样品溶液。 电泳 点样 ,进入分离胶时调至 ,电泳。电泳电压:浓缩胶中电压为 电压为 ,当溴酚蓝迁移胶底处,停止电泳。 固定与染色 电泳完毕后,取出胶片,置固定液中分钟固定,取出胶片,置染色液 中染色~小时,用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在保存液中。 按公式:相对迁移率条带迁移距离/染料前沿迁移距离,计算标准低子 分子蛋白及各组分的相对迁移率。并根据低分子蛋白的分子量组成计算出标 准蛋白相对迁移率与分子量的线性关系式。根据线性关系式计算各组分的分 子量。 ..试验结果 ...凝胶层析结果 不同样品的层析结果见图一~.。 图.国产菠萝蛋白酶层析图山东大学硕士学位论文 图.日本菠萝蛋白酶层析图 图.精制菠萝蛋白酶原料层析图 国产菠萝蛋白酶原料层析时根据样品 处的吸光度按照洗脱的先后顺 序分别收集,并分别命名为组分’、组分?’和组分?’,其中组分’包含了 个洗脱峰 。和’。 ...效价测定结果 国产菠萝蛋白酶原料用凝胶层析柱洗脱后收集的组分分别进行效价测 定,结果见表.。由表可见,三个组分的效价依次降低。东大学硕士学位论文 表.三个层析组分效价测定结果酶组分 效价/组分’组分’ 组分 ... .聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 本与国产原料电泳图谱见图.。 ~:国产原料;~:日本原料 图日本与国产原料电泳图谱 ? 国产原料各组分电泳图谱见图.。 ,:组分’:,:组分’::组分’ 图国产原料各组分电泳图谱 ?电泳结束后,测定低分子标准蛋白各条带的迁移率,计算标准蛋白相对山东 大学硕士学位论文 迁移率与分子量的线性关系,结果见表?. 表标准蛋白相对迁移率与分子量的线性关系线性回归得方程:.?.,.。 分别测定样品各条带的迁移率,根据线性关系式计算出国产菠萝蛋白酶原 料中各组分的分子量,结果见表?。 表样品各组分的相对迁移率及分子量 .体外溶痂试验 为了充分验证菠萝蛋白酶中各组分脱痂作用的大小,本研究参考陈世铭【 和等【醴的研究方法将菠萝蛋白酶中分离得到的个组分进行体外溶痂试 验。 ..仪器 电子天平,德国公司;电热恒温油浴锅,北京市 永光明医疗仪器厂;电子秒表,上海手表五厂.山东大学硕士学位论文 ..药品与材料 菠萝蛋白酶组分’、组分’、组分’,自制;豚鼠?度烧伤痂皮,山 东省医药工业研究所提供,剪成每块 大小皮块。 ..试验方法 将凝胶层析后得到的菠萝蛋白酶组分’、组分’和组分?’,分别称取 溶解,加热至?,将 ,置烧杯中,加水 豚鼠度烧伤 痂皮置于溶液中,保温,观察溶解情况,记录各溶液中痂皮溶解时间。 ..试验结果 表菠萝蛋白酶各组分溶痂时间;鸪 ;蛔, 组别 痂皮溶解时间/小时 .士. 组分’ .士. 组分’ .士. 组分?’ 体外溶痂试验结果表明,个组分均具有较好的溶痂作用,但溶痂时间随 着分子量减小而延长。 .讨论 一 范围 因葡聚糖凝胶柱.可用于分离分子量为 内的肽或蛋白质,分子量大小不同而表现出洗脱的快慢,分子量最大的蛋白 质应在第一峰出现,由图.与图.可以看出:日本及国产样品均在.小 时出现第一峰,出峰时间及峰的形状和面积非常相似。 .聚丙烯酰胺凝胶电泳可使蛋白质与形成复合物,使复合物在凝 胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状影响,而只是与其相对分子 质量的函数有关,因此可用来测定蛋白质的分子量。国产与日本产菠萝蛋白 酶原料在电泳图谱中色带的位置及数目一致,结合前面的层析结果,可以得 出国产与日本菠萝蛋白酶的所含组分一致的结论。 精制后的菠萝蛋白酶原料也有个洗脱峰出现,但是它的第个洗脱峰山东大学 硕士学位论文 吸收较大,而第峰吸收值相对较小,说明精制后样品的组分发生了变化。 根据图.计算出的分子量结果表明,用凝胶层析分离出的个组分组 , 分’、组分’和组分?’,组分’与组分?’分子量分别为 和 组分’包含洗脱峰’。和’,分子量分别为 和,特别是组分’ 的分子量与国内外许多人的测定的分子量结果相似【?。 葡聚糖凝胶柱.层析后收集得到的个组分以酪蛋白为底物 测定的效价随着分子量减小而降低,这与有些文献中的报道相一致闭。皮肤 干重的%%是胶原蛋白,胶原蛋白在加热情况下变性成为明胶,菠萝 蛋白酶对明胶有较好的分解活性,其活性的大小与菠萝蛋白酶对酪蛋白水解 活性大小成正比 嗍。因此我们认为菠萝蛋白酶对酪 蛋白水解活性大小可作为评价溶痂作用的重要质量指标。 如上所述,菠萝蛋白酶对烧伤后皮肤具有较强的溶解活性,我们推断这 是菠萝蛋白酶脱痂的机理,而掣蚓应用菠萝蛋白酶对冻伤皮肤进行的脱 痂试验也表明,正是由于其组织中没有胶原蛋白的变化,所以不能产生脱痂 作用。 用葡聚糖凝胶柱层析后收集的个组分的体外溶痂试验结果表明,个组 分均具有较好的溶痂作用。严等也认为菠萝蛋白酶中具有脱痂作用的 不是单一的组分,因此,通过精制除去原料中的其它蛋白质,特别是起到抑 制酶活性的物质,就可得到具有良好脱痂作用的酶。 山东大学硕士学位论文 第四章菠萝蛋白酶软膏的制备及质量控制 菠萝蛋白酶可作为化学脱痂剂,用于烧烫伤、褥疮、各种表面溃疡、切 开伤及化脓等创面的坏死组织去除、脱痂、伤口净化,并促进愈合,具有作 用迅速、对正常组织无作用、无全身副作用、不增加感染和并发症等优点, 已在日本等国家的临床上被广泛应用。目前在国内尚没有此类制剂上市,本 章主要研究制备了菠萝蛋白酶软膏,对其质量情况进行研究,并进行了稳定 性考察。 .材料 ..仪器 紫外分光光度计, 电子天平,德国公司; 美国公司;计,梅特勒一托利多仪器上海有限公司; 电热恒温油浴锅,北京市永光明医疗仪器厂;一型澄明度检测仪, 天津大学精密仪器厂;型生化培养箱,上海跃进医疗器械厂。 ..药品与试剂 菠萝蛋白酶,茂名市高活力蛋白酶有限公司,批号:聚乙二醇 ,南京威尔化工有限公司,批号;聚乙二醇, 南京威尔化工有限公司,批号::酪氨酸,国药集团化学试剂有限 公司,批号:;酪蛋白,国药集团化学试剂有限公司,批号: ;其余试剂为分析纯。 .软膏的制备 ..处方筛选 按表.中的处方分别称取和及用灭菌后的菠萝 蛋白酶原料。山东大学硕士学位论文 表菠萝蛋白酶软膏个不同处方 将和处方量%的,加入到 锥形瓶中,混合, 放入?水浴锅中灭菌小时,放冷至?,保温备用。 锥形瓶中,经?灭菌小时, 处方量的,加入到 放冷至室温,加入菠萝蛋白酶,搅匀,得酶悬浮溶液。将酶悬浮液倒入保温 的和混合液中,混和均匀,然后将软膏装入 灭菌铝管 中,封口。 ..处方筛选结果 软膏剂稠度的测定用插度计来测量。在?将插度计中重量为 的 金属锥体的锥尖放在试品的凝固表面上,然后使锥体在秒内自由垂直落入 试品中,以插入的深度评定供试品的稠度,以. 的深度为个单位,称 为插入度。不同处方样品的外观及稠度的测定结果见表。 表不同处方的软膏的外观与稠度测定结果由表.可知:与的比例为:即处方时, 软膏 的稠度适中,低于此比例时,即含量高,软膏稠度较大,高于此比 例,稠度较小。山东大学硕士学位论文 .质量控制 ..样品 按..中处方。制备三批软膏,批号分别为.、、 .。 ..性状 观察批样品,均为浅黄色软膏,故本品性状为浅黄色软膏。 ..鉴别 ...鉴别方法 参照国家药品标准...菠萝蛋白酶鉴别项下操作,因本品 为软膏制剂,基质溶于水,故按以下操作进行鉴别。 取本品适量约. 溶解,置大试管中,加%脱脂奶粉取 ,加水 脱脂奶粉 ,加水 使溶解成乳液,用稀醋酸调节值至.,加水稀释至 ,置?水浴中,乳液 应在分钟内凝固。以水 为空白,同法操作,乳液应不凝固。 ...辅料影响 取本品处方量的辅料适量约. 溶解,按以上方法试 ,加水 验,结果乳液不凝固,说明菠萝蛋白酶软膏所含辅料对其鉴别反应无影响。 ..检查 按中国药典年版二部附录 软膏剂的要求,进行以下几项的检查。 ...粒度 取适量的供试品,涂成薄层,薄层面积相当于盖玻片面积,共涂三片, 照中国药典年版二部附录?第一法检查,符合规定。 ...装量 照中国药典年版二部附录 最低装量检查法检查,符合规定。山东大学硕士学 位论文 ..无菌 照中国药典年版二部附录?无菌检查法进行检查,结果符合规 定。 ..效价测定 本品的效价参照国家药品标准.菠萝蛋白酶的效价测定 项下的方法。因本品基质溶于水,主药菠萝蛋白酶也溶于水,故按以下方法 进行效价测定。 对照品溶液的制各:取?干燥至恒重的酪氨酸适量,精密称定,加 . /盐酸溶液制成每 中约含嵋的溶液。 供试品溶液的制备:取本品适量,精密称定,用盐酸半胱氨酸缓冲液取 盐酸半胱氨酸. 溶解,另取依地酸二钠. ,加水 ,加水 溶解,合并两液混匀,用. /氢氧化钠溶液调节至.,加水稀释至溶解并稀释制成每 含~菠萝蛋白酶单位 的溶液。 测定法:精密量取供试品溶液. ,置具塞试管 中, 于:.?水浴预热分钟,精密加入士.?预热的底物溶液取硅胶干 燥器中干燥至恒重的酪蛋白. /磷酸 ,精密称定,置烧杯中,加. 氢二钠溶液 ,水浴中加热溶解,放冷,用 /盐酸溶液调节值 ,立即振摇, 至.,转移至 量瓶中,加水至刻度,临用新配. 置:.?水浴中准确反应分钟后