单增李斯特菌检测方法研究进展

单增李斯特菌检测研究进展 中国实验诊断学2010年11月第14卷第11期 ease-developmentandspreadofmultiply—resistantbacterialpathogens 【JJ.JAMA,1996,15(4):199. [12]王辉,刘颖梅,王清涛,等.北京发现同时产DHA.1质粒AmpC 型及CTX.M型超广谱8一内酰胺酶的肺炎克雷伯菌[J].中华微生 物学和免疫学杂志,2005,25(5):419. [13]王辉,刘颖梅,王清涛,等.北京发现同时产DHA一1质粒AmpC 型及CI~-M型超广谱8.内酰胺酶的肺炎克雷伯菌[J].中华微生 物学和免疫学杂志,2005,25(5):419. [14]AlainP,A-letG,JacobyGA.Plasmid—determinedAmpC—type-laetamase lJj.AntimiembAgentsandChemother,2002,46(1):1. [15]戈梅,罗敏玉,陈代杰.细菌对MIS类和糖肽类抗生素产生耐 药性的作用机制[J].中国新药杂志,2005,14(3):282. [16]MarkiewiczSK.Mechanismofvaneomycinresistanceinmethieillinre- sistantStaphylococcusaureus[J].PolishJMicrobiol,2004,53(4):207. [17]顾兵,童明庆.整合子与细菌耐药[J].临床检验杂志,2005,23 (3):226. [18]糜租煌.细菌耐药的分子机制[J].I床儿科杂志,2O05,23(7):422. 文章编号:1007—4287(2010)11—1869—03 — 1869一 [19]蔡培泉,王春新,糜租煌.铜绿假单胞杆菌氨基糖苷类耐药性及 其修饰酶基因的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2006,26 (4):374. [2o]HxZ.Efflux—mediatedmultipleantibioticresistanceinPseudomonas aemginesa[J].中国抗生素杂志,2000,28(10):577. 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(收稿日期:2009—12—24) 单增李斯特菌检测方法研究进展 黄昭华,孙晓盈,高申,谢风 (1.吉林省中医中药科学院,吉林长春130021;2.吉林大学中日联谊医院,吉林长春 130033) 单核细胞增生性李斯特菌L.monoeytogenes(简 称单增李斯特菌)被认为是引起动物和人类李斯特 菌病的主要致病菌,是一种短小的革兰阳性无芽胞 杆菌,研究发现单增李斯特菌包括致病性,弱致病性 和非致病性3种类型.单增李斯特菌能使人畜致病, 造成猪,鸡等多种畜禽死亡.人感染后则主要表现 为脑膜炎,败血症和单核细胞增多.婴幼儿,怀孕妇 女和免疫耐受病人的感染死亡率可高达20%一 30%.单增李斯特菌广泛存在于自然界中,人们食 用的肉,奶,蛋,水产品,蔬菜以及冷冻食品等均有不 同程度的污染,在美国李斯特菌被列为7种主要的 食源性致死病菌之一,已经被WHO食品安全工作 列为重点检测的食源性病菌之一.因此快速, 准确检测出单增李斯特菌对临床诊断和治疗有重要 意义.目前有以下几种检测方法. 1传统的细菌培养法 食品中李斯特氏菌的传统检验方法是进行前增 菌或选择性增菌,以分离培养得到的可疑菌落做生 *通讯作者 化反应实验,溶血实验,协同溶血实验(CAMP)等免 疫学检测,被确定为李斯特氏菌后进一步进行血清 分型l.该方法中增菌和选择性增菌是不可缺少的 步骤.增菌的方法主要包括:冷增菌法和常温培养 方法.冷增菌法是在4c【=培养30d,有时甚至长达 一 年.常温增菌需培养24h至7d.故传统检测方 法需要7—11d才能分离鉴定出李斯特氏菌,故传 统方法检测周期较长. 2免疫学方法 2.1胶体金免疫层析技术 胶体金免疫层析技术是20世纪90年代发展起 来的将层析法与免疫胶体金相结合的诊断技术,具 有快速,操作简便,与酶联免疫法相似的特异性及灵 敏度的优点,广泛用于样品的检测l_2J.采用免疫胶 体金层析技术,对LM进行检验,可取得良好的 效果.免疫胶体金技术与酶免(EIA)相比有着许多 优越性.首先,它不需要酶联免疫法中所要求的底 物(显色剂),因而可省去一些操作步骤,如洗涤,终 止等,使操作简单化.因此胶体金检测只需10—20 min,而酶免(EIA)需要60min以上;其次,胶体金法 _.'—— 1870'__—— 无污染,不会危害操作者以及污染环境,而这些问 在酶免法中常遇到;此外胶体金技术还具有检测迅 速,灵敏,不需要复杂仪器设备,产品永不褪色等优 点_3j.胶体金免疫层析法可在食物,农产品测定中 作为一个粗筛的快速检测方法. 2.2聚合酶免疫检测方法(assurancepolyclonal enzymeimmunoassay,EIA) 这一方法是将样品增菌液和阳性对照加到酶标 板的微孔内,微孔的内壁上固定有对李斯特氏菌抗 原有高度特异性的抗体.李斯特氏菌抗原在微孔内 形成抗体,抗原复合物.一般操作方法是在样品板 内加入抗李斯特氏菌特异抗体,进孵育,冲洗程序, 然后加入碱性磷酸酶结合剂,使酶与抗原结合,冲洗 后加入底物显色,用405—410nln的光度计读数,计 算临界值.当样品测量值大于临界值时为阳性结 果,可疑阳性结果还需经传统方法检测.EIA方法 需要进行两次前增菌程序,每次增菌培养时间为24 h,后续的检测过程大约需要2—4h,因此比传统检 测方法节省了很多时间.Feldsine等l4J运用EIA 方法检测食品样品和环境中物体表面李斯特氏菌和 李斯特氏菌属.并和USDA/Fsis(U.S.Departmentof Agricuhure/FoodSafetyandInspectionService)传统培 养检测方法进行比较.结果表明,EIA方法与US— DA/FSIS传统培养检测方法的检测结果在统计学 上是一致的. 2.3自动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)分析方 法 此分析系统是依据免疫学酶联免疫反应 (EusA)原理对李斯特氏菌等致病菌进行快速检测 的方法,作为夹心反应,固相容器(SPR)用抗李斯特 氏菌抗体包被,捕获细菌抗原,抗原一抗体复合物可 被标记有碱性磷酸酶的抗细菌第二抗体检测,形成 酶复合物,酶复合物在酶催化下将底物(4一甲基伞 形磷酸酮)分解成具有荧光的产物(4,甲基伞形 酮),该产物由仪器中的光扫描器检测荧光强度(荧 光强度与李斯特氏菌的含量成正比),并由计算机自 动分析结果.由于该仪器检测的假阴性率为零,假 阳性率<5%,因此该方法适合大批量样品的筛选和 快速检测,阴性结果可直接报告;阳性结果可经过纯 培养后,进一步用国标法或全自动生化分析仪进一 步确认,12—24h即可报告结果c6j.有资料显示vI. DAS检测系统的特异性可达96%,灵敏度为 73%.此方法采用计算机自动分析系统,不但简 便而且减少了人为误差,可在3d内报告结果. ChiIlJLabDi啪,November,2010,Vol14,No.11 2.4SPA-ELlSA 姜迪来等[]利用HRP—SPA(辣根过氧化物酶标 记葡萄球菌A蛋白)代替酶标二抗,采用一步法 ELISA检测肉品中的单增李斯特氏菌,并建立了 SPA—ELISA检测肉制品中李斯特氏菌的检测方法. 研究发现,HRP.SPA可完全代替酶标二抗用于对李 斯特氏菌的检测.结果还显示,SPA不能单独与抗 原或抗体良好地结合,而只与抗原抗体免疫复合物 结合良好,对兔血清中的I具有较好的结合能力. 故使得酶标SPA有代替酶标二抗而进行相关研究 的优势.这样省去了制作抗体的麻烦. 2.5免疫磁性分析(IMS) IMS的基本原理是抗原抗体反应.寇运同等_9J 指出用免疫磁珠捕集法快速检测食品中单增李斯特 氏菌的方法,可以将检验周期缩短至1d以内.此方 法并被AOAC(证书号930701)和AFNOR(法国标准 协会)批准采用.IMS.ELISA法是将IMS应用于免 疫分析法.这一方法的优点在于在较低的菌液浓度 时也可通过免疫磁珠的富集作用进行检测,缩短前 增菌时间,并进一步降低了单增李斯特氏菌的检测 限.该方法也存在缺点,当磁珠用单抗包被时无法 识别所有的李斯特氏菌菌株,而用多抗包被时又不 能区分致病性和非致病性李斯特氏菌,因此,免疫磁 性分析缺乏种间的特异性,不能消除交叉反应,与其 他杂菌可能发生非特异性结合,仍需用溶血实验等 生化实验进行进一步的验证_1. 3分子生物学检测方法 随着核酸探针杂交技术的应用,使对单核细胞 增生性李斯特氏菌的检测进入了分子水平. 3.1探针检测技术 这一技术是最早应用于李斯特氏菌检测的分子 生物学技术.早在1988年,Atin等_】"就克隆出李斯 特氏菌口溶血素基因的一个500bpDNA片断并测 序,以此序列合成4种寡核苷酸探针,以32P标记该 探针,经斑点杂交实验证实,该探针只与李斯特氏菌 反应,与其他种的李斯特氏菌和属外的细菌均呈阴 性,表现出很好的特异性.但探针杂交无法分辨死 菌和活菌,尽管通过增菌可使死菌比例减少,相对地 减少假阳性,但并不能完全杜绝假阳性结果.随着 探针技术的逐渐成熟,人们开始关注将多个DNA特 异性探针固定到芯片上,制成基因芯片.基因芯片 的特点是可同时检测多种菌,可以减少实验次数,并 且检测所需的引物较少【12J. 3.2聚合酶链式反应(polymer-d~echainreaction. 史国塞殓堂2010年l1月第14卷第11 P()检测技术 PCR的发展已经相当成熟,广泛应用于李斯特 氏菌的检测.PCR扩增特异性引物一种是依据李斯 特氏菌的特异毒力基因序列而设计,一种是依据李 斯特氏菌基因组中特异序列而设计.常用的靶序列 为hlyA,iap,inl,Dth18等毒力基因.利用PCR方法 来检测李斯特氏菌的优点是方法的特异性好,不足 之处是灵敏度较低;将样品培养物经化学抽提后再 进行扩增,提高了样品的检出率_13_;并且可以检测 到传统增菌方法不能检出的"活的非可培养"的李斯 特氏菌.PCR技术还可对李斯特氏菌进行定量检 测.例如Nogva等运用5.核酸酶PCR对单增李 斯特氏菌定量;Choia等【15J运用cPCR对李斯特氏菌 进行定量;Long等_lJ以l1ly为靶基因,采用PCR. ELISA联合检测技术. 4PCR.ELISA联合检测技术 1999年SCHEU等以单增李斯特菌mpl基因为 基础,建立了PCRELISA快速检测方法,需时5—6 h,特异性较高,但未将该方法应用于食品样品的检 测l173METZGER—BODDIEN等应用沙门菌特异的 PCR.ELISA试剂盒对沙门菌人工污染的食物样品进 行检测,结果与标准的分离培养方法符合率高达 98%[18J.PCR—ELISA技术并非PCR与ELISA的简 单结合,有其自身的技术要点_1.首先捕获探针必 须和PCR扩增产物内部序列互补,捕获探针序列的 长度最好在17—40nt之间.PCR—ELISA检测优于 PCR检测的特点:(1)快速:获得PCR产物后,ELISA 检测约需6h,而琼脂糖凝胶电泳检测约需2h.由 于PCR—ELISA在增菌12h与PCR在增菌20h的检 测敏感性相当,检测时问仍然缩短了4h.(2)安全: ELISA检测所用试剂对人体较安全,避免了琼脂糖 凝胶电泳的EB污染.(3)可大量应用:每块微孔板 有96个检测孑L,而PCR检测受电泳槽,加样槽的大 小等限制,检样量相对较小目前,对LM快速检测方 法的研究,绝大部分尚停留在实验室阶段,很大程度 局限于ELISA法和PCR法,而免疫胶体金层析法检 测LM具有快速,便捷的优点.(4)可广泛应用于质 检,卫生,边检,医院,也可用于家庭进行简易检测. 其良好的特异性,较高的灵敏度,可靠的重现性和稳 定性,为今后的食品中LM检测提供了一个更为理 想的快速检测方法. 参考文献: 『1]余淑冰,梁景涛,周强忠,等.单核细胞增生李斯特菌污染调查及 一 1871一 快速检验方法的比较[J].中华预防医学杂志,1998,32(4):240. [2]宋农,李君文,王新为,等.胶体金探针制备及滴金免疫法检测 产肠毒素金葡菌[J].中国公共卫生,2002,18(9):1143. 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