口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定_30530

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定_30530 口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定 [标签:来源] 作者:田美娜, 李永亮 卢曾军, 付元芳, 袁明, 刘湘涛, 刘在新 【摘要】 目的: 制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb)。方法: 以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆, 直至所克隆的细胞能够100,的分泌抗体, 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定。结果: 免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选, 共获得5株抗pET28a3D的mAb, 其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b, 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位。Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK21细胞中的3D抗原均特异性结合, 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白。结论: 成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb , 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础。 【关键词】 口蹄疫病毒; 非结构蛋白3D; 单克隆抗体; 原核表达 口蹄疫(footandmouth disease, FMD) 是由口蹄疫病毒(footandmouth disease virus, FMDV)引起的偶蹄动物的急性、 热性、 高度接触性传染病, 世界动物卫生组织将其列为A类传染病之首, 该病一经暴发就会给畜牧业生产造成巨大的经济损失, 严重影响了政治、 经济的稳定发展, 世界各国都高度重视对该病的防控, 完善的诊断和检测技术体系是控制和消灭该病的关键。检测非结构蛋白抗体的ELISA方法不受血清型限制, 因此在疫情普查、 筛查感染动物、 防制效果评价和恢复无FMD状态等方面具有重要的应用。 FMDV的3D蛋白是具有469个氨基酸的病毒RNA依赖的RNA聚合酶, 又称病毒感染相关性抗原, 没有型特异性, 在FMDV所有非结构蛋白中, 3D抗原性最好, 检测3D的ELISA方法具有与检测结构蛋白的ELISA方法相当的特异性、 准确性和敏感性, 是评价动物是否接触过抗原的重要指标, 在检测中具有重要的应用前景,1-4,。 本实验利用原核表达的3D蛋白制备单克隆抗体(mAb), 为建立更为完善的ELISA诊断方法和检测技术以及进一步研究3D蛋白的结构和功能提供基础资料。 1 材料和方法 1.1 材料 O/China99口蹄疫病毒、 BHK21细胞株、 牛抗FMDV高免血清均为本实验室保存, Sp2/0骨髓瘤细胞为兰州市市肿瘤医院惠赠, 3D蛋白原核表达重组菌由刘湘涛研究员惠赠, SPF级雌性3,4周龄BALB/c小鼠购自兰州生物所, 福氏佐剂、 聚乙二醇(PEG)1450溶液、 HAT、 HT 以及四甲基联苯胺(TMB)、 HRP 标记羊抗小鼠总IgG、 mAb亚型鉴定试剂盒均为Sigma 产品; RPMI1640 培养基、 新生牛血为Hyclone公司产品, FITC标记羊抗小鼠IgG购于KPL公司, HI Trap rProtein G FF, 1 m蛋白纯化柱为Amersham公司产品, NiNTA Purification System购于Invitrogen公司, 其他试剂均为进口分装或国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 重组pET28a3D蛋白的表达、 纯化及活性鉴定 按文献,5,所述方法表达3D蛋白, 将可溶性表达的3D蛋白按NiNTA Purification System操作说明书进行纯化, 用SDSPAGE电泳鉴定纯化产物的纯度, 用Western blot鉴定其特异性。Western blot方法参照文献,6,进行: 以牛抗FMDV高免血清为一抗, Sigma公司辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG为二抗, DAB染色。 1.2.2 3D mAb的制备 (1)小鼠免疫: 取纯化的抗原按100 μg/只加等体积弗氏完全佐剂背部皮下注射, 2周后用弗氏不完全佐剂第2次免疫, 剂量、 注射部位同前, 2周后以不加佐剂的等量抗原于后肢内侧皮下注射, 1周后采尾静脉血测抗体效价, 取抗体水平较高的小鼠于1周后尾静脉加强免疫1次, 在此之后第3天融合。(2)阳性杂交瘤细胞株的建立: 采用常规的PEG融合的方法取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合。用纯化的重组pET28a3D蛋白包被聚苯乙烯板, 取融合后第10,15天的细胞培养上清进行间接ELISA检测, 选择检测结果为强阳性的克隆扩大培养, 同时用有限稀释法至少连续克隆3,5次, 直至所克隆的细胞能够100%分泌抗体。将能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞扩增培养后, 冻存于液氮中。 1.2.3 腹水的制备 将0.5 mL降植烷注射到10周龄左右的健康雌性BALB/c小鼠的腹腔, 1周后注入106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔, 7,10 d后, 当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水, 4?, 12 000 g离心10 min后, 0.45 μm滤器过滤后用G蛋白柱纯化, 加500 mL/L甘油分装备用。 1.2.4 mAb效价滴定 间接ELISA方法鉴定, 用纯化的pET28a3D抗原包被ELISA板, 腹水从100倍开始做梯度稀释, 同时以Sp2/0腹水做同等稀释度对照。 1.2.5 mAb的生物学特性鉴定 (1)亚型鉴定: 用IgG亚类鉴定试剂盒Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Sigma公司)鉴定, 按说明书中的捕获ELISA方法操作。(2)稳定性测定: 将阳性杂交瘤细胞体外连续传代培养3个月, 每隔10 d检测1次细胞上清液的ELISA抗体效价。同时分别复苏冻存1个月, 2个月, 3个月的阳性杂交瘤细胞, 用间接ELISA法测定细胞培养上清的抗体效价。(3)mAb的位点分析: 用ELISA叠加实验进行位点分析。用纯化的重组pET28a3D蛋白包被聚苯乙烯板, 加入100 μL mAb1, 37?, 1 h, 洗涤3次, 加入100 μL mAb2, 37?, 1 h, 洗涤3次, 加入羊抗鼠IgGHRP, 37?, 1 h, 洗涤5次, 加入底物显色, 终止反应后测定A值。按照如下公式计算叠加率AI: AI=,A(1+2)-A1,/A2×100%。式中A1为mAb1的A值, A2为mAb2的A值, A(1+2)为mAb1叠加mAb2的A值。若AI>10,, 说明被测的2株mAb的抗原结合位点不同, AI?10,则结合位点 相同或相近。(4)特异性鉴定: ?Western blot: 将原核表达的pET28a3D蛋白和灭活的O/China99株感染的BHK21细胞裂解液分别进行SDSPAGE电泳, 然后按常规方法转印到硝酸纤维素膜光滑面上, 将膜置于封闭液中, 4?, 过夜, PBST洗涤5次后分别置于5株杂交瘤细胞上清中, 设置阳性对照(免疫鼠血清)、 阴性对照(正常鼠血清), 37?作用1 h, PBST洗涤5次, 置于工作浓度的HRP标记羊抗鼠IgG溶液, 37?作用1 h, PBST洗涤5次, 最后用TMB避光显色, 水洗终止反应。?间接免疫荧光: 接种FMDV O/China99于长满单层的BHK21细胞, 50 mL/L CO2、 37?培养10 h, 弃去上清, 用洗涤液(PBS10 g/L BSA)洗涤1次, 37 g/L多聚甲醛室温固定10 min, 洗涤3次; 加入50 mmol/L NH4Cl, 室温作用10 min, 充分洗涤, 吸干残液; 加入杂交瘤细胞培养上清, 37?作用1 h, 洗涤3次, 吸干残液; 加入工作浓度的羊抗鼠IgGFITC, 37?作用1 h, 洗涤3次, 加200,300 μL 20 mL/L甘油PBS, 荧光显微镜下观察, 同时设立BHK21细胞作为阴性对照。 2 结果 2.1 重组pET28a3D蛋白的纯化及活性鉴定 纯化蛋白经SDSPAGE分析, 在相对分子质量(Mr)约44 000处有一条明显的蛋白带(图1A), 与预期相符, 并且无明显的杂带, 这说明提纯的抗原较纯。Western blot结果显示, 纯化的原核表达抗原能够很好的识别FMDV感染的动物血清, 具有良好的反应性(图1B)。图1 3D蛋白的纯化及活性鉴定 A: 3D融合蛋白的SDSPAGE纯度鉴定; B: 3D蛋白的活性鉴定. M: 蛋白markers; 1: 纯化的pET28a3D蛋白; 2: pET28a3D蛋白的Western blot分析. 2.2 pET28a3D蛋白mAb杂交瘤细胞株的建立 以表达的重组蛋白免疫小鼠, 经细胞融合及5次克隆化, 阳性率达到了100%, 共得到5株稳定分泌抗3D蛋白的杂交瘤细胞株, 分别命名为: 1A6、 1B2、 1E5、 7H4和7C2。 2.3 抗体效价滴定结果以及亚类鉴定 结果如表1所示, 5株mAb的腹水抗体效价均高于105, 达到mAb腹水制备的要求。表1 mAb效价测定及亚类鉴定结果 2.4 mAb的生物学特性鉴定 2.4.1 稳定性鉴定 连续传代培养和按期复苏的杂交瘤细胞, 其上清的抗体效价一直稳定, 表明杂交瘤细胞能稳定分泌mAb。 2.5.2 位点叠加分析 表2结果显示, 其中1B2、 1E5、 7C2之间的叠加值均小于10,, 为识别同一个表位的抗体, 1A6和7H4与以上3株抗体的叠加值均大于或接近于10%, 识别不同或相近的表位, 且mAb1叠加mAb2与mAb2叠加mAb1的AI值相差较大, 但表位判定结果一致。表2 5株mAb位点叠加分析结果 2.5.3 特异性鉴定 (1)Western blot: 图2所示, 在Mr约44 000处有一条明显的蛋白带, 这表明所筛选出的5株mAb能与原核表达的3D蛋白发生特异性反应; 图3中在Mr约52 000和72 000处各存在明显的蛋白带, 分别与自然的FMDV 3D和3CD蛋白大小相符(2)间接免疫荧光: 在FMDV感染的BHK21细胞细胞质中均检测到很强的荧光(图4), 而未感染FMDV的细胞检测结果为阴性, 这与GarcíaBriones等,7,所得结论一致。 3 讨论 高度纯的抗原是获得特异性mAb和提高筛选阳性率的关键。原核表达系统虽然没有蛋白 翻译后的糖基化、 磷酸化等加工修饰过程, 不能完全反应蛋白的天然构象, 但是由于原核表 达系统操作简便、 重组蛋白产量高、 可以使用配套纯化方法对重组蛋白进行高度纯化等诸 多优点, 而且目前许多实验室已经利用原核表达的抗原成功的制备了能够识别自然蛋白的 mAb,8, 9,, 因此, 本试验采用原核表达的重组3D蛋白免疫小鼠。 本实验在制备mAb 的基础上利用叠加ELISA进行了抗原表位的初步研究, 若两种mAb的结合位点较远, 则将无 干扰现象, 若结合位点较近或存在部分重叠, 则有干扰现象。运用叠加ELISA分析, 初步判 定这5株mAb中有2株为同一表位, 其他为不同表位, 且mAb1叠加mAb2与mAb2叠加mAb1 的A值基本相近, 虽然所测AI值差别比较大, 但表位判定结果基本一致。 本实验的目的是制备能识别自然3D蛋白的mAb, Western blot和间接免疫荧光结果显示 所制备的5株mAb不但能与原核表达的3D蛋白特异性的结合, 而且能与自然3D蛋白发生特 异性的结合, 这为我们建立基于mAb的间接捕获ELISA或竞争ELISA诊断方法、 研发新型的 多重NSP抗体荧光检测技术以及进一步研究FMDV 3D的功能、 揭示FMDV的致病机制提供重 要工具。 【参考文献】 ,1, 谢庆阁.口蹄疫 ,M,. 北京: 中国农业出版社, 2004: 30-115. ,2, Clavijo A, Hole K, Li M, et al. Simultaneous detection of antibodies to foot andmouth disease nonstructural proteins 3ABC, 3D, 3A and 3B by a multiplexed Luminex assay to differentiate infected from vaccinated cattle,J,. Vaccine, 2006, 24(10): 1693-1704. ,3, Clavijo A, Wright P, Kitching P. Developments in diagnostic techniques for differentiating infection from vaccination in footandmouth disease,J,. Veteri J, 2004, 167: 9-22. ,4, Yang M, Clavijo A, Li M, et al. Identification of a major antibody binding epitope in the nonstructural protein 3D of footandmouth disease virus in cattle and the development of a monoclonal antibody with diagnostic applications,J,. J Immunol Methods, 2007, 321(1-2): 174-181. ,5, 韩雪清, 刘湘涛, 林祥梅, 等. 口蹄疫病毒3D蛋白在体外的表达纯化及二级结构分析 ,J,. 微生物学杂志, 2005, 25(5): 6-11. ,6, 郭尧军.蛋白质电泳实验技术,M,. 2版. 北京: 科学出版社, 2005: 257-265. ,7, GarcíaBriones M, Rosas María F, GonzálezMagaldi M, et al. Differential distribution of nonstructural proteins of footandmouth disease virus in BHK21 cells,J,. Virology, 2006, 349(2): 409-421. ,8, 李 潇, 周 荣, 盛慧英, 等. 诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初步应用,J,. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 25(8): 801-803. ,9, 杨 凡, 刘朝奇, 柳发勇, 等. HIV1病毒Nef基因克隆、 表达、 纯化及其抗体的制备,J,. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 25(7): 703-706.