溶剂乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响

溶剂乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响 溶剂乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响 第20卷第3期 2O07年6月 山东科学 sl巾oNGSCIENCE Vo1.20No.3 Jun.2OO7 文章编号:1002-4ff26(2007}03.0010-05 溶剂乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响 王思锋,刘可春,韩利文,王雪,王希敏 (1.山东省科学院生物研究所,山东济南250014;2.山东省科学院药物筛选研发平台,山东济南250014) 摘要:作为一种提取生物活性成分的常用有机溶剂,乙醇是药物筛选中溶解水溶性较差样品的候选助溶剂. 本文研究了不同浓度乙醇对斑马鱼胚胎存活,循环系统发育,血管生成等的影响,为其作为溶剂在斑马鱼模型 抗血管生成药物筛选中的应用提供参考.结果显示,0.01%乙醇不会造成胚胎的死亡和仔鱼循环系统畸形, 0.1%乙醇引起仔鱼心囊水肿,乙醇浓度达到1%时出现胚胎死亡.低于或等于1%乙醇对仔鱼体节间血管生 成无抑制作用.以上结果明,浓度低于或等于0.01%的乙醇不会影响对被筛样品抗血管生成活性和毒性 的评价. 关键词:乙醇;斑马鱼;药物筛选;血管生成 中图分类号:1065.1文献标识码:A TheEffectofEthanolasSolventontheDevelopmentofZebrafishEmbryo WANGSi—feng',LIUKe—chun',HANLi—wen',WANGXue',WANGXi—min' (1.InstituteofBiology,ShandongAcademyofScbences,J/nan250014,China; 2.ResearchandDevelopmentPlatformforDScreening ofShandongAcademyofScbenee,J/nan250014,China) Abstract:Asausualorganicsolventextractingbioactiveconstituent,ethanolisacandidateofhydrotropy agentsdissolvingbadwater-solubihtysamplesindrugscreening.Inthepapertheeffectsofvarious concentrationsofethanolonthesurvivorship,developmentofcirculatorysystemandtheangiogenesisof zebrafishembryoswerestudiedtoprovidereferencefortheapplicationofethanoltoanti— angiogenesisdrug screeningwithzebrafishmode1.Theresultsshowthatdeathofembryosandabnormalityofcirculatory systemoflarvaearenotobservedwhentreatedwith0.01%(V/V)ethanol,however,thepeficardial edemaoflarvaecol'nG~intobeingwith0.1%ethanolandembryodeathoccurswith1%ethanol,andthe angiogenesisofintersegmentalvesselsoflarvaeisnotinhibitedwithbeloworequalto1%ethano1.The aboveresultsindicatethattheevaluationontheactivityofanti— angiogenesisandthetoxicityofscreened samplesisnotaffectedbybeloworequalto0.01%ethano1. Keywords:ethanol;zebrafish;drugscreening;angiogenesis 斑马鱼(Daniorerio)是一种发现于印度和巴基斯坦水域的热带鱼,因体侧有银蓝色 的纵向条纹而得名. 由于具有养殖和繁殖容易,胚胎透明,体外发育而且速度快等生物学特点,斑马鱼 被广泛应用于发育生物学 收稿日期:21X~-o4-20 基金项目:山东省科技攻关项目(2006GG3202038). 作者简介:王思锋(1981一),男,硕士,研究方向为药物筛选. 第3期王思锋,等:溶剂乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响11 和遗传学等研究领域,成为一种新型的模式生物n.近年来,斑马鱼被逐渐用于人类疾病模型的构建及药 物筛选方面的研究.斑马鱼胚胎早期发育的过程中,血管生成的模式比较简单,主要出现在头部和躯干 部体节间,体节间的血管最初由背部的动脉出芽形成于相邻体节之间.因此斑马鱼是一种理想的抗血管 生成药物的筛选模型.筛选药物时,施药方式简单,将待筛样品溶于培养斑马鱼胚胎的水体中,通过扩 散或吸收进入胚胎发挥作用. 然而大规模药物筛选时常常碰到许多水溶性较差的被筛样品,尤其是中草药提取物.在提取中草药活 性成分时,乙醇是一种常用的有机溶剂no.因此乙醇成为药物筛选中溶解水溶性较差的被筛样品时常用 的有机溶剂.目前,尚无关于乙醇在斑马鱼模型抗血管生成药物筛选中的应用方面的研究报道.本文研究 了不同体积分数的梯度浓度乙醇对斑马鱼胚胎的致死,循环系统畸形,血管生成抑制等方面的作用,为乙醇 在斑马鱼模型抗血管生成药物筛选中的应用提供参考资料. 1材料与方法 1.1实验动物 本实验所用斑马鱼为1.G(vEGFR2:GFP)系血管荧光转基因斑马鱼.喂养时,照明14h/黑暗10h交替进 行,雌雄斑马鱼分开喂养,定时喂以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体(Anemianauplii).采卵时,取 健康性成熟的斑马鱼,按雌雄1/1或l/2的比例放人交配缸内,次日6,8时获得受精卵.对受精卵进行消毒 和清洗后,移人斑马鱼胚胎培养用水中,28~CT控光培养n. 1.2试剂及仪器 乙醇(分析纯),天津市广成化学试剂有限公司产品;麻醉剂Tricaine(MS222),Sigma 公司产品.COIC— ZSA302型体视显微镜,XSJ—D型倒置显微镜,COICXSZ—H型荧光显微镜均为重庆光电仪器有限公司产品. 1.3试剂配制 用斑马鱼胚胎培养用水稀释无水乙醇,获得浓度为0.01%,0.1%,1%,10%(v/v)的溶液.Tricaine的配 制及使用参照Westerfield【I】的方法. 1.4乙醇处理胚胎方法 在受精卵发育12h(12hpf)和24h(24hpf)时,在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼胚胎,移人96孔板的 样孔中,每孔一枚.样孔中已预先加入新配好的乙醇溶液,每8个孔为同一浓度溶液,对照为胚胎培养用水, 然后加盖封闭,置于光照培养箱(28~C)内,让胚胎继续发育. 在受精卵发育72h(72hpf)时,于倒置显微镜下观察96孔板样孔中胚胎的存活,循环系统发育状况,并拍 照.此时,存活的胚胎已孵出仔鱼,用麻醉剂Tricaine对仔鱼进行麻醉,荧光显微镜下对体节问血管 (Intersegmentalvessel,V)进行计数并拍照. 上述实验过程重复3次,同一次用同一批受精卵,以尽量减小误差. 1.5数据处理 应用统计分析软件SPSS11.5对数据求均值,以平均值-4-误差(Mean?S.D.)的形式给出,并进行单 因素方差分析(One—wayANOVA)和TurkeyHSD检验,以比较均值之问的差异显着性. 2结果与分析 2.1乙醇对斑马鱼胚胎的致死作用 不同浓度乙醇溶液中斑马鱼胚胎的死亡率见表1.对于12hpf时处理的胚胎,到72hpf时,胚胎培养用水,0. 01%,0.1%乙醇溶液中胚胎死亡率为0.乙醇浓度上升到1%时,出现胚胎死亡,表现为内部凝结,发育停滞或 畸形(图1,A,B),死亡率为12.50%?5.10%,显着高于对照.当乙醇浓度达到10%时,死亡率高达100%. 24hpf时处理的胚胎,结果与12hpf时处理胚胎类似,仅在1%乙醇溶液中死亡率稍低,与对照无显着差异. 山东科学20Or7年 A:死亡的胚胎(×80),示内部凝结;B:死亡的胚胎(×80),示发育畸形;c:72hpf正常仔鱼(×80);D:72hot正常仔鱼(×200),示心囊无异常 E:72hpf循环系统畸形仔鱼(×8o);F:72hpf循环系统畸形仔鱼(Xzoo),示心囊水肿e:眼睛;h:心脏;ps:心囊 图1乙醇对斑马鱼胚胎存活,仔鱼循环系统发育的影响 表1不同浓度乙醇溶液中斑马鱼胚胎的死亡率,孵出仔鱼循环系统畸形率,体节问血管数 注:"12hpf处理"和"24hpf处理"分别指受精后12h处理胚胎和24h处理胚胎.对照代表不含乙醇的胚胎培养用水."*"和"**"分别代表与 对照存在显着(P<O.05)和极显着差异(P<O.01). 2.2乙醇对斑马鱼胚胎发育循环系统致畸作用 不同浓度乙醇溶液中斑马鱼胚胎所孵出仔鱼的循环系统畸形率见表1.在胚胎培养用水和0.01%乙醇 溶液中,12hpf时和24hpf时处理的胚胎到72hpf已孵出仔鱼,并且均建立了基本完整的循环系统,包括心脏, 第3期王思锋,等:溶剂乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响13 背主动脉,体轴静脉,尾静脉,体节间血管等,未出现循环系统障碍.而在0.1%乙醇溶液中的胚胎也已孵出 仔鱼并建立了同样基本完整的循环系统,但出现了循环系统畸形,表现为明显的心囊水肿(图1,C,F).在 1%乙醇溶液中,12hpf时和24hpf时处理的胚胎所孵出仔鱼的循环系统畸形率高达93.75?6.25%和87.50? 7.22%,显着高于对照. 2.3乙醇对斑马鱼胚胎发育血管生成的抑制作用 到72hpf时,胚胎培养用水,O.Ol%,0.1%,1%乙醇溶液中12hpf和24hpf时所处理的胚胎所孵出的仔鱼 背部各体节间长出血管(图2,A,D),数量大约为27,28条,无显着性差异(见表1).可见,浓度低于或等 于1%(wv)的乙醇对斑马鱼胚胎发育过程中血管生成无抑制作用.? A:仔鱼躯干部普通光镜照片(×2oo);B:仔鱼躯干邵芡光照片(×2oo),,下体节间血管; c:尾部普通光镜照片(×2oo);D:仔鱼躯干部荧光照片(×2oo),示体节间血管,isv:体节问血管. 图2斑马鱼72hpf仔鱼体节问血管照片 3讨论 在药物筛选中,针对水溶性较差的被筛样品,选择合适的有机溶剂进行助溶是一个重要的技术环节.在 选择助溶剂时,不但要考虑这种有机溶剂对被筛样品溶解性的高低,更要考虑其对筛选模型毒性的大小.本 实验中,低于或等于0.1%乙醇不会造成斑马鱼胚胎的死亡.当浓度上升到1%时,部分斑马鱼胚胎死亡,上 升到10%时斑马鱼胚胎全部死亡.可见,若仅考虑乙醇对斑马鱼胚胎的致死作用,在药物筛选时可以选用 低于或等于0.1%的乙醇., 在应用斑马鱼模型筛选抗血管生成药物时,选择助溶剂不仅要考虑其对斑马鱼胚胎的致死作用,也要考 虑其对循环系统发育的影响.乙醇对胚胎心血管系统的致畸作用在许多脊椎动物 中都有发现n.钱林溪 等研究发现斑马鱼胚胎循环系统对乙醇暴露非常敏感,随着乙醇浓度的升高,不完整的循环系统等畸形 率也逐渐升高.本实验中已孵出的仔鱼均建立了基本完整的循环系统,出现的循环系统畸形也仅见心囊水 肿,这与本实验中除完全致死的lO%~b其他乙醇浓度(等于或低于1%)较低有关.0.1%乙醇已经引起了心 14山东科学2OO7拄 囊水肿这一循环系统畸形,同样随着乙醇浓度的升高,畸形率显着上升.因此,考虑到乙醇对斑马鱼胚胎循 环系统发育的致畸作用,在药物筛选中作为助溶剂的乙醇浓度应低于或等于0.O1%. 一 些抗肿瘤药物如SU5416,SU6668,TNP470作用于斑马鱼的效果与在哺乳动物中的相近,证实了利用斑 马鱼筛选抗血管生成药物的有效性_8].这些药物作用于斑马鱼的效果主要为抑制其胚胎发育过程中血管 生成,特别是体节间血管的生成.因此助溶剂对斑马鱼胚胎血管生成的抑制作用将影响对被筛样品抑制血 管生成作用的评价.本实验结果显示,低于或等于1%体积分数的乙醇对斑马鱼胚胎发育过程中血管生成 无明显抑制作用,因此不会影响对被筛样品抑制血管生成作用的评价. 斑马鱼胚胎在发育到接近24h时才开始出现体节问血管,到48h时体节问血管已很丰富?J.因此本实 验选择发育到lZhpf和24hpf的斑马鱼胚胎进行不同体积分数乙醇处理实验.在较高浓度(高于或等于 0.1%)的乙醇溶液中,与采用24hpf的胚胎相比,12hpf胚胎的死亡率和循环系统畸形率均较高.在较低浓度 (低于或等于0.O1%)的乙醇溶液中,二者没有差异,未出现胚胎死亡和循环系统畸 形.可见,相比24hpf胚 胎,12hpf胚胎对浓度高于或等于0.1%的乙醇较敏感,对浓度低于或等于0.O1%的 乙醇二者均不敏感.可 见,斑马鱼胚胎对乙醇的敏感度,不仅与其发育时期有关系,而且与接触乙醇的浓 度有关系. 综上所述,我们认为在应用斑马鱼模型进行抗血管生成药物筛选时,助溶剂乙醇的 浓度低于或等于 0.O1%时不会影响对被筛样品药物活性和毒性的评价,可选择12hpf和24hpf胚胎 作为实验材料进行筛选实 验.当被筛样品在低于或等于0.O1%乙醇中溶解度不理想时,可最大限度地将乙醇 的浓度升高到1%,但此 时不能进行被筛样品毒性的评价,仅能进行药物活性评价,实验材料应选择24hpf 胚胎. 参考文献: [1]STREISINGERG,WALKERc,DOWERN,eta1.ProductionofClonesofHomozygous DiploidFish(Brachydaniorerio)[J].Nature, 1981,291:293—296. 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