发情周期不同时期猪卵泡颗粒细胞凋亡的观察（可编辑）

发情周期不同时期猪卵泡颗粒细胞凋亡的观察（可编辑） 发情周期不同时期猪卵泡颗粒细胞凋亡的观察 动物学报 48 6 :759~763 , 2002 A cta Zoologica S inica 3 发情周期不同时期猪卵泡颗粒细胞凋亡的观察 ? ? ? ? ? ?? 33 刘忠华 马所峰 岳奎忠 刘海兰 陈清轩 谭景和 ?东北农业大学生命科学学院 , 哈尔滨 150030 ?中国科学院遗传与发育研究所 , 北京 100080 ?山东农业大学动物科技学院 , 泰安 271018 摘 要 为探讨猪发情周期不同时期卵泡发育和闭锁的规律及机理 , 本实验通过 TUN EL 原位标记、H. E. 染色 以及放射免疫测定等手段研究了猪发情周期不同阶段卵巢表面各类卵泡数量的变化、各类卵泡中颗粒细胞的凋 亡比例、闭锁卵泡的形态变化以及发情周期各阶段血清孕酮及雌二醇水平的变化等问题。卵泡的总数在发情间 期最多 , 为 2618 个/卵巢 , 发情期最少 , 为 714 个/卵巢。小卵泡的数量在发情间期最多 , 为 15 个/卵巢 , 在发 情期数量最少 , 为 517 个/卵巢。中等卵泡数量在发情间期最多 , 为 815 个/卵巢 , 在发情后期卵巢中无中等卵 泡。大卵泡的数量在发情前期最多 , 为 714 个/卵巢 , 在发情后期最少 , 为 0 个。小卵泡的颗粒细胞凋亡比例 各时期平均 21103 % 显著高于大卵泡 , 在发情后期显著降低。中等卵泡的颗粒细胞凋亡比例 平均 1616 % 在发情前期显著低于其它各期。大卵泡的颗粒细胞凋亡比例 平均 1112 % 在发情周期各阶段无显著差异 , 均 显著低于中等卵泡和小卵泡。 关键词 猪 发情周期 卵巢 卵泡闭锁 细胞凋亡 哺乳动物在达到性成熟以后 , 每个发情周期中 1 与方法 卵巢上的卵泡都发生周期性的生长发育和闭锁变 化 , 研究这种变化规律对于人为控制动物繁殖具有 111 发情周期各时期的划分 重要意义。早期人们曾从普通生理学的角度对各种 实验动物为大庆采油二厂机械化养猪场的性成 动物发情周期中的卵泡发育和闭锁规律及其与内分 熟育肥母猪 , 品种为长白猪与哈白猪的杂交一代。 泌的关系做过研究 Irealand , 1987 。近年来的研 每日早 6 点晚 5 点 2 次观察并母猪的发情情 究表明一些生殖系细胞的退化主要是以细胞凋亡方 况 , 选择发情周期正常者用于实验。发情周期各时 式进行的 石 磊等 , 2000 ; 张 健等 , 2001 , 其 期的划分方法是 : 1 观察到外生殖器红肿 , 有较 中就包括卵泡闭锁过程中颗粒细胞的退化过程。随 多粘液流出 , 食欲下降或拒食 , 爬跨其它母猪 , 按 着研究工作的广泛进行人们发现卵泡闭锁的生理机 压后躯出现静立反射的定为发情母猪 ; 2 发情当 制实质就是颗粒细胞凋亡 Jolly et al, 1994 ; 日记为 0 天 , 第 3 天定为发情后期 ; 3 第 11、 William , 1995 ; Miki et al, 1998 , 于是人们对 12 和 13 天的母猪为发情间期的代表 ; 4 预计下 卵泡的生长发育和闭锁与发情周期之间的关系从颗 次发情周期开始的前 2 天定为发情前期。 粒细胞凋亡的角度重新进行了深入的研究。然而 , 112 卵巢的获取及处理方法 这些研究多数都集中于实验动物和以产单胎为主的 猪在早晨 5 点左右屠宰后立即开腹取出卵巢并 家畜上 , 在猪这种产多胎的家畜上 , 进行的研究则 置于灭菌生理盐水中带回实验室。每头猪的两个卵 较少。为此 , 本次实验以育成母猪为实验材料 , 以 巢随机取一个用 10 %中性甲醛固定 , 24 h 后取出 颗粒细胞凋亡为衡量标准 , 观察了发情周期不同时 用刀片分割成 5~8 mm 小块 , 再重新固定 24 h。 期卵巢上卵泡发育、闭锁和卵泡颗粒细胞凋亡的情 另一个卵巢用于颗粒细胞涂片。 况 , 期望能够发现卵泡发育、闭锁与颗粒细胞凋亡 113 卵泡的分类、计数和颗粒细胞的获取 之间的内在相关性 , 并进而为人为控制猪的繁殖提 将用于颗粒细胞涂片的卵巢上的卵泡按直径大 供理论依据。 小分为大卵泡 ?5 mm , 中卵泡 3~5 mm 和 2001208222 收稿 , 2002204210 修回 3 国家重点基础研究发展规划 973 项目 No. G200016107 和国家自然科学基金 No. 30070556 资助 33 通信作者 第一作者简介 刘忠华 29 岁 博士 , 讲师 , 现工作于东北农业大学。Liu086 @yahoo. com760 动 物 学 报 48 卷 小卵泡 ? 3 mm 并分别计数。用 5 ml 注射器分 2 结 果 别抽取三类卵泡的卵泡液 , 置 115 ml 离心管中 211 发情周期不同阶段卵巢表面各类卵泡数量的 1 200 r/ min离心 2~3 min 后弃上清液 , 剩余沉淀 变化 加入少量 PBS后轻轻吹打形成颗粒细胞悬液。 实验对发情前期、发情期、发情后期和发情间 114 卵巢石蜡切片 H. E. 染色及 TUNEL 原位检 期母猪卵巢上各类卵泡的数量进行了统计 , 结果见 测 表 1。 H. E染色按常规方法进行。TUN EL 原位检测 各类卵泡的总数在发情间期最多 , 为 2618 个/ 采用细胞凋亡原位检测试剂盒 In sit u cell death 卵巢 , 发情期最少 , 为 714 个/卵巢。小卵泡的数 detection kit Boehringer Mannhaim 公司 , 按试 量在发情间期最多 , 为 15 个/卵巢 , 在发情期数量 剂盒说明进行操作。二甲苯脱蜡后逐级乙醇复水 最少 , 为 517 个/卵巢。中等卵泡数量在发情间期 μ ?滴加 Proteinase K 20 g/ ml , 用 Tris2HCl 配制 , 最多 , 为 815 个/卵巢 , 在发情后期卵巢中无中等 p H 714~810 室温孵育 30 min ?PBS洗涤 3 次 , 卵泡。大卵泡的数量在发情前期最多 , 为 714 个/ 013 % H O 室温封闭 1 h ?PBS 洗涤 3 次 , 滴加 2 2 卵巢 , 在发情后期最少 , 为 0 个。 011 % Triton , 4 ?2 min ?PBS洗涤 3 次 , 吸干样 品周围液体 , 滴加 50μl TUN EL 反应液 , 37 ?, 表 1 猪发情周期不同阶段卵巢中各类卵泡数量 μ Table 1 Number of follicles with different diameters 湿盒内孵育 1 h ?PBS洗涤 3 次 , 滴加 50 l Con2 at different stages of the estrous cycle verter2POD , 37 ?, 湿盒孵育 30 min ?PBS洗涤 3 卵泡数量 个/ 卵巢 次 , 滴加 DAB 反应液 , 室温 , 暗盒中显色 3~ 5 实验用 Number of follicles per ovary 发情时期 猪数 min ?PBS洗涤 3 次 , 盖玻片封片。如需苏木精复 总数 小卵泡数 中卵泡数 大卵泡数 Stage of cycle Number 染则于 DAB 显色后经 PBS洗涤 , 直接置于苏木精 total small middle large of sows 中复染 3~5 min , 分色 , 脱水后封片观察。 发情前期 2 2216 1018 414 714 115 颗粒细胞涂片的 H. E. 染色 Proestrus 发情期 将颗粒细胞悬液置离心管中 , 加入等量的 4 % 5 714 517 017 1 Estrus 多聚甲醛固定液预固定 20 min ?涂片 , 室温风干 发情后期 4 13 13 0 0 ? 4 %多聚甲醛固定液室温固定 20~30 min ?PBS Metestrus 发情间期 洗涤后入苏木精染色 3~5 min ?按常规染色程序 6 2618 15 815 3. 1 Diestrus 继续进行 , 伊红复染时间为 1~2 min。 116 颗粒细胞涂片 H. E. 染色后健康细胞与凋亡 212 发情周期不同阶段卵巢表面各类卵泡中颗粒 细胞判定标准及凋亡细胞比例计算 细胞的凋亡比例 健康细胞 : 细胞边界清晰 , 能清晰区分核与胞 实验对各类卵泡颗粒细胞的涂片经 H. E. 染 质 , 核质比例正常 , 细胞核染色均匀。 色后 , 以形态学特征为判断标准 , 分别计数了各类 凋亡细胞 : 细胞形态不规则 , 细胞核染为深紫 卵泡的颗粒细胞凋亡比例。结果显示小卵泡的颗粒 色 , 并且呈现多种形状 , 如椭圆形和半月形等 , 严 细胞凋亡比例显著高于大卵泡 , 发情后期显著降 重者表现为质膜包被浓染核物质形成的凋亡小体 , 低 , 而在发情周期的其它各阶段波动较小 表 2 ; 胞质有时可见到空泡。 中等卵泡的颗粒细胞凋亡比例也较高 , 发情前期显 凋亡细胞比例计算 : 分别计数不同时期各类卵 著 P 0101 低于发情间期 ; 大卵泡的颗粒细胞 泡颗粒细胞涂片中健康和凋亡细胞数量 , 每个载玻 凋亡比例在发情周期各阶段无显著差异 , 均显著 片计数 500 个细胞 , 每类卵泡颗粒细胞涂片计数 3 P 0101 低于中等卵泡和小卵泡。 张载玻片 , 然后取凋亡细胞比例的平均值作为此类 213 发情周期不同阶段卵巢切片检测卵泡闭锁及 卵泡的颗粒细胞凋亡比例。 颗粒细胞凋亡结果 117 数据处理 实验通过 H. E.及 TUN EL 原位标记法对发情 使用 SPSS软件 , 采用单因素方差分析进行差 周期各阶段的卵巢切片进 行了检测。结果发现 , 小 异显著性检验。 卵泡闭锁时颗粒细胞脱落入卵泡腔 , 细胞核深染 ,6 期 刘忠华等 :发情周期不同时期猪卵泡颗粒细胞凋亡的观察 761 严重者颗粒层已基本消失。在 TUN EL 标记切片 在卵泡期排卵卵泡的迅速生长可抑制后继卵泡的发 中 , 闭锁卵泡颗粒细胞多呈棕黄色 , 表明其为凋亡 育启动 Robinson et al, 1951 , 因此造成卵巢上 细胞 , 而健康卵泡颗粒细胞及卵巢其它组织则呈淡 小卵泡数量减少 , 进而造成卵巢上卵泡总数的下 紫色 , 表明为健康细胞。中等卵泡也发生类似变 降。我们的实验结果与这些研究结果是一致的。 化。由于切片的组织块不能太大 , 所以大卵泡一般 本研究中 , 小卵泡的颗粒细胞凋亡比例在周期 只能在切片上显示出部分结构。可以见到大卵泡颗 各阶段均显著高于大卵泡 , 表明这类卵泡很容易发 粒层较薄 , 约为 3~4 层颗粒细胞 , 细胞之间及与 生闭锁。中等卵泡的凋亡比例在发情间期也较高 , 基膜之间结合紧密。TUN EL 标记多数细胞呈淡紫 但在发情前期显著降低 , 表明此时它们发育成排卵 色 , 表明其生理状态良好 图版 ? 。 卵泡的可能性在增大。大卵泡在周期各阶段 , 只要 是存在 , 颗粒细胞凋亡比例均很低 , 说明这类卵泡 表 2 发情周期不同阶段卵巢上各类卵泡 闭锁的趋势较小。Dalin et al1987 的研究发 颗粒细胞凋亡比例 现 : 在猪发情周期的 6~14 d , 卵巢中 2199 mm 以 Table 2 Rate of apoptotic granulosa cells in follicles with different diameter at differtent estrus stage 下卵泡的闭锁比例大约 50 % , 3100~3199 mm 卵 各类卵泡颗粒细胞凋亡比例 泡的闭锁比例大约在 37 % , 而大于 4 mm卵 泡未观 Rate of apoptotic cells in follicles 察到闭锁现象。Grant et al1989 研究认为 , 发情时期 of different sizes % stage of estrous cycle 猪卵巢在卵泡期 发情周期 16~20 d , 随着排卵 小卵泡 中卵泡 大卵泡 卵泡的生长 , 小卵泡闭锁比例增加。而 Miki et alSmall follicle Medium follicle Large follicle a bc c 1998 通过对猪闭锁卵泡的超微结构研究证明 , 发情前期 Proestrus 2316 1215 1113 a b c 闭锁卵泡中存在大量的凋亡颗粒细胞。综合上述研 发情期 Estrus 2119 1615 1114 b 究结果以及我们的实验可以看出 , 颗粒细胞凋亡是 发情后期Metestrus ? ? 1814 a a c 猪卵泡闭锁的根本原因 , 凋亡细胞的比例增加到一 发情间期Diestrus 2012 2017 1116 定程度就会体现为卵泡的闭锁。 同一列中具不同上标的数据之间有显著性差异 The different 判断卵泡闭锁的传统形态学检测方法的优点是 superscripts in the same coloum indicate significant difference P 0105 具体指出某个卵泡是健康还是闭锁 , 但其缺点是主 观性较大 , 只能区分出闭锁还是健康两种生理状 态 , 而对于一些处于中间状态的卵泡则不易判断 , 3 讨 论 因此其结果有时可能并不完全可靠。例如 , Dalin 本实验证明 , 猪卵巢表面各类卵泡数量随发情 et al1987 发现 , 3100~3199 mm 卵泡的闭锁 周期的进行而改变。分析实验结果可以看出 , 造成 比例为 37 % , 而大于 4 mm的卵泡未见闭锁。而我 卵泡总数变化的主要原因在于小卵泡数量的变化。 们通过颗粒细胞凋亡判断卵泡闭锁 , 就避免了这种 早期的研究表明 , 猪卵巢中排卵卵泡的募集 re2 现象。对比我们实验中颗粒细胞凋亡比例与卵巢切 cruitment 大约发生于发情周期的 14~ 16 天 片的 H. E. 染色及 TUN EL 检测结果就更能证明 Phillippo et al, 1968 ; Coleman , 1979 。而且 , 这一点。 参 考 文 献 References Coleman , D. A. 1979 Effect of time of unilateral ovariectomy in gilts. J , A ni m , Sci49 Suppl : 136~143. Dalin , A. M. 1987 Ovarian follicular activity during the luteal phase in gilts. JVete. Med. 34 : 592~601. Grant , S. A. , M. G. Hunter 1989 Morphological and biochemical characteristics during ovarian follicular development in the pig. JReprod. Fert86 : 171~183. Irealand , JJ 1987 Control of follicular growth and developmentJReprod. Fertil14 suppl : 39~54. Jolly , P. D. , D. JTisdall , D. A. Heath , S. Lun and K. P. McNatty 1994 Apoptosis in bovine granulosa cells in relation to steroid synthesis , CAMP response to FSH and L H and follicular atresia. Bio. Reprod. 51 : 934~944. Miki , S. , M. Noboru , K. Yoshihiro , M. Akira , I. Yuzuru , O. Hiroko and M. Hajime 1998 Ultrastructural changes in gronulosa cells in porcine antral follicles undergoing atresia indicate apoptosis cell death. 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L IU Zhong2Hua MA Suo2Feng YU E Kui2Zhong L IU Hai2Lan ? ??33 CHEN Qing2Xuan TAN Jing2He ? College of L if e Sciences , Northeast A gricult ural U niversity , Harbi n 150030 , Chi na ? The Instit ute of Developmental Biology , Chi nese Academy of Sciences , Beiji ng 100080 , Chi na ? College of Veteri nary Medici ne and A ni mal Sciences , S handong A gricult ural U niversity , Taian 271018 , S handong , Chi na TUN EL labeling , H. E. staining and other techniques were used to elucidate the pattern of follicular devel2 opment , atresia , changes in follicle number on the ovarian surface , proportions of apoptotic granulosa cells in fol2 licles of different sizes and morphological changes of atretic follicles , as well as changes in serum estradiel and progesterone levels at different stages of the porcine estrous cycle. The results show that the total number of fol2 licles was highest 2618 per ovary at diestrus , and lowest 714/ ovary at estrus. Small follicles with a diame2 ter of ? 3 mm were the most numerous 15/ ovary at diestrus but became least numerous 517/ ovary by the time of estrus. The number of the medium2sized follicles diameter 3~5 mm was highest 815/ ovary at diestrus and lowest 0/ ovary in metestrus. Large follicles diameter ?5 mm were most numerous 714/ o2 vary at proestrus but had disappeared by metestrus. The proportion of apoptotic granulosa cells in small follicles 21103 % on average over the cycle was significantly higher than in large follicles , declining to the lowest level at metestrus. The percentage of apoptotic granulosa cells in medium2sized follicles 1616 % on average was markedly lower at proestrus than at other stages. The apoptotic cell proportion in large follicles 1112 % on aver2 age showed little change over the cycle , but was significantly lower than that in small or medium follicles at the same stage of the cycle. Key words Pig , Follicular atresia , Apoptosis , Ovary , Estrous cycle 3 This work was supported by grants from the 973 Program of Chinese Ministry of Science and Technology No. G200016107 and National Natural Science Foundation of China No. 30070556 33 Corresponding author.