百会穴长留针疗法对智力偏低大鼠学习记忆能力影响的实验研究

百会穴长留针疗法对智力偏低大鼠学习记忆能力影响的实验研究 百会穴长留针疗法 对智力偏低大鼠学习记忆能力影响的实验研究 陈华德， 李勇 浙江中医药大学，杭州 310053 【摘要】 目的:观察百会穴长留针疗法对智力偏低大鼠学习记忆能力的影响, 为临床上治 疗智力相对偏低人群筛选出一种有效、方便的治疗，并为百会穴长留针疗法治疗智力相 对偏低人群提供有效的实验依据。方法:将170只SD大鼠通过Morris水迷宫进行筛选、分 组，设立低智对照组、高智对照组、百会穴长留针组和西药对照组四个组。每10天用Morris 水迷宫测试一次，观察3次。实验结束后用比色法测海马组织中ChAT、AchE活力。结果: ?在Morris水迷宫实验中，观察发现治疗30天后，与低智对照组比较，百会穴长留针组和 西药对照组能显著缩短定位航行试验的潜伏期(P<0.01);?在空间探索试验中，与低智对照 组比较，百会穴长留针组和西药对照组能提高跨越原平台位置的次数(P<0.05);?与低智对 照组相比，百会长留针组、西药对照组能升高脑组织ChAT活力，其差异具有统计学意义 (P<0.01);?与低智对照组相比，百会穴长留针与西药对照组均能抑制脑组织中AchE活力 (P<0.01，P<0.05)。结论:百会穴长留针可以改善大鼠学习记忆能力，其机制可能是通过 提高ChAT的活力，增加Ach含量; 降低AchE的活性，减少Ach消耗,进而改善大鼠学习记 忆能力。 【关键词】 百会穴;针刺;长留针法;学习记忆能力;大鼠 Effects of Long-Time-Retaining Needle at Baihui on the Rats with Relative Low Intelligence of the Learning and Memory HEN Hua-de, LI Yong( Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310053, China) C 【ABSTRACT】Objective Observed the effects of long-time-retaining needle therapy at Baihui on the rats with relative low intelligence of learning and memory. Methods 170 Sprague-Dawley (SD) rats were screened through the Morris water maze, set up four group: low intellectual control group, high intellectual control group, long-time-retaining needle at Baihui and comparison group. Morris water maze test was observed 3 times with every 10 days. After the experiment, measured by colorimetry acetylcholine transferase (ChAT), and acetylcholinesterase(AchE) activity. Results ?In the Morris water maze test, Compared the low intellectual control group after treatment for 30 days, the long-time-retaining needle at Baihui group and comparison group, can significantly shorten the latency of place navigation test (P<0.01);?Experiments in space exploration, Compared the low intellectual control group , the long-time-retaining needle at Baihui group and comparison group can increase the number of times across the former platform location (P<0.05);?Compared the low intellectual control group , the long-time-retaining needle at Baihui group and comparison group, ChAT activity in brain tissue can be increased, the difference was statistically significant (P<0.01);?Compared the low intellectual control group , the long-time-retaining needle at Baihui group and comparison group can decrease the AchE activity in brain tissue (P<0.01, P<0.05).Conclusion the long-time-retaining needle at Baihui can improve learning and memory in rats, which may be by increasing the vitality of ChAT and Ach content; reducing the activity of AchE and Ach consumption, improving learning and memory in rats. 【KEY WORDS】Acupuncture; Baihui; Learning and memory; Long-time-retaining needle ;Rats 改善学习记忆功能、防治学习记忆障碍性疾病，是发掘人类智力潜能的重要课。百 会穴位于巅顶，为督脉经穴，督脉通于脑，临床和实验研究明百会穴是调节脑功能的要穴。 本研究主要将一定量的SD大鼠通过Morris水迷宫进行区别其认知功能的高下，筛选出相对 智力较低的与智力较高的大鼠，然后采用百会穴长留针和灌服西药来比较其治疗效果的差 异，为临床改善学习记忆能力提出新的方法与思路。 1. 材料与方法 1.1实验动物 选用健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠170只，体重180-200g，由浙江中医药大学实验 动物中心提供。顺应性喂养三天，无不良反应，即开始实验。 1.2主要试剂与设备 多聚甲醛:天津市福晨化学试剂厂;无水乙醇:浙江三鹰化学试剂有限公司;T-ChE检 测试剂盒:南京建成生物工程研究所;ChAT检测试剂盒:南京建成生物工程研究所;考马 斯亮蓝检测试剂盒:南京建成生物工程研究所;蛋白质定量试剂盒(Bradford法):普利莱 基因技术有限公司;TGL-16G型高速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂生产;; TMSmartSpecPlus紫外分光光度计:美国BIO-RAD公司;Morris水迷宫实验系统:?动物行 为实验软件-Morris实验系统:北京现代太极电子有限公司?视频捕捉卡:图码公司， sDK-2000?水池:北京硕林苑科技有限公司;DKB-454A型电热恒温水槽:上海森信实验 仪器有限公司;752型紫外可见分光光度计:上海菁华科技仪器有限公司。 1.3动物筛选 对大鼠顺应性喂养3天，然后把大鼠置于Morris水迷宫学习训练3天，第四天开始记录大鼠游泳成绩。将每只大鼠依次从第一、二、三、四象限的中点放入水池中。电脑操作者同步进入水迷宫系统，记录大鼠从入水到寻找并爬上站台的时间(定位航行实验)，并结束本次试验然后继续下一次试验。将170只大鼠全部进行完定位航行实验后，撤去站台，把170只大鼠按顺序从第三象限池壁中点头贴壁放入水中，让大鼠在水池中游1min，系统将自动记录大鼠在水池的运动轨迹(空间探索实验)。这样每只大鼠共记录5次实验成绩，其中前4次为与一、二、三、四象限相对应的定位航行实验成绩，第5次为空间探索成绩。将定位航行实验中平均逃避潜伏期 <1min， 空间探索实验中1min内跨越原平台相应位置的次数多的，筛选为智力较高组;反之，则为智力较低组。 1.4分组及处理 将筛选出智力较低组大鼠采用随机数字表分为低智对照组、百会长留针组、西药对照组，每组8只。从智力较高组中抽取8只作为高智对照组。各组处理方法如下:百会长留针组:给予百会穴长留针治疗，每次留针24小时，隔日治疗1次，共治疗30天。将百会穴长留针组大鼠头顶部毛剃除，参照《实验针灸学》中大鼠穴位定位方法，取督脉上的“百会”穴(顶骨正中处)，用0.25×25mm针灸针沿头顶正中线由后向前平刺20mm左右。百会穴长 2留针治疗组在针刺后，剪短部分针柄，取一1.5×2cm的白色胶布贴于穴位上方，防止脱落，留针24h后除去胶布，消毒针口;其余两组不予治疗，但均以等大胶布贴于同一部位。西药 -1组:给予吡拉西坦(1.6g.kg)混悬液灌胃给药，1天1次，连续给药30天。其余两组不做处理。 1.5指标检测 1.5.1 Morris水迷宫实验(包括定位航行实验和空间探索实验) 每10天进行一次水迷宫实验，30天共进行3次。水迷宫水深31 cm，水温23士2?。 1.5.2脑组织乙酰胆碱酯酶(AchE)活性、乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性的测定 大鼠经10,水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉。断头剥取脑组织，在冰盘上取出完整海马，置于冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干，电子天平称重，按1?10(每克组织中加10ml冷生理盐水)加生理盐水，眼科剪剪碎后，用超声粉碎机制成10%组织匀浆(匀浆过程始终处于冰水中)，低温低速离心机3 000r/min离心15min，将离心好的匀浆取上清液，弃沉淀。采用比色法测定组织中蛋白含量，应用分光光度法测定组织中AchE含量，用 考马斯亮兰法测定脑组织中的蛋白含量。脑组织AchE活力(U/mg prot)=(测定管吸光度,空白管吸光度)/(照管吸光度一空白管吸光度)×标准品浓度?蛋白含量。ChAT活性的测定大致同上。 1.6统计学处理 采用SPSS17.0软件做统计处理。计量资料用均数?标准差(?S)表示，数据统计用X 单因素方差分析，组间两两比较。以P<0.05为差异显著的标准。 2. 结果 2.1对Morris水迷宫实验的影响 2.1.1定位航行实验 定位航行实验用来检测大鼠获取经验(学习)的能力，记录大鼠在1min内寻找平台的时间(逃避潜伏期，s)。 表1 各组治疗前、治疗第10天、20天、30天平均逃避潜伏期(士s，s) X 组别 例数 治疗前 治疗第10天 治疗第20天 治疗第30天 ?低智对照组 8 45.19士11.92 36.00士11.82 30.56士13.35 49.06士7.65 ******高智对照组 8 34.22士8.24 25.59士6.86 20.03士6.79 13.34士1.85 ?****??百会长留针组 8 40.75士8.61 14.28士4.34 18.63士4.6143.44士9.01 ?******??西药对照组 8 30.03士7.22 23.44士7.42 14.41士4.75 44.84士8.92 注:?与高智对照组比较，P<0.05;**与低智对照组比较，P<0.01; ?与治疗第10天比较，P<0.01，?与治疗第20天比较，P<0.05。 如表1所示，治疗前，高智对照组的平均逃避潜伏期短于百会长留针组、西药对照组和 0.05)。而百会长留针组与西药对照组、低智对照组三组低智对照组，具有显著性差异(P， 间平均逃避潜伏期基本一致，差异无显著性意义;治疗第10天，西药对照组平均逃避潜伏期短于百会长留针组和低智对照组，差异有显著性意义(与百会长留针组比P，0.01，与低智对照组比P，0.05)，提示西药对照组比百会长留针组提早发挥治疗作用;治疗第20天和第30天后，百会长留针组、西药对照组的平均逃避潜伏期短于低智对照组，差异有非常显著性意义(P，0.01)，而百会长留针组和西药对照组比较，无显著性差异(P，0.05)，说明此时百会长留针组开始发挥治疗作用，且百会长留针组和西药对照组的治疗效果相当。百会长留针组在治疗第20天、第30天平均逃避潜伏期短于治疗第10天，差异有显著性意义(P，0.01); 西药对照组在治疗第30天平均逃避潜伏期短于治疗第10天和第20天，差异有显著性意义(P，0.01，P，0.05)，说明在百会穴长留针和西药的治疗中效果与其疗程有关。提示百会穴长留针和西药可以缩短智力偏低大鼠的平均逃避潜伏期，改善智力偏低大鼠的空间学习能力。 2.1.2空间探索实验 空间探索实验用来检测大鼠保存经验(记忆)的能力，记录大鼠在1min内寻找原站台位置的次数。 表2 各组治疗前、治疗第10天、20天、30天寻求原站台位置的次数(士s，次) X组别 例数 治疗前 治疗第10天 治疗第20天 治疗第30天 ?低智对照组 8 0.88士0.83 0.88士0.99 0.75士0.71 2.00士0.71 ***高智对照组 8 1.88士0.83 2.13士1.13 2.25士1.75 4.00士1.93 ??****百会长留针组 8 0.88士0.99 1.50士0.76 2.75士1.16 4.25士1.75 ??*****西药对照组 8 0.88士0.99 2.13士0.99 2.50士1.07 4.63士1.19 注:?与高智对照组比较，P<0.05;*与低智对照组比较，P<0.05; **与低智对照组比较，P<0.01;?与治疗第10天比，P<0.01。 如表2所示，治疗前，高智对照组寻求原站台位置的次数高于其他三组，有显著性差异(P，0.05);治疗第20天，西药对照组寻求原站台位置的次数多于低智对照组，差异有显著性意义(P，0.05)，说明西药对照组比百会长留针组提早发挥治疗作用;治疗第30天，百会长留针组和西药对照组寻求原站台位置的次数多于低智对照组，差异有显著性意义(P，0.01)，说明此时百会长留针组开始发挥治疗作用，且百会长留针组和西药对照组的治疗作用相当。百会长留针组在治疗第30天与治疗第10天比较，差异有显著性意义(P，0.01);西药对照组在治疗第30天与治疗第10天比较，差异有显著性意义(P，0.05)，说明在百会穴长留针和西药的治疗中效果与其疗程有关。提示百会穴长留针和西药可以改善智力偏低大鼠的空间记忆能力，且疗效相当。 2.2百会穴长留针对脑组织ChAT活力的影响(士s) X 表3 各组脑组织ChAT活力结果(士s) X 组别 例数 ChAT活力(U/g) 8 低智对照组 91.211士4.321 **8 高智对照组 98.573士5.080 **???8 百会长留针组 103.754士2.822 **??8 西药对照组 116.025士3.908 注:**与低智对照组比较，P<0.01;??与高智对照组比较，P<0.01; ?与西药对照组比较，P<0.01。 如表3所示，与低智对照组比较，百会长留针组、西药对照组和高智对照组三组脑组织中的ChAT活力都较其高，具有显著性差异(P，0.01)，同时，百会长留针组和西药对照组脑组织中ChAT活力高于高智对照组，差异有显著性意义(P，0.01)，提示百会长留针和西药均能提高ChAT活力;百会长留针组脑组织中ChAT活力低于西药对照组，差异有显著性意义(P，0.05)。 2.3百会穴长留针对脑组织AchE活力的影响(士s) X 表4 各组脑组织AchE活力结果(士s) X 组别 例数 AchE活力(U/?prot) 8 低智对照组 0.440士0.054 **8 高智对照组 0.397士0.052 **8 百会长留针组 0.369士0.032 **??8 西药对照组 0.340士0.034 注:**与低智对照组比较，P<0.01;??与高智对照组比较，P<0.01。 如表4所示，与低智对照组比较，其他三组大鼠脑组织中AchE活力均低于低智对照组(P，0.01或P，0.05)，而且百会长留针组、西药对照组大鼠脑组织中AchE活力更低，说明百会穴长留针与西药均能抑制脑组织中AchE活力;与高智对照组比较，西药对照组脑组织中AchE活力低于高智对照组(P，0.01)，而百会长留针组(P，0.05)无明显差异性，说明短期内西药对于抑制脑组织中AchE活力的作用比较明显。 3讨论 现代临床研究表明，百会穴是调节脑功能的一个要穴。临床机理研究方面，艾灸百会穴 可使大脑中动脉血流速度明显加快,血管搏动指数增加,脑血流量增加, 明显改善脑部血液循 [3]环，供给脑组织充足的氧和葡萄糖，维持脑的正常功能。针刺百会可以增强大脑有关运动 区域的代谢。现代实验研究表明。艾灸百会穴可以提高Ach的含量及ChAT的活性有所,而 [4]降低AchE活性。马志新、赵立刚亦发现，针刺老年性痴呆大鼠的百会、大椎穴，可以清 [5]除自由基，促进细胞代谢，降低AchE含量，改善大脑的学习记忆。以上研究表明，百会 穴具有增强脑供血、改善微循环、修复神经、减少炎性递质、提高认知能力的作用，是治疗 脑病的一个要穴。 从本实验的实验结果来看:治疗前，与高智组相比，各组的平均逃避潜伏期均长，寻求 原平台次数均少，说明其他三组的空间学习记忆能力均比智力较高组差。治疗结束后，从 ChAT、AchE活力上看，与低智对照组相比，百会长留针组、西药对照组都有显著性差异性 (P<0.01)，说明百会穴长留针和灌服西药都能改善大鼠学习记忆能力。而百会长留针组与 西药对照组统计学上无明显差异(P>0.05)。 参考文献 [1] MotrisRG,Garrud P，RawlinsJN，etal. Place navigation impaired in rats with Hippocampal lesions[J].Nature，1982，297(5868):681-683 [2] Winkler J，Suhr ST.Gage FH，et al.Essential role of neocortical acetyl-choline in spatial memory[J].Nature，I995，375:484-487. [3] 赵宁侠,郭瑞林,任秦有,等. 艾灸健康人百会穴对大脑中动脉血流速度的影响[J].中国针 灸，2003，23(11):679-680. Zhao N X, Guo R L, Ren Q Y, et al. Effect of moxibustion of GV 20 point on blood flow velocity of the middle cerebral artery in healthy people[J].Zhongguo Zhen Jiu, 2003, 23(11): 679-680. [4] DU Yan-jun,TIAN Qing,KANG Yu-ping. Effects of Moxibustion on Cerebral Acetylcholine Content and Choline Acetyl Transferase Activity in the Aged Rats[J]. WorldJ.Acu-moxi. 2007,17, (1):37-40. [5] 马志新，赵立刚.针刺百会、大椎对老年性痴呆大鼠脑内AChE的影响[J].中国医药导报， 2009，6(17):77. Ma Z X, Zhao L G. The effect of acupuncture on Baihui and Dazhui on AchE level in brain of the aged dementia rats[J]. China Medical Herald, 2009, 6(17):77.